GENPLAT（GLBRC酵素のプラットフォーム）は、バイオマスの分解のための酵素カクテルの発見と最適化のための自動化されたプラットフォームです。それは、複数のコンポーネントが含まれている酵素の複数の原料と混合物に適合させることができます。
この記事について
サマリー
要約
バイオマスの分解に用いられる酵素の高コストは、リグノセルロース系原料をエタノールなどの液体輸送燃料へ経済的に変換する上での大きな障害となっています。私たちは、多様な前処理およびバイオマスの組み合わせから糖を放出させるための、新規酵素および酵素カクテルを探索・開発するための、GENPLATと呼ばれる統合ハイスループットプラットフォームを開発しました。GENPLATは、個別の精製酵素、統計的な実験計画法、バイオマススラリーと酵素のロボットピペッティング、および放出されたGlcとXylの自動比色定量という4つの要素で構成されています。個別の酵素は、Pichia pastorisまたはTrichoderma reeseiでの発現、あるいは市販のカクテルや新規微生物の抽出液からのクロマトグラフィー精製によって調製されます。単回心的格子（一部実施）混合モデルは、市販の実験計画法統計ソフトウェアを用いて設計されます。複雑性の高い酵素混合物は、96ウェル形式へのロボットピペッティングを用いて構築されます。放出されたGlcおよびXylの測定は、酵素結合比色アッセイを用いて自動化されています。最大16成分を含む最適化された酵素混合物が、さまざまな原料と前処理の組み合わせでテストされてきました。
GENPLATは、純粋な酵素の混合物、市販製品の混合物（例：Accellerase 1000およびNovozyme 188）、新規微生物の抽出物、またはそれらの組み合わせに適応可能です。混合物を調製し、試験するには、 ˜10種類の精製酵素には100未満が必要である μ各タンパク質をg単位で用い、最終的な総負荷量をタンパク質15 mg/グルカン1 gとして運用した場合、総反応回数は100回未満となります。我々は複数の供給源からの酵素を使用しています。酵素は、真菌培養物などの天然資源から精製することが可能です（例： Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum、および Galerina marginata）、または（増加し続ける微生物ゲノム配列から得られた）コード遺伝子を以下のような宿主で発現させることによって作製できる E. coli, Pichia pastoris、または〜などの糸状菌 T. reeseiタンパク質は、市販の酵素カクテル（例：Multifect Xylanase、Novozyme 188）から精製することも可能です。また、糖質加水分解酵素、細胞壁活性エステラーゼ、プロテアーゼ、リアーゼを含む、より多くの精製酵素が、Megazyme, Inc. (www.megazyme.com)、NZYTech (www.nzytech.com)、PROZOMIX (www.prozomix.com) などの商用ソースから入手可能です。
Design-Expertソフトウェア（Stat-Ease, Inc.）を用いて、シンプレックス格子設計の作成および応答（本ケースではGlcおよびXylの放出量）の解析を行います。混合物は4〜20個の成分を含み、各成分の割合は0%から100%の間で変化させることができます。アッセイポイントには通常、極点（頂点）と、有効なモデルを生成するために十分な数の中間点が含まれます。実験計画法の用語では、我々の研究の大部分は「混合物」実験であり、これは全成分の合計が固定された全タンパク質負荷量（mg/g glucanとして表示）に等しくなることを意味します。シンプレックス格子における混合物の数は、混合成分の数と多項式の次数（2次または3次）の両方に依存します。例えば、6成分の実験において、3元相互作用を検出可能な拡張特殊3次モデルを用いる場合は63回の独立した反応が必要となりますが、拡張2次モデルを用いる場合は23回の独立した反応で済みます。8個以上の成分を含む混合物の場合、2次実験計画法がより実用的であり、我々の経験では、そのようなモデルで通常、統計的に妥当な結果が得られます。
すべての酵素添加量は、最終的な総添加量（本実験では通常 15 mg protein/g glucan）に対するパーセンテージとして的に表記します。「コア」酵素の場合、下限値を5%に設定します。この制限は、コア酵素のいずれかが0%である場合に、Glcおよび/またはXylの収率が非常に低くなるという我々の経験から導き出されたものです。GlcまたはXylの収率が非常に低いサンプルが多すぎると、モデルの精度が低下します。下限値を設定することで、結果的に上限値が決定されます。つまり、6成分の実験において、各単一成分の下限値を5%に設定した場合、各単一成分の上限値は75%となります。「アクセサリー」と見なされる他のすべての酵素の下限値は0%に設定します。「コア」および「アクセサリー」という呼称はある程度恣意的な指定であり、基質によって異なりますが、本研究におけるコーンストーバーからのGlc放出のためのコア酵素は、T. reesei由来の以下の酵素で構成されています：CBH1（Cel7Aとしても知られる）、CBH2（Cel6A）、EG1（Cel7B）、BG（β-glucosidase）、EX3（endo-β1,4-xylanase, GH10）、および BX（β-xylosidase）。
プロトコル
1。酵素の生産
- ベクトルpPICZまたはpPICZαに対応する遺伝子のクローニングとP.への変換によるピキアパストリス中のタンパク質を生成するピキアパストリス 。メタノール誘導でバッフル付500mlのフラスコに300mlのバッチで細胞を成長させる毎に24時間（バネルジーら、2010A）。
- タンジェンシャルフロー濾過により培養濾液を濃縮し、脱塩。
- -80 20％グリセロールで小分けに酵素℃にて保存してください。濃度範囲は1〜10 mg / mlのです。
2。実験の設計
- 入力テストする酵素の数は、その上部と下部の比率（コア酵素は5％の低い割合など）、およびデザインExpertsoftwareに実験的なデザイン（例えば、二次または三次）のタイプ。
- の15 mg / gのグルカンの合計負荷を作るに追加する各酵素のμg単位の量を計算し、に追加するμlで各酵素の量を計算するそれぞれの反応。
- 実験的なデザインと分注FXPのソフトウェアにインポートして転送元ファイルの関数を使用してに応じて水と酵素の分注のためにソースの実験器具、ソースの井戸、先の実験器具、先の井戸、および移動量を指定してExcelワークシートを生成します。
3。酵素加水分解
- パドルの貯水池で、5μg/ mlのテトラサイクリン、5μg/ mlのシクロヘキシミドを含む、50mMのクエン酸ナトリウム、pHを4.8にバイオマスのスラリーを一時停止します。
- スパン- 8カットオフ最後の0.5センチメートル1000 -μLピペットチップを用いて96ウェルディープウェル反応プレートの各ウェルにスラリーのロボット制御でピペットを200μl。を100μl/秒に一度スラリーを混合してから、パドルの貯水池から同じボリュームを吸引し、プレートに分注する。
- ベックマンFXに入力されたプログラムを使用して、同じプレートに酵素を分注する。
- 貫通capmatsでプレートをシール。
- 逆さにしてタッププレート表面張力を克服するために数回。 10rpmでハイブリダイゼーションインキュベーター回転で48時間、50℃でプレートを置きます。
4。グルコースとXYLの決定
- スイングバケット遠心機で1250 × gで3分間反応プレートを遠心する。
- 分注FXのAP96ポッドを使用して、通常の96ウェルプレートに上清100μlを移す。
- 90から95でプレートをインキュベート℃で10分間の酵素を不活性化し、30秒、1250 × gで遠心分離するために。
- グルコースの測定では、定期的な96ウェルプレートに上清12μlを移す。グルコースオキシダーゼ/ペルオキシダーゼ（GOPOD）試薬192μlを添加する。 20分間50℃で培養すると、マイクロプレートリーダーで510 nmで吸光度を読み取る。ブランクは、酵素なしで反応混合物です。
- XYL測定では、384ウェルプレートに4μlを移す。アッセイ試薬を追加し、340nmでプレートを読み取る。空酵素なしで反応混合物です。
5。データ解析
- 既知のグルコースと、元のバイオマスのXYL内容に基づいて％グルコースとXYLの収量に吸光度の値を変換します。デザインエキスパートソフトウェアへの応答として、これらのパーセンテージをインポートします。堅牢なモデルのための基準が満たされていることを確認するために統計的paramentersを確認してください。
- 実験的に最適なモデルの予測を確認してください。
6。 GENPLATと代表的な結果：
（1）個々の純粋なタンパク質の最適化された混合物の作成 。結果は、酵素が重要であるかを示し、そしてどのような割合で、そしてまたその酵素は重要ではありません 。 T.に豊富に存在するいくつかのタンパク質このようなCIP1とCIP2としてトリコデルマリーセイ secretome（Nagendranら、2009）、、アンモニア繊維の拡大（AFEX）またはアルカリ俵で前処理したトウモロコシの茎葉からグルコースのリリースでは何の役割も果たさないように見えるロゲンの過酸化水素（AHP）（バネルジーら、2010B）。一方、いくつかのタンパク質が突然重要です。例えば、糖加水分解酵素ファミリー10と11のエンド - キシラナーゼはGlcのリリースの両方が重要であり、一つキシラナーゼは、他の（。バネルジーら、2010B、C）のために代用することはできません。 Cel61A、T.のマイナータンパク質XYLのリリースでは、 トリコデルマリーセイ secretomeを、グルコースは非常に重要ですが、ではない。他の人がどちらか一方だけ（バネルジーら、2010C）のために必要であるのに対し、いくつかの酵素は、グルコースとXYLの両方のリリースのために重要である。
16成分、0.94 mg / mlの（すなわち、最適化されていない混合物）の濃度で各々を含有する合成混合物は、AFEX前処理DDGから利用可能なグルコースの38％を発表した。同一の加水分解条件下では、最適化された混合物は、これで16成分の濃度は、0％から32％であった（図2）グルコースの52％を発表した。この実験では、定義された混合物を構築するユーティリティを示しています。
"万能サイズ">（2）別の前処理/基板の組み合わせに最適化されたカクテルの作成 。現在の商業セルラーゼの準備がある"_content。現実には、最高のカクテルは、基板と前処理の両方に依存する。単一製品Accellerase 1000と同じ方法で前処理した別の基板から別の収量を与え、別の前処理（図1）に公開されている同じ基板からそのように我々は、複数の前処理とみとめ原料（バネルジーらのために純粋な酵素の混合物を最適化するためにGENPLAT使用しているら、2010C）。図2は、16純粋な酵素の最適な酵素比率がAFEX前処理トウモロコシの茎葉、AHP -前処理トウモロコシの茎葉、およびAFEX前処理DDGの違いを示しています。わずか11酵素を図2に示されているの最適な理由他の五（Cel61B、AbfB、CIP1、CIP2、およびCel12A）の割合は0％（バネルジーら、2010C）であることがわかった。（3）新規酵素の発見 、T.以外の菌の抽出を行っているデルマリーセイおよびA.ニジェールでは、異なる基板上に成長した。私たちのコアセットに追加したとき、ある特定の抽出は、グルコース収率を後押しした。責任あるタンパク質を精製し、（Banerjeeさんとウォルトン、未発表結果）任意の市販の酵素調製物中に存在する新規なグリコシル加水分解酵素であることが示された。
よりよい酵素の（4）発見 。の劣化のための酵素が最も重要であるGENPLATで表示した特にバイオマスは、私たちは酵素が改善のための焦点でなければならないそのうちのよりよい理解を持っている。重要な酵素の良い例は、自然の中で検索して見つけるか、タンパク質工学によって作ることができる。 （酵素は、所望の特性に応じて、いくつかの方法でそのT.デルマリーセイのホモログ、より"良い"かもしれない、例えば、より高い比活性、より大きな相乗効果は、タンパク質分解感受性、または強化された熱安定性を減少させた）。純粋なセルロースまたは他の人工的な基質との結果が自然リグノセルロースに該当しない場合がありますので、それは現実的に複雑なカクテル（重要ではバイオマスの酵素は、単独で動作しないため）と現実的な基板（重要を使用しているためGENPLATは、潜在的に優れた酵素をアッセイするために意味のあるプラットフォームを提供します。材料）。
（5）市販の酵素の最適化 。純粋な酵素の十分に大きな量はまだ現実の世界には存在しません。彼らが実行するまで、エタノールプロducersなどAccellerase 1000 MultifectXylanaseとして商用製品に依存する必要があります。しかし、市販酵素の混合物は一般に、個々のものよりパフォーマンスに優れ、そしてGENPLATは、複数の市販酵素の最適化されたカクテルを設計するために使用することができます。図3は、4つの市販の酵素製剤の混合物を最適化するためにGENPLATの使用方法を示します。 AFEX前処理DDGからGlcのリリースのための最適な割合は47％Accellerase1000、27％Multifectペクチナーゼ、22％Novozyme 188、および4％Multifectキシラナーゼ（バネルジーら、2010C）であることがわかった。図3Bは、4つの酵素製剤とAFEX - DDGからグルコース収率の違いを示しています。最適化された商業用混合物は、高グルコースの収率が得られるだけでAccellerase1000より、SpezymeCP単独で、または16ビットコンポーネントの合成混合物。この実験はまた、16成分合成混合物は、市販酵素の一つ以上に存在する最適なグルコース放出、のために必要な1つ以上の酵素が欠けていることを示しています。 GENPLATは、私たちすることができますそのようなコンポーネントを識別するためにED。
図1は、単一の市販の酵素調製物は、すべての基板と、すべての前処理に最適なです 。五基板三前処理は、（0.5 mmの粒径）研削の同様の条件下で比較した、酵素負荷（15 mg / gのグルカン）、および加水分解の条件（48時間、50 ° C）異なるAFEX前処理基板の。A.消化 Accellerase 1000で。トウモロコシの茎葉のB.の消化Accellerase 1000で3つの異なる方法（Banerjeeさんらを参照してください。、2010C）で前処理する。
図2。AFEX前処理トウモロコシの茎葉（AFEX - CS）、アルカリ性過酸化水素前処理トウモロコシの茎葉（AHP - CS）、またはAFEX前処理乾燥は蒸留からのグルコースの放出のための11の酵素の最適な比率ERS"穀物（AFEX - DDG）。データは、バネルジーらからです。 （2010C）。バーの上部にある数字は、バイオマス試料中の全Glcのパーセントとしてグルコースの収量です。
図3。A. AFEX前処理DDGからGlcのリリースの4つの市販の酵素製剤の最適化された混合物を生成するためにGENPLATの使用。 Multifectキシラナーゼは、最小の貢献（4％）したため、この三角図から省略した。B.グルコースの収率は、同一の加水分解条件下での異なる酵素処理（15 mg / gのグルカンの酵素、48時間、50℃）でAFEX - DDGから。 "四成分の商業は、"図に示すように実験から決定されたプロポーションを持っています。 3A。
ディスカッション
これは、広く酵素のコストを削減することが経済的なリグノセルロースエタノール産業の発展にとって重要であることが認識されている。現在入手可能な市販の酵素カクテルは、多くのタンパク質（Nagendranら、2009）の複雑で不完全に定義された混合物であり、これらは主に酸で前処理トウモロコシの茎葉上での使用に適合している。優れた酵素カクテルの開発を加速するためには、いくつかの研究室では、酵素の発見と特性評価のためのハイスループットプラットフォームを開発しました。 。。デッカーらロボットの酵素とバイオマススラリーの調剤、実験の統計的設計、および/またはグルコースの自動測定とXYL（ベルリンら、2007：この地域での取り組みもGENPLATで見つかった次のプロパティの一つ以上を組み込んでいますら、2009;。Kimら、1998;。キングら、2009）。。 GENPLATはに最大で6つのコンポーネントから分析することができる酵素の混合物の複雑さで最も大きく、これらの以前の取り組みを拡張する私たちの最新作で16個以上の初期の研究（バネルジーら、2010C）。穏やかに転倒回転による消化中に混合;とGluとXYLの自動比色定量GENPLATのその他の主要機能は、調剤中に中断された茎葉のスラリーを保つことができるビーズ混合室の使用（パドルの貯水池）です。
開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この作品は、エネルギー五大湖バイオエネルギー研究センター（科学BER DE - FC02 - 07ER64494のDOE事務所）と米国エネルギー省、基礎エネルギー科学のオフィスからの助成金DE - FG02 - 91ER200021、部門の米国エネルギー省の一部で賄われていた化学科学、地球科学と生命科学。我々は彼らの材料と概念的な貢献のためにジョンスコットクレイグとメリッサBorruschに感謝。
材料
使用機材とソフトウェア：
- デザインエキスパートソフトウェア、バージョン8.0（スタット使いやすさ、（株）、ミネアポリス、ミネソタ州）（ http://www.statease.com ）
- 分注FXPラボ自動化ワークステーション（Beckman - Coulter社、フラートン、カリフォルニア州）
- 分注FXPソフトウェア、バージョン3.3（Beckman - Coulter社、フラートン、カリフォルニア州）
- パドルの貯水池（モデルVP 756C - 1P100、V＆Pサイエンティフィック社、サンディエゴ）
- ウェルプレート、96ディープ（1.5 ml）を（Abgene、フィッシャーサイエンティフィック、エプソン、英国）
- 貫通capmats（米国サイエンティフィック、オカラ、フロリダ州）
- 回転ハイブリダイゼーションインキュベーター（モデル5420、VWR）
- スイングローター遠心機（モデル5810R、エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ）
- プレート、コスター96ウェル（Abgene、フィッシャーサイエンティフィック、エプソン、英国）
- 384ウェルプレート、（BDファルコン、BD Biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州）
使用される試薬：
- ピキアパストリスとベクトル：ひずみX33、およびpPICZとpPICZα（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）
- T.デルマリーセイとベクトル：ひずみQM9414（農業利用研究のための農業ナショナルセンター、ピオリア、イリノイ州の米国エネルギー省）、およびpCB1004 - EV（Banerjeeさんら、2010B。）
- Accellerase 1000（ロット番号1600844643）（ジェネンコア社、ロチェスター、ニューヨーク州）
- 50mMのクエン酸ナトリウム緩衝液、pH 4.8
- テトラサイクリン在庫：10 mg / mlの
- シクロヘキシミドの株式：10 mg / mlの
- GOPODアッセイキット、カタログK - GLUC（Megazyme、ブレイ、アイルランド）
- キシロースアッセイキット、カタログK -キシロース（Megazyme、ブレイ、アイルランド）
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再版と許可
