ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

サマリー

腫瘍間質内に存在する筋線維芽細胞の豊富な癌関連線維芽細胞（CAFS）、腫瘍の進行を推進する上で重要な役割を果たす。我々は実験的にヒト乳腺線維芽細胞からCAFSを生成するためのcoimplantation腫瘍xengraftモデルを開発した。プロトコルは、腫瘍形成を促進する能力を身CAFの筋線維芽細胞を確立する方法について説明します。

要約

癌は、腫瘍細胞と"質"と呼ばれる非癌コンパートメントで構成される複雑な組織です。間質は、細胞外マトリックス（ECM）と^1-3線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞と白血球を含む間葉系細胞が、様々な構成されています。

腫瘍関連間質には、近隣の癌細胞から放出される実質的なパラクリン信号に応答する。病気のプロセスの間、間質は、しばしば筋線維芽細胞の多数を含む、癌関連線維芽細胞（CAFS）によって人口になります。これらの細胞は、以前はそれらのin vitroでの培養のためのヒト癌の多くの異なる種類から抽出されています。 CAFSの亜集団は^、4,5、そのα-平滑筋アクチンのアップレギュレーション（α- SMA）の発現を介して識別可能である。これらの細胞は、筋線維芽細胞Cと同様の性質を共有する"活性化線維芽細胞"の特徴です。ommonly負傷したと線維性組織⁶で観察された。この筋線維芽CAFのサブセットの存在は非常に高品位な悪性腫瘍に関連し、患者の予後不良に関連付けられています。

私たち自身を含む多くの研究室では、、CAFS、免疫不全マウスに癌細胞を注入、大幅に腫瘍形成^7-10を促進することができることが示されている。癌患者から調製CAFSは、しかし、頻繁に継続的な実験を通してそれらの使用の広範さを制限する文化の伝播中に老化を受ける。この困難を克服するために、我々はcoimplantationの乳房の腫瘍の異種移植モデルを用いて、実験的にヒト乳腺線維芽細胞から不死化したヒト乳腺CAF細胞株を（EXP - CAFS）を生成するための新しい技術を開発。

EXP - CAFSを生成するためには、リダクションの乳房形成組織から得られた親のヒト乳腺線維芽細胞は、最初immortaliいたテロメラーゼ、テロメラーゼホロ酵素の触媒サブユニット、およびGFPを発現し、ピューロマイシン耐性遺伝子に設計さとSED。これらの細胞は、マウス異種移植に活性化rasがん遺伝子（MCF - 7 - rasの細胞）を発現するMCF - 7ヒト乳癌細胞でcoimplantedていた。 in vivoでのインキュベーション期間の後、最初に注入されたヒト乳腺線維芽細胞は、それらのピューロマイシン耐性¹¹に基づいて腫瘍の異種移植片から抽出された。

我々は、筋線維芽細胞表現型を採用し、常駐ヒト乳腺線維芽細胞が分化したことを観察し、腫瘍の進行の過程で腫瘍促進特性を取得した。重要なことは、これらの細胞は、EXP - CAFSとして定義されて、密接に患者から切除した乳癌から分離されたCAFSの腫瘍促進筋線維芽細胞表現型を模倣する。私たちの腫瘍異種移植片由来のEXP - CAFSしたがって人間breasでCAFSの生物学を研究するために効果的なモデルを提供tの癌。記述されたプロトコルはまた、ヒト癌の他の型から派生した様々なCAFの集団を生成し、特徴付けるために延長することができる。

プロトコル

1。初代培養ヒト正常乳腺線維芽細胞の分離

初代培養ヒト正常乳腺線維芽細胞を単離するための実験手順を図で説明されています。 1A。

1. 以前に^12を説明するように、細胞解離バッファーを準備します：10％ウシ胎児血清（FCS）、ペニシリン-ストレプトマイシン（200単位/ ml）、コラゲナーゼタイプI（1 mg / ml）を、ヒアルロニダーゼ（とダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を125単位/ ml）。
2. 削減乳房形成（〜0.5グラム）、リン酸の数倍は緩衝生理食塩水（PBS）から解剖乳房組織を洗浄する。無菌かみそりの刃を使用して小さな断片（<1.5 mm ^3の ）に組織をミンチ。
3. 上記の細胞解離バッファー（組織の0.5グラムあたり10ml）と最高速度で1分間ボルテックスの適切な量を含む15 mlのコニカルチューブに組織片を移す。
4. 細胞解離バッファーfの組織断片を消化または12月18日37時間℃でゆっくりと撹拌しながら。依然としてチューブに残っている未消化の組織片の多くの部分があることに^*注意。
5. 撹拌せずに室温で5分間チューブをインキュベートします。 5ミリリットル血清学的ピペットを使用して、新しいコニカルチューブに生じる間質細胞の濃縮上清を移す。
6. 250 × gで5分間、間質フラクションを遠心し、PBSで細胞ペレットを再懸濁します。 250 × gで5分間、再び遠心し10％FCSを含むDMEMで細胞ペレットを再懸濁します。文化37 15センチメートルペトリ皿に10％FCSを含むDMEMで細胞は℃、5％の二酸化炭素。
7. コンフルエントになるまで細胞を伝播する。それは通常8-10日かかります。 -80細胞を° Cで保存凍結培地（10％ジメチルスルホキシドおよびDMEMに20％FCS）を使用。オリジナルの株式を5凍結バイアルを準備。 1バイアルを解凍し、5個体群内で継代線維芽細胞を含む二次株式を5バイアルを準備するために細胞を拡大するその後の実験のための倍加（PD）に。これらの手順は、拡張された組織培養中に発生することができるクローン選択と文化のストレスを最小限に抑える。P1.1 - 7はまた、乳房切除術¹²で得られた乳癌からCAFSを切り離すために使用されることができる^のでご注意ください。

2。 GFP標識、ピューロマイシン耐性、不死化したヒト正常乳腺線維芽細胞の世代

1. P1.7で単離された初代ヒト正常乳腺線維芽細胞）をimmortaliseに、テロメラーゼとGFPの両方を発現するレトロウイルスpMIG（MSCV - IRES - GFP）ベクトル^12を 、ご紹介。 4-5日の培養細胞をしてから、GFP陽性細胞をフローサイトメトリーを用いてソートする。
2. GFPで標識された不死化線維芽細胞にピューロマイシン耐性遺伝子をコードする構築レトロウイルスpBabe -プーロをご紹介。文化ピューロマイシンの存在下で5〜7日間（最終濃度：1μg/ mlの）のための細胞がGFP陽性（GFP +）、ピューロマイシン耐性（プーロ^Rを分離する
3. 次に、これらの線維芽細胞は、GFPとピューロマイシン耐性をコードする遺伝子の水平伝達につながることができるアクティブなウイルスを作り出すかどうかを調べるために、2日間6センチメートルシャーレ内2.5x10 ⁵ GFP +プーロ^R不死化したヒト乳腺線維芽細胞を成長させる。
4. フィルタメディアは、シリンジフィルター（孔径：0.45μm）を使用して、これらの線維芽細胞によって調整し、ウイルス感染の効率を高めるプロタミン硫酸塩の存在下で12時間のための10T1 / 2マウス繊維芽細胞（5μg/ ml）を上に追加します。培地は、その後さらに2日間、10％FCS - DMEMに変更されます。
5. 蛍光顕微鏡で細胞を調べます。 GFPウイルスに感染10T1 / 2細胞ではGFP陽性になります。 5-7日間ピューロマイシン（1μg/ ml）を持つ細胞も扱い、あらゆるプーロ^R 10T1 / 2細胞はピューロマイシンの治療後に存在し、フォームコロニーであればプレートを観察。
6. なお、水平遺伝子トランジスタ親のGFP +プーロ^Rヒト乳腺線維芽細胞によって産生さアクティブなウイルスによってsferは、腫瘍の異種移植片内の周囲のマウス細胞および/ ​​または癌細胞GFP +プーロ^Rを行うこと^があります。これは、腫瘍の異種移植片から最初に注入されたGFP +プーロ^Rヒト乳腺線維芽細胞を単離するプロセスの妨げになる場合があります。

3A。免疫不全マウスに乳癌細胞とヒト乳腺線維芽細胞の共射出

EXP - CAFSを生成するための実験手順を図に示します。 1BA。

1. ミックス^{1 × 10 6} MCF - 7 - rasのヒト乳癌細胞と3 × ⁶ GFP ⁺プーロ^R、P2.2で生成された不死化ヒト乳腺線維芽細胞）。 50％（v / v）の注入あたりの​​マトリゲルで培養液400μlの細胞を準備します。
2. 免疫不全ヌードマウスに皮下細胞の混合物を注入する。 CAFSは異なるから独立して抽出されている場合腫瘍は、いくつかのマウスの右と左脇腹に各混合物を移植。

3B。免疫不全マウスにヒト乳腺線維芽細胞の注入

1. EXP - CAFSに対する制御の線維芽細胞を生成するには、50％（v / v）のマトリゲルあたりの注入（図1BB）で培養液400μlにP2.2に生成された3 × 10 ⁶ GFP ⁺プーロ^R不死化したヒト乳腺線維芽細胞を準備します。癌細胞と線維芽細胞を混合しないでください。
2. ヌードマウスの皮下部位にP3b.1で準備した線維芽細胞を移植する。

^*接種線維芽細胞が皮膚の下に線維芽組織ではなく、腫瘍を形成することに注意してください。

4A。腫瘍の異種移植片の解剖

1. 皮下ヒト乳癌異種移植を保有するマウスの42日後移植（図1BAを）Euthanise。際に他の癌細胞および/ ​​または線維芽細胞がcoimplantedされていること^*注、線維芽細胞は、それらの筋線維芽細胞表現型を開始するために腫瘍の異種移植片内でより長い42日間インキュベートする必要があります。
2. 鉗子とハサミを用いて鈍的切開によるマウスの横腹から腫瘍の異種移植片を採取する。 PBSで腫瘍組織を浸す。

4B。線維芽細胞の異種移植片の解剖

1. 線維芽細胞の異種移植42日後移植（図1BB）を抱いてマウスをEuthanise。
2. 鉗子やハサミを使用して皮下線維芽細胞の異種移植片を解剖。 PBSに線維芽組織を置く。小さな透明な組織として表示される線維芽細胞の異種移植は、皮膚の下を探すのは難しい場合があります^のでご注意ください。

5。異種移植片からの初代培養細胞の調製

1. 腫瘍（〜0.5グラム）または線維芽組織（〜0.1グラム）を解剖するために無菌生物学的安全キャビネットを使用してください。 15cmの文化Dの最上位に摘出した組織を転送する1mlのPBSでっぽい。無菌かみそりの刃を使用して小さな組織片（<1.5 mm ^3の ）に組織をミンチ。 *線維芽細胞の異種移植片は、以下の0.1グラムの重さなら、いくつかの追加の線維芽細胞の異種移植片を収集し、単離のためのセルの数を増やすために、それらを一緒に混ぜることに注意してください。
2. 細胞解離バッファー（組織の0.5グラムあたり10ml）と最高速度で1分間ボルテックスを含む15 mlのコニカルチューブに組織片を移す。
3. 37℃で3時間細胞懸濁液をインキュベート°、連続、低速撹拌しながらC。

6。培養中のピューロマイシン耐性細胞の分離

1. 250 × gで5分のための腫瘍または線維芽細胞異種移植片のいずれかから解離細胞懸濁液を遠心し、PBSで細胞ペレットを再懸濁します。 250 × gで5分間遠心する10％FCS - DMEMで得られた細胞ペレットを再懸濁します。 37ピューロマイシン存在下（1μg/ mlの）で15センチメートルペトリ皿° Cで培養細胞をあらゆる汚染癌細胞および/またはマウス間質細胞を除去するために、5％の二酸化炭素。コンフルエント（2-4週間）になるまで細胞を伝播する。 -80細胞を° Cで保存凍結培地を使用して。 *注その結果プーロ^R細胞 、指定された42日齢のEXP - CAF1（図1BA）またはコントロール線維芽- 1細胞（図1BB）、不滅とGFPの陽性である。それは、P2.3 - 6で説明したように、これらの細胞は、10T1 / 2細胞を使用して、アクティブなウイルスを作り出すかどうかを確認することをお勧めします。

7A。文化におけるEXP - CaF2薄膜の細胞の単離

さらにCAFSの活性化筋線維芽細胞表現型を増強するため、42日齢のEXP - CAF1 MCF - 7 - rasの細胞と細胞を混合し、200日の追加期間のヌードマウスに皮下再度注入する。細かく分析し、ピューロマイシン（1μg/ mlの）の存在下で10％FCS - DMEMで15センチメートルペトリ皿の中で単一細胞懸濁液と培養細胞への腫瘍の異種移植片を解離させ、ようにP6に示す0.1。コンフルエント（8-10日）まで、細胞を伝播する。 -80細胞を° Cで保存凍結培地を使用して。結果プーロ^R細胞^は 242日齢のEXP -フッ化カルシウムの細胞（図1BA）という名前が付けられます。

図7b。文化のコントロール線維芽- 2細胞の抽出

EXP - CaF2薄膜細胞に対する制御の線維芽細胞を生成するには、200日間、さらにヌードマウスに皮下癌細胞なしで単独で42日齢のコントロール線維芽- 1細胞​​を注入する。としてP6.1で示されたピューロマイシンの存在下で10％FCS - DMEMで15センチメートルペトリ皿中の細胞を（1μg/ ml）を摘出し、単一の細胞懸濁液と文化に線維芽組織を解離する。コンフルエント（3-4週間）になるまで細胞を伝播する。 -80細胞を° Cで保存凍結培地を使用して。結果プーロ^R細胞^はコントロール線維芽細胞- 2細胞（図1BB）という名前が付けられます。

8。代表的な結果：

コントロール線維芽細胞- 2、EXP - CaF2薄膜セル乳房の腫瘍の異種移植片から抽出されているlsは、、人間を示す、人間特有のビメンチン、プロリル-4 -ヒドロキシラーゼ、コラーゲン1A、フィブロネクチン、S100A4、および線維芽細胞の表面タンパク質（図^2A）11を含む間葉系マーカー、のために強く陽性に染色起源とこれらの細胞の間葉系の性質。対照的に、サイトケラチン、上皮細胞のマーカーは、これらのGFP ⁺繊維芽細胞（図2B）で染色されなかった。これらの知見は、したがって、抽出されたEXP - CaF2薄膜および制御線維芽- 2細胞は、最初にマウスの異種移植片に導入された親のヒト乳腺線維芽細胞から発信されていることを示唆している。

重要なのは、EXP - CaF2薄膜の細胞の割合が高く、α- SMAと42日齢のEXP - CAF1とコントロール線維芽- 2細胞（図に比べて筋線維芽細胞のマーカーが、どちらも細胞外マトリックス糖タンパク質テネイシン- C ^5、のために陽性に染色^{。2C、D）11。}これらのデータは、その居住者、人間の乳腺fibrを示しているoblastsは徐々に腫瘍異種移植片内でCAFの筋線維芽細胞へと進化。

ヒト乳腺線維芽細胞の分離の図1の模式図。 A）削減乳房形成組織は無菌かみそりの刃（P1.2）を使用してミンチと15 mlコニカルチューブ（P1.3）に移した。小さ ​​な組織片を細胞解離バッファー（P1.4）で消化し ​​、in vitro（P1.5 - 7） で培養のために調製した。 、隔離された一次ヒト乳腺線維芽細胞、テロメラーゼとGFPの両方を発現するレトロウイルスpMIG（MSCV - IRES - GFP）ベクトルを、immortaliseには導入され、その結果、GFP陽性細胞はフローサイトメトリー（P2.1）を用いて選別した。ピューロマイシン耐性遺伝子をコードするレトロウイルスpBabe -プーロのベクトルは、これらの細胞に導入した。ピューロマイシンの治療時に、GFP -標識（GFP ^+）ピューロマイシン耐性（ピューロ^{R）、immortali}sedのヒト乳腺線維芽細胞は、（P2.2）を単離した。

BAは）EXP - CAFSを生成するには、GFP ⁺プーロ^Rはヒト乳腺線維芽細胞を免疫不全ヌードマウス（P3A）の皮下にMCF - 7 - rasの乳癌細胞でcoinjectedされた不死化。腫瘍の異種移植は、移植後42日（P4A）で切除し、単一細胞懸濁液（P5）に解離した。これらの細胞は、任意の混入癌細胞とマウス間質細胞（P6）を排除するためにピューロマイシンの存在下でin vitroで培養した。結果としてピューロマイシン耐性細胞は、実験的に生成されたCAF1（EXP - CAF1）細胞と呼ばれた。これらの細胞は、切除42日移植後は、再びMCF - 7 - rasの細胞と混合し、（P7a）前と同じように、ホストマウスに皮下移植した。結果腫瘍は200日の追加期間増殖させ、その後解剖、解離、およびピューロマイシンの存在下で培養した。孤立ピューロマイシン耐性細胞は、EXP -フッ化カルシウムの細胞（242日齢）と呼ばれた。

EXP - CAFSに対するコントロール細胞を単離するためにはBB）は 、GFP ⁺プーロ^R不死化したヒト乳腺線維芽細胞は、MCF - 7 - rasの細胞（P3B）なしで純粋培養としてヌードマウスに皮下注射した。解剖線維芽組織は、42日後移植（P4Bは）、、コントロール線維芽細胞- 1細胞​​という名前の単細胞懸濁液（P5）およびピューロマイシン耐性細胞に解離前述のように（P6）を単離した。これらの線維芽細胞は、再び200日（P7B）のためにさらにMCF - 7 - rasの細胞なしでヌードマウスに皮下移植した。線維芽組織の解離、解剖、およびピューロマイシンの存在下で培養した。分離されたピューロマイシン耐性細胞は、コントロールの線維芽細胞- 2細胞を（242日齢）と呼ばれた。

図2 。（B）とは対照的に、汎サイトケラチン、上皮細胞のマーカー、GFP（緑）を発現するEXP - CaF2薄膜細胞では検出されていません。細胞核は、4' - 6 -ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）（青）で染色されています。スケールバーは50μm（小島らから呼ばれる^。11）

（C）EXP - CaF2薄膜の細胞とα- SMA（赤）またはテネイシンC（TN - C）（赤）に対する抗体を使用してコントロール線維芽- 2細胞（コントロールF.）の免疫蛍光。細胞核はDAPI（青）で染色されています。スケールバーは50μm。EXP - CaF2薄膜セルの（D）48％は1、一方、α- SMA陽性の染色42日齢のEXP - CAF1の4％、対照線維芽細胞- 2細胞集団の2.5％がα- SMAが陽性です。 （小島ら11から参照される）

ディスカッション

CAF -特異的マーカーとCAFSの間で観察された不均質性のレベルの欠如は、この細胞型自体の課題の特性評価をレンダリングする。 in vitroで研究するCAFSはまた、これらの細胞が老化し、長期間培養すると増殖が停止する追加の合併症によって妨げられている。直接レトロウイルステロメラーゼcDNA構築物を使用して、プライマリCAFSをimmortaliseに私たちの以前の試みは失敗しました。したがって、さらにこれらの細胞の特性を促進する腫瘍を調べるために、我々は、coimplantationの腫瘍の異種移植モデルを用いてヒト乳腺線維芽細胞から不死化CAFSを生成する手法を開発した。削減乳房形成組織から抽出した主要なヒト乳腺線維芽細胞は、マウスに乳癌細胞を注入される前に不死化された。ヒト線維芽細胞は、結果の腫瘍異種移植片（詳細は図1BAを参照）から分離された。重要なことは、ヒト乳腺線維芽細胞は、ますます電子腫瘍の進行の過程で筋線維芽CAFSを促進腫瘍にvolved。または70日齢のEXP - CAF1細胞と制御性線維芽細胞- 2細胞¹¹ -我々は確かに242日間-古いEXP - CaF2薄膜の細胞が...

材料

材料名	タイプ	会社	カタログ番号	コメント
DMEM		インビトロジェン	61965-026
ウシ胎児血清		GIBCO	10270
ペニシリン - ストレプトマイシン		インビトロジェン	15140-122
コラゲナーゼI型		シグマ	C0130 - 1G
ヒアルロニダーゼ		シグマ	H4272
ビメンチン（V9）抗体		Novocastra研究所	NCL - L - VIM - V9
テネイシンC（BC - 8）抗体				からの贈り物 博士ルチアーノ Zardi
α- SMA - Cy3の（1A4）抗体		シグマ	C6198
プロリル-4 - ヒドロキシラーゼ		Dako社製	M0877
（5B5）抗体
コラーゲンタイプ1の1A抗体		シグマ	HPA011795
汎サイトケラチン抗体		シグマ	C5992
フィブロネクチン抗体		BDバイオサイエンス	610077
S100A4/FSP-1（線維芽細胞 特定のタンパク質- 1）抗体		Dako社製	A5114
線維芽細胞表面タンパク質 （クローン1B10）抗体		アブカム	ab11333
MSCV - IRES - GFPコンストラクト				作家へのお願い
pBabe -プーロ構造				購入 Addgeneから
ピューロマイシン		シグマ	P8833
DAPI		シグマ	D9564
15 mlコニカルチューブ		コー​​ニング	430766
ヌードマウス		タコ	NCRNU - F	女性のNCRヌード
C3H/10T1/2細胞		ATCC		CCL - 226