人工多能性幹細胞由来ヒトミクログリア細胞のマウス脳への経鼻移植

要約

出典: Parajuli, B., et.al.非侵襲的経鼻経路を経由する免疫担当マウス脳におけるヒト人工多能性幹細胞由来ミクログリアの移植J. Vis. 経験。(2022)。

このビデオは、人工多能性幹細胞由来ヒトミクログリア(iPSMG)細胞のマウス脳への経鼻移植を示しています。ヒアルロニダーゼは、ミクログリアが枯渇したマウスの鼻孔に適用され、透過性を高めます。iPSMG懸濁液を鼻腔内に投与し、マウスを回復させます。成長因子が豊富な培地は、脳組織における iPSMG の生存をサポートするために定期的に投与されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.細胞培地、移植培地、および麻酔混合物の調製

1. ダルベッコの修飾イーグル培地 (DMEM) に 10% ウシ胎児血清と 0.1% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加して細胞培地を調製します。
2. ヒトコロニー刺激因子1またはhCSF1(250 ng / mL)およびヒト形質転換成長因子ベータ1またはhTGF-β1(100 ng / mL)を細胞培地に添加することにより、移植培地を調製します。
3. 0.45 mLの塩酸メデトミジン、1.2 mLのミダゾラム、および1.5 mLの酒石酸ブトルファノールを11.8 mLの生理食塩水に混合することにより、腹腔内注射用の麻酔混合物を調製します。

2.人工多能性幹細胞由来ヒトミクログリア(iPSMG)細胞の調製

注

:凍結iPSMG(材料表)は、使用するまで-80°Cに保管しました。

凍結

1. した細胞を37°Cのウォーターバスで素早く解凍します。目に見えるすべての氷が溶けるまでサンプルを回転させます。
2. 解凍した人工多能性幹細胞由来ヒトミクログリア(iPSMG)を37°Cに温めた培地に加えます。培地を含む解凍細胞1 mL(1×^{10 6}細胞)を培地10 mLに加えます。
3. 細胞を300 x g で5分間遠心分離して、細胞ペレットを得る。
4. 遠心分離後、細胞ペレットを乱すことなくすべての上清を除去します。移植培地中のサイトカイン濃度の希釈を減らすには、上清の完全な除去が望ましい。
5. 移植培地を添加して、1 x 10⁵細胞/μLの細胞濃度を得る。
6. iPSMGを氷の上に置き、すぐに移植に進みます。
   注:移植用のiPSMGの調製は、汚染を避けるためにクリーンベンチで行われます。

3. 経鼻移植用マウスの調製(Tsn)

野生

1. 型雄マウス(C57BL/6J、8週齢)にPLX5622含有食を7日間与える。
2. 7^日目の終わりに、PLX食を中止し、研究が終了するまで通常の食事をマウスに与えます。
   注:PLX5622含有食は、1 kgのAIN-93Gに1.2 gのPLX5622を加えることによって調製されます(材料表)。

4.

1. PLX摂食の中止から24時間後に細胞の経鼻移植を行い、マウスの体重を量り、麻酔混合物(0.2 mL / 20 g)の腹腔内注射を使用して
マウスを麻酔します。
2. ペダル引き抜き反射(つま先をしっかりとつまむ)に対する無反応性によって評価されたマウスを完全に麻酔した後、10 μLピペットチップを使用して各鼻孔にiPSMGの経鼻移植の1時間前に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(100 U / mL)に2.5 μLのヒアルロニダーゼを投与し、鼻粘膜の透過性を高めます。
3. ヒアルロニダーゼを塗布した後、マウスを仰臥位に置きます。
4. iPSMGの経鼻移植の10分前にステップ4.2を繰り返します。
5. 10 μLのピペットチップを使用して、2.5 μLの細胞懸濁液をマウスの片方の鼻孔に塗布します。
6. 細胞懸濁液をもう一方の鼻孔に投与する前に、マウスを仰臥位に5分間置きます。
7. 手順4.5と4.6を4回繰り返し、動物あたり合計20 μLの総量を適用します。
8. 麻酔から回復するまで、マウスを37°Cのヒートパッドの上に仰臥位に置きます。
9. PLX給餌の停止後48時間で、同じマウスでステップ4.1〜4.7をもう一度繰り返します。
   注:移植中にiPSMG細胞を氷上に置くことに注意する必要があります。

5. サイトカインの適用

1. 麻酔混合物(0.2 mL/20 g)の腹腔内注射によりマウスを麻酔します。
2. 10 μLのピペットチップを使用して、2.5 μLの移植培地をマウスの片方の鼻孔に塗布します。
3. マウスを仰臥位に5分間置いてから、移植培地をもう一方の鼻孔に投与します。
4. ステップ5.2と5.3を4回繰り返し、動物あたり総量20 μLを適用します。
   注:移植培地(ヒトサイトカイン)の経鼻投与は、移植されたiPSMGの生存率のために12時間ごとに必要

であることに注意する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Oriental Yeast Co
シ胎児血清	GE Healthcare Life Sciences	SH30070.03
iPSMG	塩野義製薬		薬・疾患研究研究室
ヒトコロニー刺激因子1(hCSF1)	PeproTech	300-25
ヒアルロニダーゼ	Sigma-Aldrich	H-3506
デトミジン	治精化	VETLI5
ミダゾラム	アステラス製薬	18005A2
パラホルムアルデヒド	和光 純化学工業	162-16065
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティ	15140-122
ピペット	エッペンドルフ	3120000011
チップ	エッペンドルフ	30076028
PLX5622	アマディス ケミカル	A930097
トランスフォーミング成長因子-β1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21

ウ冷凍株式会社 創 メ塩酸塩 明フィック ピペット