マイクロ流体ベースのマイクロインジェストロードシステム(薬物注入と電気生理学の複合)

要約

出典: Vanegas, M. I., et al.薬物注入と電気生理学を組み合わせたマイクロインジェクトロードシステムJ. Vis. 経験。(2019年)

このビデオでは、キャピラリーチューブを介して薬物溶液を送達する微小電極ベースのマイクロ流体デバイスを示し、油ベースのマーカー溶液を使用して正確な体積追跡を行い、神経記録と薬物注入を同時に可能にします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.刺激と記録のためのマイクロインジェクタードの構造(図1a)

1. カニューレとプローブ(この例ではナノセンサー)の長さを測定します。プローブは、カニューレの先端から突き出る長さだけカニューレよりも長くする必要があります (プローブの設計によって異なります)、さらに約 2 cm です。
2. 拡大鏡または顕微鏡(~10倍倍)の下で、プローブをカニューレにロードします。可能であれば、プローブの先端を保護するためにバックローディングが望ましいです。
   注:手動で実行されるこのステップは困難です。実際の実験プローブで試す前に、虫眼鏡の下で微小電極を使用して練習することをお勧めします。
3. カニューレ(プローブを含む)を上部フェルール、T字部、および下部フェルールに通します。
   プロ
   1. ーブがアタッチメントのない単線の場合は、カニューレにバックロードし、アセンブリを下部フェルールからT字接合に挿入します。カニューレの上部 (平端側) は、T 字部の中央、上部フェルールではなく下部内に配置する必要があります。実験用プローブまたはバイオセンサーは、フェルールの上部の上に突き出ている必要があります。
      注:カスタムメイドのフェルールは、マイクロドリルビットを使用してフェルールプラグに穴を開けることによって作成することもでき、穴のサイズはカニューレをT接合部に締めるために必要な直径に基づいています。
4. フェルールレンチを使用して、Tジャンクションの上部と下部のフェルールを締めます。締めすぎないでください。上部フェルール内の電極サポートを強化するために、小さなチューブを追加することができます。
5. プローブの仕様に従って、各プローブ端子(信号、グランドなど)にはんだ付け金ピン
。
6. プローブとカニューレの相対位置を調整します。拡大してプローブがカニューレから突き出ている距離を測定し、上端から手動で調整します(プローブはフェルール内で自由にスライドできます)。
7. 金ピンと上部フェルールの間にエポキシ接着剤を追加して、プローブをフェルールに取り付けます。
8. 上部のフェルールを緩めて、カニューレ内のプローブを格納します。拡大してプローブがカニューレ内に完全に入っていることを目視で確認します。
9. インジェクトロードをマイクロドライブに取り付けます。

2.薬物注入用のマイクロインジェクトロードの構造(図1b)

1. フェルールを使用して、カニューレの「面取りされていない」または平らな端をT接合の底に取り付けます。フェルールレンチを使用してフェルールを締めます。
毛
2. 細管チューブの小片(~1.5 cm)を標準フェルールに通して、T字接合の上部に取り付けます。フェルールレンチで締めます。
3. キャピラリーチューブ、T接合部、カニューレ、および対応するフェルールを通して微小電極をバックロードします。
4. 電極の後端が毛細管の背面から1cm未満突き出ており、電極の先端が底面の希望の距離でカニューレから突き出ていることを確認してください。電極位置はトップエンドから手動で調整できます。
5. 微小電極端子に金ピンをはんだ付けします。
6. 金ピンと上部フェルールの間にエポキシ接着剤を追加して、微小電極をフェルールに取り付けます。
7. 上部のフェルールを緩めて、カニューレ内のプローブを格納します。微小電極がカニューレに完全に引っ込められていることを目視で確認します。

3. マイクロ流体回路の構築(図2)

1. ブレッドボードを安定した面に置きます。2つの三方弁をブレッドボードの最長辺と平行に、約6インチ配置します。1 つのポート (常に開いているポート) が向かい合っています。ネジを使用してバルブをブレッドボードに固定します。
2. バルブの横に定規を置きます(毛細管内の流体の動きを測定および追跡するため)。
3. 1:1の低粘度オイルと食品着色料(マーカー)の混合物を気密シリンジに入れ、マーカーポンプに入れます。キャピラリーチューブを1本切断し、標準のフェルールとルアーロックコネクタを使用して、シリンジを入力バルブのポートの1つに接続します。これが「マーカー線」です。
4. 「定規線」用の毛細管チューブの短い部分を切断します。標準フェルールを使用して、バルブの対向ポートに締め付けます。
5. 2つの長い毛細管チューブを切断して、出力バルブをマイクロインジェクトロードに接続し、ドラッグポンプを入力バルブに接続します(標準フェルールを使用)。
   注:これら2本の線の長さは実験セットアップによって異なり、1本は輸液装置から動物に到達するのに十分な長さで、もう1本は薬物ポンプから入力バルブまで到達するのに十分な長さでなければなりません。劈開石を使用して毛細管を切断します。

4.マイクロインジェクトロードのマイクロドライブへの取り付け(図3)

1. 取り付ける前に、微小電極/実験用プローブがカニューレに引っ込められていることを確認してください。
   注:ガイドチューブはマイクロドライブ内の位置にある必要があります。
2. マイクロインジェクトロードに特注のアダプターを取り付けます。
3. マイクロインジェクトロードをガイドチューブに通し、ネジを使用してアダプターに固定します。
4. マイクロインジェクトロードがガイドチューブから突き出ているマイクロドライブの位置(深さ)を測定し、~1 cm引っ込めて挿入の準備
をします。
5. マイクロインフュージョン実験では、微小電極の未使用のT接合口部に「ブレインライン」を接続します。標準のフェルールを使用し、フェルールレンチで締めます。

5. マイクロ流体システムのフラッシングと準備

1. マイクロインジェクトロードを備えたマイクロドライブを廃ビーカーの上に置きます。
2. クロルヘキシジン(例:ノルバサン、20 g / Lで溶解)を1 mL気密シリンジにロードし、ドラッグポンプに入れます。流体がドラッグポンプからバルブを通ってバルブラインに行き、「ブレインライン」から出るようにバルブの流れ方向を回します。
3. 低流量(50〜200 μL / min)を使用して、回路をクロルヘキシジンで最低10分間洗い流します。手順5.2〜5.3を滅菌生理食塩水で繰り返し、次に空気で繰り返します。
   注:この段階で漏れがないか確認することが重要です。接合部に糸くずの出ないワイプをそっと塗布すると、フェルールから漏れている液体が見えなくなります。
4. 500 μLの気密シリンジに薬剤を装填し、空気を圧縮してから、薬剤ポンプに入れます。マイクロインジェクトロードから数滴が流れるまで、50 μL/minで流します。
5. ガイドチューブをクロルヘキシジン(20 g / Lで溶解)に15分間浸します。
6. 出力バルブの方向を「フラッシングライン」に向けます。定規のラインに色と油の明確なエッジが観察されるまでマーカーポンプを進めます。2つの水溶性物質が混ざり合って、それらの間の鋭いエッジを失わないように、薬剤と色の間に常に油があることを確認してください。この油/染料ラインの開始位置を(テープまたはマーカーで)マークします。
7. 出力バルブの方向をブレインラインに向けます。

6. 記録または注入実験の実施

注

: 動物の取り扱い手順は、ラボや実験によって異なります。次の手順は、硬膜を露出させるために必要な外科的セットアップと準備の後に実行されます。実験後、必要なすべての手順後のステップは、施設で承認されたプロトコルに従って実行する必要があります。

1. マイクロドライブを記録チャンバーに取り付けます。ガイドチューブを下げて硬膜を貫通します。
   注: 皮質の損傷を避けるために、ガイドチューブは硬膜より遠くまで貫通しないでください。
2. マイクロインジェストロードを脳内の記録/注射部位から約2mm上まで下げます。
3. 上部のフェルール(突出した微小電極/バイオセンサー)を締め、金のピンを記録システムに接続します。マイクロインジェクトロードをターゲット部位に進め続けます。
   注:微小電極がカニューレを超えて伸びる距離を計算に含めることを忘れないでください。
4. 注入実験では、手動マイクロシリンジポンプを使用して、オイルカラムを3分ごとに1cm(~60 nL /分)移動させます。希望の量が注入されたら、出力バルブをフラッシングラインに切り替えます。
   注:注入される量は、モデル種と対象となる脳領域によって異なります。流量が速いと神経組織が損傷する可能性があります。
5. 実験が完了したら、マイクロインジェクトロードをガイドチューブ内に引っ込めます(プローブは突き出たままにします)。次に、フラッシュ用のマイクロドライブを取り外します。マイクロ流体システムをフラッシュして、再利用の準備をします。手記： 私たちの経験では、マイクロインジェクトロードは、適切な注意を払えば、数回使用できます。電気生理学的記録の品質は、注射の能力よりも速く低下します。

結果

図1:マイクロインジェクトロードの段階的な製造。)マイクロ流体システムから独立して使用するための構成。カニューレとプローブは、プローブの先端が希望の長さ(例:150 μm)に突き出ていることを確認するために測定されます。プローブはカニューレに前面にロードされます。カニューレは T 字接合部を通過し、底面に取り付けられ、平らな端は T 字接合部の中央にあります。プローブのバックエンドは、上部フェルールを通って続きます。マイクロインジェクションロード...

材料

https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3ポート手動バルブLabSmith		3ポートセレクターバルブ(MV201-C360)	https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26
カニューレ	Vita Needle Company	304 ステンレス鋼チューブ、外径 228μm、内径 165μm	https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf
劈開石	Molex	劈裂石 1" x 1" (部品番号 1068680064)	毛細管を切断する方法に従うことを強くお勧めします: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf
クロルヘキシジンジアセテート	ウォルマート	ノルバサン溶液消毒剤 (AAP311)	マイクロ流体回路のフラッシングに使用され、20 g/L で溶解
カスタムアダプター	プロバイダー	-	マイクロインジェクタードを油圧マイクロドライブに接続するためのカスタム機械加工アダプター
ドライバー		ブレッドボードネジを取り付けるためのLabSmith T7 TORXドライバー(LS-TORXドライバー)	https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25
ポキシ接着剤	LabSmith	およびプラスチック接着用の2液性高強度エポキシ接着剤(LS-EPOXY)	https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24
ルール	LabSmith	ワンピース フィッティング (C360-100)、外径 360μm キャピラリー	用サイズのスルーホールhttps://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24
フェルールプラグ	LabSmith	ワンピースプラグ (C360-101)任意の -C360 ポート	で使用https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24
ルール レンチ	LabSmith	1/8 インチ六角レンチ (LS-HEX 1/8 インチ六角レンチ)	https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24
気密シリンジ	ハミルトン社	500μL 気密シリンジ モデル 1750 (81220) および 1mL 気密シリンジ モデル 1001 (81320)	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top
ゴールドピン	Aim-Cambridge	オス金メッキ圧着コネクタピン (40-9856M)	https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html
糸くずの出ないワイプ	キンバリー クラーク	キムテック サイエンス キムワイプ デリケート タスク	糸くずの出ないワイプ、システムの漏れを特定するために使用されます
液体食品着色料	マコーミック&カンパニー	水性黒色液体食品着色料(52100581873)	https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color
低粘度オイル	クリアコプロダクツ株式会社	25°Cで粘度1cStの純粋なシリコーン流体オクタメチルトリシロキサン(PSF-1cSt)	http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html
アーロックコネクタ	LabSmith	アーロックアダプター(C360-300)、ルアーロックシリンジを360μmキャピラリーチューブ	に接続するためのメスフィッティングhttps://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24
マイクロドリルビット	Grainger	マイクロドリルビット、0.23mm (414H85)	https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits
微小電極	FHC	金属微小電極、エポキシ絶縁体	付きタングステンhttps://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes
オイル油圧マイクロマニピュレーター	Narishige Group	ガイドチューブ付きオイル油圧マイクロマニピュレーター (MO-96)	http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html
ポリマイクロキャピラリーチューブ	モレックス	ポリマイクロフレキシブル溶融シリカキャピラリーチューブ(TSP150375)、外径375μm、内径150μm	https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf
プログラマブルシリンジポンプ	ハーバード装置	標準注入/引き出しポンプ、プログラマブル(70-2213)	https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html
ルーラー	エンパイア	ステンレス鋼6インチ硬い定規(27303)	http://www.empirelevel.com/rulers.php
セット	LabSmith	取り付けネジセット(LS-SCREWS .25)、バルブをブレッドボードに取り付けるためのねじ成形ネジ(2-28 x 1/4インチ)	https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24
標準ブレッドボードLabSmith		4 "x 6"プラットフォーム(LS600)、流体回路を取り付けるための0.25インチの穴間隔<
	バクスター	0.9% 塩化ナトリウム滅菌滅菌	脈内注入
滅菌シリンジフィルター	ミリポア シグマ	マ™ Millex-GP™ PES メンブレン付き滅菌シリンジフィルター (SLGPM33RS)	https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs
Stoelting 手動マイクロシリンジ ポンプ	Stoelting Company	手動輸液/引き抜きポンプ (51222)	https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html
T ジャンクション	LabSmith	外径360μmのキャピラリーチューブで使用するための、流れを結合するための相互接続ティー(C360-203)

マニュアル カスタム エ金属 毛細管接続用フェフェ ルル ネジバルブa href='https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24'>https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 滅菌生理食塩水(塩化ナトリウム)0.9%。静ミリポアシグ