内頸動脈への注入によるマウス脳への標的物質送達

要約

出典: Leda, A. R., et al.内頸動脈を経由する中枢神経系への標的物質送達のためのマウス顕微手術注入技術J. Vis. 経験。(2017年)

このビデオでは、内頸動脈 (ICA) を介して脳への試験物質の標的注入を促進するように設計された顕微手術手順を示します。この手順には、血流を一時的に制限し、制御された送達を確保するための正確な縫合と血管操作が含まれます。毛細血管が外頸動脈 (ECA) に挿入され、分岐部に向かって前進します。注入すると、この物質は体循環を迂回し、血液脳関門を通過し、脳実質への標的送達を達成します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.手術用マウスの準備

1. 実験室麻酔システムを使用して、酸素と混合したイソフルランでマウスを麻酔します。イソフルランは、市販機で4〜5%、酸素流量を2 L / minに設定して使用します(材料表を参照)。実体顕微鏡下で動物を手術面に移し、ノーズコーンを使用して麻酔を維持します(イソフルラン設定1.5〜2.5を使用し、酸素流量を2 L / minで使用します)。
   1. マウスの呼吸数があえぎ声を出さずに約1〜2呼吸/秒であることを確認してください。さらに、動物がひげ刺激反応やペダル反射(つま先のつま先を挟む)を示さないようにしてください。手術中の呼吸数と努力を少なくとも 5 分ごとに監視します。 げっ歯類の麻酔モニタリングについては、特定の施設動物管理および使用委員会および獣医ガイドラインに従ってください。
2. 乾燥を防ぐために、滅菌綿棒を使用して両目に眼科用潤滑剤を一滴塗布します。不快感を軽減するための抗炎症剤と鎮痛剤の投与が推奨されます。
3. 動物を仰向けに寝かせた状態で、ノーズコーンを使用して麻酔を維持します。
4. エタノール70%とクロルヘキシジンで3回拭いて、動物の首の部分をきれいにします。カミソリを使用して動物の手術部位を剃ります(詳細は後述)。

2. 総頸動脈 (CCA) の解離顕

1. 微鏡下で顕微手術全体を実行します。外科用はさみと鉗子を使用して、胸骨の上から顎の下(約3〜4 cm)まで、首の正中線を浅く切開します。
2. 鉗子を使用して、脂肪組織と結合組織を慎重に分離し、気管を露出させます。
3. マウスの首の後ろに枕(直径約0.5cmの丸いもの)を置き、首を伸ばし、さらに露出させます。
4. 組織レトラクターまたはフックを使用して組織を分離します。
5. 動物の気管の左側で、結合組織を慎重にピンセットで離して、左側のCCAを露出させます。
6. 鉗子を使用して、すべての結合組織を慎重に取り除き、CCA分岐部と、外頸動脈と内頸動脈の両方の始まりを露出させます。

3. 物質注入用のCCAの調製

1. 鉗子を使用して、外頸動脈(ECA)の下にナイロン縫合糸の2つのセグメント(それぞれ約1 cm)を挿入します。
2. ECAの可能な限り高い位置に永久的な結び目を置きます。
3. ECAの可能な限り低い点、CCA分岐点のすぐ上に、取り外し可能なノットを配置します。この結び目は、上部の結び目に比べて緩んでいる必要があります。
4. 容器クリップを使用して、可能な限り低い点でCCAを閉じます。
5. 血管クリップを使用して内頸動脈(ICA)を閉じます。
6. 顕微解剖スプリングハサミを使用して、2つの結び目の間のECA(約2 mm)に小さなカットを行います。

4. ICAによる物質注入

1. 注入システムを組み立てます。注入する物質(薬物、病原体、細胞外小胞など)250 μlを含むツベルクリン注射器に6インチの毛細管チューブ(理想的な寸法:2.5 mm x 1.2 mm)を取り付け、毛細血管の先端をステップ3.6で行った切開部にそっと挿入します。
分
2. 岐部とCCAを閉じるクリップの間の中間点に達するまで、毛細血管をスライドさせ続けます。
3. 下部のECAノットを結びます。結び目が毛細管現象の流動性を可能にするのに十分な緩みであり、漏れを防ぐために十分にきついことを確認します。
4. ICAからクリップを取り外します。
5. シリンジピストンにゆっくりと圧力をかけ、毎秒約10μlで物質を注入します。

5. 注入後の手順

1. クリップを ICA に戻します。
2. キャピラリーチューブをそっと取り外します。
3. 下部のECAノットを完全に結びます。
4. ICA と CCA からクリップを取り外します。

6. 切開閉鎖と術後ケア

1. : レトラクターまたはティッシュフックと枕を取り外します。
2. 滅菌生理食塩水を使用して縫合領域を洗浄します。
3. ナイロン縫合糸/針と鉗子を使用して切開部を閉じます。
4. 術後の不快感を軽減するために、抗炎症剤と鎮痛剤を投与します。
5. 動物を加熱パッドの上に置いたケージに少なくとも1時間置き、回復を監視します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
麻酔器具	Vetequip	901806
外科用ハサミ	ファインサイエンスツール	14558-09
外科用鉗子ストレートチップ	ファインサイエンスツール	00108-11
外科用鉗子 角度付きチップ	ファインサイエンスツール	00109-11
スプリングハサミ	ファインサイエンスツール	15000-08
ナイロン縫合糸	ブレインツリーサイエンティフィ	SUT-S 104
キャピラリーチューブ (マイクロレナタン 0.010インチ x 0.005インチ/フィート)	Braintree Scientific	MRE01050
閉鎖縫合糸	VWR	95057-036
イソフルラン	ピラマル
2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド	FisherScientific	50-121-8005

ック