の軸索再生を研究するために、低予算レーザー軸索切断システムの構築 C.エレガンス</em

サマリー

レーザー軸切開術とそれに続くタイムラプスイメージングは、C.エレガンスの突然変異が軸索再生に及ぼす影響をアッセイするための高感度な方法です。 高品質で安価なレーザーアブレーションシステムは、ほとんどの顕微鏡に簡単に追加できます。 15時間を超えるタイムラプスイメージングには、ワームを慎重に固定する必要があります。

要約

タイムラプス顕微鏡に続くレーザー軸索切断はCの軸索再生の表現型の高感度アッセイであるエレガンス^1。このアッセイの主要な難しさは認知コスト（$ 25 - 100K）とレーザーアブレーションシステム^2,3を実装するために必要な技術的専門知識です。しかし、控えめなコスト（<$ 10K）の固体パルスレーザーは、ターゲットの軸索は、組織の表面に"近い"透明な製剤中のレーザーアブレーションのための堅牢な性能を提供することができます。システムの構築と配置は一日で達成することができます。アブレーションレーザーに焦点を当てたコンデンサーからの光が提供する光路は、便利な位置合わせガイドを提供します。削除されたすべての光学系との中間モジュールがアブレーションレーザーに専念しない光学素子は、レーザーアブレーションのセッション中に移動する必要はありませんことを保証することができます。中間モジュールのダイクロイックは同時イメージングとレーザーアブレーションすることができます。レーザービームtをセンタリングOは、焦点を絞った顕微鏡の集光レンズからの出射ビームは、システムの初期配置をガイドします。レンズの様々な条件に使用され、選択された対物レンズの背面に開口部を埋めるためにレーザービームを展開されています。最終的なアラインメントとテストは、フロント面のミラー化ガラスのスライドのターゲットで実行されます。レーザパワーは、最小サイズのアブレーションのスポット（<1um）を与えるために調整されます。アブレーションのスポットは、イメージングのウィンドウで修正が十字カーソルに最後の運動学的にマウントされているミラーの微調整で中央に配置されます。軸索切断用レーザパワーは、ターゲットのスライド上の最小アブレーションスポット（これは、使用するターゲットと異なる場合があります）に必要なより高い約10倍になります。ワームは、アガロースパッド（またはマイクロ流体室⁴内）に取り付けてレーザー軸索切断とタイムラプスイメージングのために固定化することができる。アガロースパッドは簡単に電子レンジで溶かしたバランスのとれた食塩水で10％アガロースで作られています。溶融アガロースの液滴をガラススライド上に配置され、別の平坦化されパッドにスライドガラスは、厚さ約200ミクロン（隣接したスライド上に時間のテープの単層は、スペーサとして使用されます）。 "シャーピー"キャップは13mmの均一な直径の円形パッドを切り出すために使用されます。彼らは、その左側に横たわっているように、麻酔薬（1ULムシモール20mMの）とミクロ​​スフェア（クリス牙 - 円私信）（1UL 2.65パーセントポリスチレン水中0.1 UM）は指向3月5日ワームに続いてパッドの中央に追加されます。ガラスのカバースリップが適用され、その後ワセリンはカバーを密封し、試料の蒸発を防ぐために使用されます。

プロトコル

1。レーザーアブレーションシステムの構築

レーザーの安全ゴーグルを着用し、初期アライメント時に適切なレーザーの安全対策を使用してください。レーザーがオンのときに接眼レンズに目を通してみてはいけません。

1. 図に示すようにブレッドボード上のコンポーネントを配置します。 1（また、例^2を参照）。レーザーをかき込む（ライザープレートと必要に応じて）、ペリスコープのポスト、そして高架鉄道がサポートしています。
2. レールの軸に合わせてお使いの顕微鏡を置きます。顕微鏡の集光レンズからの透過光のビームを合わせます。レールの高さ（レベルを使用する）、調節可能な開口部またはレールに固定されたレンズとの位置を合わせます。絞り値やレンズは集光ビームのレールの両端に揃える必要があります。ラボジャックは、レールの高さ調整を支援することができます。
3. グラントムソン偏光子とレーザービームの半波長板の位置を合わせます。この位置合わせを行うためのレーザーを必要としません。 BEAMは、ちょうど彼らの端を押すことなく両方を通過する必要があります。ビームダンプ（図1）のための便利な方向と位置を提供するために、偏光板を回転させる。あなたは、レーザパワーを調整するために半波長板を回転します。ブレッドボードに部品を固定します。
4. 、100パルスの周波数を設定し、レーザーで連続モードをオンにして、半波長板を使用して、最小の電力を節約。レーザービームを可視化するためにポストイットノートやレンズペーパーを使用してください。
5. 高架レールの端にマウントされているミラーに光をもたらすレーザーから順番に運動学的にマウントされたミラーを調整し、修正。レーザービームは、ミラーの中心にほぼ揃っている必要があります。ミラーはレーザービームの軸（図1）にほぼ45度向きでなければなりません。
6. 粗く潜望鏡の上、顕微鏡からの透過光ビームの中心にレーザービームを合わせてレールの端に運動学的にマウントされているミラーを調節する。レーザービームとtの両方彼は顕微鏡からの光ビームを送信ビーム経路に紙を挿入することによって、同時に可視化することができる。中間モジュール内の任意のNDフィルターと開口部が出たり、完全に開いていることを確認してください。
7. 細かくトップ潜望鏡とレールのミラーで微調整して透過光ビームの中心にレーザービームの位置を合わせます。近くに鉄道のミラーに紙を押さえ、トップ潜望鏡の鏡と透過光ビームの中心にレーザービームの位置を合わせます。顕微鏡のポートの近くに紙を持って、レールのミラーの調整（図2）と透過光ビームの中心にレーザービームの位置を合わせます。
8. 投稿、それは置いて整列コンデンサーレンズとオープン客観のタレットとの間のビーム経路に注意してください。あなたが中心に近づくほど小さく、レーザービームと透過光のビームが表示されるはずです。中央レーザービームへのレールのミラーで微調整を使用してください。クランプで固定顕微鏡を修正。

手順10.9から1.12はオプションですが、それはビームの拡大レンズを追加する前に整列し、レーザーアブレーションを評価するための簡単​​で便利です。

9. レーザーの電源をオフにし、機械的な安全シャッタを従事する。ビームのパスから50％のダイクロイックを回転させる。直接的なレーザー光が接眼レンズに渡さなくなったにもかかわらず、反射光は非常に激しいことができます。 60Xの石油を目的とした微細な位置合わせや画像のターゲットスライドをマウントします。スライド上の傷に焦点を当てる。中間モジュールのND4とND8フィルターに入れ。
10. イメージターゲットのあなたのCLSMによるスライド、回転するディスク、またはCCDカメラシステム。レーザーのパスに50％のダイクロイックを回転させる。 アブレーションのレーザーがオンになっている間はこの時点から、接眼レンズに目を通すことはありません 。 10にアブレーションレーザーをオンにして、トリガモードを設定し、100〜周波数、およびパルス数。電源がまだ半波長板と最小値に設定し、機械的な安全シャッタを開いていることを確認してください。あなたがsimultaneouできます画像スライとアブレーションレーザーを使用してください。
11. イメージング対象のスライドをしながら、アブレーションレーザーをトリガします。直径アブレーションスポット10から10 UMのターゲットスライドを確認してください。アブレーションのスポットが現れるまで連続してNDフィルタを削除します。レールの鏡と画像の中心にアブレーションのスポットを調整します。あなたが細かく<1 UMアブレーションのスポットを与えるために半波長板とレーザパワーを高めるために部屋を持つようにNDフィルタを再び追加することになるでしょう。 0.2ミクロン/ピクセル以下と細かく画像の中心（512 × 512の画像との位置256256）にアブレーションスポットを調整する時のイメージ。
12. レーザービームの焦点と軸の深さを確認してください。上焦点と上下1〜2 UMをし、アブレーションの位置とアブレーションのスポットサイズを確認してください。レーザービームが軸方向に整列されている場合はアブレーションのスポットは移動しません。未調整レーザービームは、数μm（焦点の上から下まで約3-5 UM）を支配する力を配布します。

2。客観的なバックを埋めるためにレーザービームを拡大するためレンズを追加絞りとフォーカスを制御するための収束を調整する

1. このシステムは、客観的な（10 mm）の背面開口部を埋めるためにレーザービームを拡大するデュアルガリレイビームエクスパンダを使用しています。キャリアへ4レンズをマウントし（L1f1 + L2f2とL3f1'+ L4f2'）レールに取り付けます。レーザービーム（図2）ので、すべてのレンズが同じ光軸でいることと正確に直交する位置を調整します。
2. レーザーの電源をオンにして最小電力と連続モードにそれを調整する。ほぼレーザービームと顕微鏡のコンデンサーからの透過光ビームを参照する紙を使用して、各レンズを介してビームのアライメントを調整します。オフにするとシャッターレーザーを。
3. 顕微鏡の一方の側からクランプを取り外し、レーザービームのパスから顕微鏡を引き出します。レーザーをオンにして、安全シャッターを削除します。
4. レンズとレーザビームの微細な位置合わせは、近くの壁に展開されたレーザービームを表示することによって行うことができます。時ルビームは対称的に展開し、縮小すべきnsesが移動されます。ビーム（図3）を合わせて最後の二つの運動学的にマウントされたミラーを調整します。
5. 整列および拡大ビームプロファイルが円形および均一な明るさ（図3）のはずです。ビームの大きさと均一性は、ポストイットは、客観的なバック開口部の推定位置に注意して見ることができます。
6. ビームは無限光学系にゼロ収束に調整する必要があります。あなたが投稿、それは移動すると、レンズから遠くに注意して収束がどのようにビームサイズの変化に注目することによって推定することができます。レーザーの電源をオフにし、メカニカルシャッターを従事する。
7. 正しいアラインメントを定義するために、固定クランプを使用してレーザービームのパスに再び顕微鏡をスライドさせて。顕微鏡のフリー側のクランプを取り付けますが、下に締めないでください。
8. レーザーをオンにして、安全シャッターを削除します。開いた位置に客観的なタレットを回転させる。投稿 - それは、ステージ上に配置に注意してください。あなたは、透過光のBを中心に拡張し、均一なレーザービームが表示されるはずですコンデンサーからのEAM（図4）。あなたは、顕微鏡のクランプを緩めて慎重に顕微鏡を少しずつ動かして、中心に調整が必要になることがあります。
9. 安全シャッタをかけます、そしてモードをトリガするためにレーザーを設定します。場所とイメージターゲットのスライド上の表面の傷の60X目的を回転させる。
10. 、安全シャッタを削除するアブレーションレーザーをトリガし、最小アブレーションのスポットのためのレーザパワーを調整します。アブレーションのスポットは円形と画像中心の5-10 UM内でなければなりません。
11. センター運動学的にマウントされているレールのミラーの微調整とアブレーションのスポット。あなたが繰り返しアブレーションのスポットの両方中央にレールマウントとトップ潜望鏡のミラーを調整し、均一なビームプロファイルを維持する必要があります。
12. 1μMのステップで上下に体系的にフォーカスを移動させるとアブレーションレーザーをトリガすることによって、レーザーのZフォーカスを評価します。 、拡大して整列、およびコンバージェンス調整ビームは、すべて1のUM ABで弱いかどうか、画像の焦点に最大限に切除してくださいオベまたは下の焦点（図5）。
13. ガリレオ望遠鏡のレンズL3（図2）を移動することによって展開されたビームのZフォーカスを調整します。

3。レーザー軸索切断と軸索再生のタイムラプス顕微鏡

1. 完全に溶けたまで平衡塩類溶液にマイクロ波10パーセントアガロース（RPI分子生物学グレードEEO 0.1 A20090）。取付けのための使用中にそれが溶融保つためにホットプレート上で設定します。
2. 溶融アガロースの液滴をガラススライド上に配置され、厚さ約200ミクロン（隣接したスライド上に時間のテープの単層をスペーサとして使用されている）パッドへの別のスライドガラスでフラット化されます。
3. "シャーピー"マ​​ーカーのキャップは、13mmの均一な直径の円形パッドを切り出すために使用されます。
4. 彼らは、その左側に横たわっているように、麻酔薬（1ULムシモール20mMの）とミクロ​​スフェア（クリス牙 - 円、私信）は（1UL 2.65パーセントポリスチレン水中0.1 UM）指向の3月5日ワームに続いてパッドの中央に追加されます。ガラスのカバースリップが適用され、その後Vaselさ伊根は、カバーガラスを密封し、試料（図6）の蒸発を防ぐために使用されます。
5. アブレーションレーザーは、各セッションの開始時に、上記のように、十字線に整列されます。レーザーの安全性のシャッターをかけます。
6. ターゲットニューロンの適切な蛍光マーカーを用いてレーザのアライメントターゲットとイメージマウント大人のワームを削除します。同様の倍率（0.2ミクロン/ピクセルまたは高倍率）と十字（図7）の下の位置で画像の軸索。
7. レーザーの安全性のシャッターを開き、イメージングしながらアブレーションレーザーを誘発する。レーザーをトリガした後、軸索を評価し、軸索が切断されるまで徐々にレーザーパワーを増加させる。あなたは、アライメントターゲットのスライド（1uJ / nsパルス程度）でアブレーションのスポットを形成するよりも軸索を切断するために10倍以上のレーザーパワーについては必要になります。我々は、典型的には約0.27mW（2500 Hzでの連続に設定されたコヒーレントFieldMaxIIのパワーメータとレーザーで試料で測定された平均電力）に設定さ2.5 kHzのと、電源投入時100パルスで切断。アブレーションレーザパワーの設定は、将来の実験（図7）に軸索を切断するための一貫性が維持されます。
8. うまくカット軸索は、2つの切断端部（図7）で明るさを失うことなく、0.5から1まで約UMの休憩が表示されます。明るさや大きなギャップ（2-10 UM）の大規模な損失がしばしばキャビテーション気泡による軸索を超える甚大な被害を意味する。近位と遠位軸索は、（図8およびムービー）の横を30分かけて後退電球を分離して形成されます。
9. あなたの時間の経過の記録を開始する前に30分間あなたの顕微鏡のステージを使用してマウントされているワームを平衡化させます。これにより、温度差とアガロースの収縮に起因するドリフトを最小限に抑えることができます。
10. ）タイムラプスイメージングパラメータは、システムに関連付けられているイメージングソフトウェアを使用して設定されます。ゲイン、ピンホール、スキャン速度、および必要な空間分解能を与えながら露出を最小限に抑えるためのイメージングレーザパワーの設定を使用して0.1から0.2ミクロン/ピクセルで我々は通常、イメージ10-20 Z手順（1um/step）。サンプリング間隔が一般的です希望の時間分解能（図8およびムービー）に応じて15時間以上1〜5分LY。
11. 時間経過の画像データは、NISの要素またはImageJを使ってムービーに変換されます。

4。代表的な結果：

このシステムを用いてレーザー軸索切断は信頼できるとルーチンです。図7に示す結果が典型的である。軸索再生のタイムラプスイメージングは​​、このプロトコルを使用して、非常に堅牢です。我々は日常的に電動ステージを使用して、単一のスライド上の5つのワームの5軸索にまでカットして画像。唯一の制限は、それはあなたが180秒ごとにサンプリングしている場合は、ほとんどで、9軸索（9スタック）を試すことができますして軸索のためのスタックを収集するために20秒かかる場合には、例えば、それぞれの軸索の画像を収集するために要する時間です。図8と図9に示す例では、良い代表的な結果です。実験の約10％は、この品質の結果を与える。残りの実験は、再生の表現型の良いデータを提供しますが、審美unappealですINGのため、一般的に固定化の5-8時間後に開始するワームの小さなジッタリング運動の。

1レーザーアブレーションシステムを示します 。 532nmのNd：YAGレーザーは、他のコンポーネントの高さにそれを持って来るためにライザープレート上にマウントし、ブレッドボードにボルトで固定されています。 （光アイソレータはオプションであり、おそらく必要はない）。グラントムソン偏光板と半波長板は、細かくレーザパワーを制御するために使用されます。彼らは、細かく校正された回転マウントになります。ビームダンプの設定を注意してください。コー​​ナーミラーは、下のペリスコープのミラーにレーザービームを指示します。上部のペリスコープのミラーは、レールのミラーに光を送ります。レールは、2つのロッドサポートされるプラットフォームに搭載されている。デュアルガリレイレンズはスライディングレールマウントに取り付けられている。アブレーションレーザーに特化した付加中間モジュールを注意してください。システムは、光アイソレを削除することで、よりコンパクトにすることができるTorとコーナーミラー、およびブレッドボードの背面の端にレーザー、グラントムソン偏光板と半波板の再配置。

図2デュアルガリレオコンディショニングレンズはゼロ収束の一様な10 mmのサイズに300 UM TEMooレーザービームを拡大するために使用されます。ラボジャッキは、レールを保持しているプラ​​ットフォームのいずれかの下に配置されている。これは、アライメントの手順中にレールの高さを調整するのに役立ちます。粗雑にレールにL1のレンズを装着し、位置合わせガイドとコンデンサーのビームを使用してレールの高さを調整します。コンデンサーのビームは、レールの両端にレンズの中央に揃うようにレールを調整します。これは、レールが、顕微鏡の光軸に平行に整列されていることを確認します。あなたはレールの光軸と一致する最初の顕微鏡を調整する必要があります。顕微鏡の位置を固定するクランプを使用してください（図1参照）。目を削除します。Eレールマウントレンズ。今はレールの両端のコンデンサーのビームの中心にレーザービームの位置を合わせます。ビームのパス内のホワイトペーパーでは、同時に両方のビームを参照する便利な方法です。レールマウントのミラーに近いコンデンサーのビームにレーザービームを整列するトップ潜望鏡のミラーを使用してください。レールは、レールの遠端（顕微鏡に近い）でコンデンサーのビームにレーザービームを揃えるためにミラーをマウント使用。図に示すように、今レールにすべての4つのレンズをマウントします。レールの長さ、レンズの焦点距離、そしてレンズの手配はご顕微鏡と物理的なセットアップに応じて異なります。重要なパラメータは、レーザビーム径と選択した目的の背面開口部の大きさです。無限光学系は完全に平行にレーザビームを（ゼロコンバージェンス）を当てます。 L1とL2の間の距離は、レンズの焦点距離は、F1 + F2の合計である必要があります、とL3とL4の間の距離は、それに応じてF1'+ F2'でなければなりません。目間の距離電子デュアルガリレオのペアは重要ではない。 L3の位置を微ビームの収束を制御するために調整することができます。<1mmの調整は、画像のフォーカスへレーザーの焦点を調整するために必要とされる。ビームのパス（または彼らは何をすべきかを認識し、それに応じてシステムを調整する）にあるかもしれない中間のモジュールからすべてのレンズ、フィルタ、開口部等を必ず削​​除してください。

デュアルガリレイレンズを通してレーザビームの3位置図 。顕微鏡は、光パスの外に移動することができますが、残りのクランプは、顕微鏡を正確に再配置できるようになるので、顕微鏡の一方の側から顕微鏡のクランプを外します。 レーザーの安全性を考える 。レーザパワーはグラントムソン偏光板と最小値に調整されていることを確認します。レーザーの電源を入れ、壁にレーザーのビームパターンを表示します。あなたが壁にテープで紙はレーザーを表示するのに役立つかもしれませんスポット。体系的に彼らはビームの大きさや外観に何の感触を得るためにレンズの位置を調整します。あなたは強烈なスポットが偏心調光器のプロファイルに格納されているパネル、のようなものが表示されるはずです。今すぐトップ潜望鏡を使用するパネルBに示すように中心に強烈なスポットを調整するためにレールマウントのミラーを使用するには、均一な周辺機器のプロファイルを与えるためにミラーを装着。すべてが正しく整列されている場合はこの時点でレンズを移動すると、ビームは対称的に拡大および縮小するために引き起こすことを見つける必要があります。図2に示すように開始位置に戻ってレンズを移動する。今客観的なバック開口部の距離でビームを傍受。それはあなたの背部開口部を埋めるのに十分な大きさは、少なくとも、均一な明るさで、円形でなければなりません。それが大きい場合、それは、あなたの切除のための十分なレーザーパワーを持っている限り、OKです。客観的なバックの開口部と壁の距離でビーム径を比較することによって収束を評価する。ビーム径すべきゼロ収束ビームに対して同一である。スケールバーは10mmです。

コンデンサーのビームに拡張されたレーザービームの4位置図 。シャッターレーザーをし、アライメントが停止としてクランプを使用してレーザービームのパスに再び顕微鏡を移動する。 、オンに合わせて、 強烈な反射されたレーザ光 ​​が参照されるのを防ぐために、接眼レンズを介して対物レンズ。 テープの紙を使用してコンデンサーのビームを当てる。開いた位置に客観的なタレットを回転させる。コンデンサーのビームを閉塞するためにステージ上で一枚の紙を置く。連続モードへのレーザーの電源を入れ、機械的な安全シャッタを削除します。あなたには、いくつかのレーザー光は顕微鏡も来るはずです。顕微鏡のクランプを緩め、ゆっくりとコンデンサーのビームとレーザービームを揃えるために顕微鏡を微調整する。レーザービームは円形および均一な明るさのはずです。それは時々adjuに便利です。レールマウントレンズST。あなたは、アライメントが正しいかどうか一様にレーザービームを拡大および縮小することができるはずです。あなたはレールマウントのミラーを持つ最小の中心のコンデンサーのビームにセンター契約レーザービームをしてから、目的のサイズに拡張することができます。いったんレールのミラーと契約ビームの位置を調整すると、拡張されたビームの均一な輝度を維持するためにトップマウントされている潜望鏡の鏡を再調整する必要があります。あなたが円形の中心のレーザービームを得ることができない場合、あなたは以前の位置合わせ手順を戻る必要があります。

図5センターアブレーションのスポットをし、最適なフォーカスのレーザービームの収束を調整する。オフにするとシャッターレーザーを。用紙を取り除いて、ミラー化されたターゲットのスライドを（また、ターゲット²とカバースリップ上恒久的なマーカーのインクを使用することができます）をマウント。 60と鏡面上の画像の傷今すぐX 1.4na油のレンズ）焦点またはCCDと画像面は、 レーザがオンになっている間は接眼レンズから目をしないでください 。電源をオンにして、レーザーをシャッターを開ける。モード、低い消費電力、および100Hzのをトリガするためにレーザーを設定します。 10パルスについては、トリガ。あなたは、ビューの中央の10 UM内の直径の1から5μmのアブレーションのスポットが表示されるはずです。あなたがアブレーションのスポットが表示されない場合には、5〜10％のステップでレーザパワーを増やすことができます。一度アブレーションスポット、ビ​​ューのフィールドに中心、それを識別する。 512x512の画像を表示する場合256、256の座標に十字カーソルを置きます。あなたが中心にレーザースポットを調整する場合、それはズームの位置を変更しません。中央の十字線にアブレーションのスポットを移動するレールマウントミラーを使用してください。図4で説明したように除去する目的でビームを見ることによって、レーザビームの均一性を再評価。トップ潜望鏡マウントされたミラーとビームの均一性を調整します。アブレーションのスポット位置の評価を繰り返します。これは、pを繰り返しているアブレーションのスポットが中心と拡張されたビームが均一になるまで繰り返されるべきrocess。行っている場合、正しくアブレーションのスポットは、図中のフォーカスでのアブレーションのスポットに見られるように円形になる。次のZ軸にレーザビームの焦点を評価する。中央に約1μmのアブレーションのスポットを生成するためにレーザーを誘発する。今すぐ横方向に5μmの約スライドを移動し、ターゲットのスライドの表面下に1μMの焦点を合わせる。最初にアブレーションのスポットのために使用されているのと同じレーザーの設定を使用してレーザーを誘発する。対象となるスライドの表面上に1μMのを中心にした後、繰り返します。レーザービームは、画像の焦点に集束されている場合、あなたはこの図に示されているようなパターンが表示されるはずです。最大のアブレーションのスポットは対称的に小さくなるはず下の画像のフォーカスと、上記のアブレーションのスポットやフォーカスに対応している必要があります。焦点面を合わせるためにレンズL3を調整します。顕微鏡からのレンズL3を移動すると、ビームはより収束になりますし、アブレーションのスポットが近づくに移動します客観的。小<1mmの調整が焦点の近くに必要となります。これで、軸索を切断する準備が整いました。スケールバーは1ミクロンです。

レーザー軸索切断とタイムラプスイメージングについては、 図6装着ワーム。生理食塩水でアガロース10％が完全に溶融まで加熱される。小滴をガラス顕微鏡スライド上に配置し、フラットパッドを形成するために別のスライドで平坦化される。パッドの厚さは、隣接する2つのスライドにテープによって設定されます。パッドは、約1分間に設定することが許可され、その後スライドが分離されている。 "シャーピー"トップは13ミリメートル程度の均一なサイズのパッドを形成するために、クッキーのカッターとして使用されます。 10mMのムシモールおよびマイクロスフェアの1μlの1 ULは、パッドの中心（ファング - 円私信）に追加されます。ワームは、カバーガラスに置く前に、2 uL程度の低下と指向に追加されます。ワセリンは、それを密封するカバースリップの端にシリンジ（20-25 GA。ニードル）から適用されます。

線虫 C. elegansにおけるレーザー軸索切断の7典型的な結果を示しています。にはまもなくレーザー軸索切断前後で無傷の軸索を見ることができます。ギャップは0.5 - 1um程度、通常です。 Bは、約1μm離れて近くの軸索を損傷することなく、ある軸索のレーザー軸索切断を示しています。レーザーは約10％の電力（2500 Hzで0.3 mWの平均値）、および100パルスに設定されていました。スケールバーは5μmのです。

図8。代表的な野生型L4再生。これは、軸索再生のアブレーションとタイムラプス録画を示す時系列です。まもなくレーザー軸索切断後0分であなたは、撤回の電球を見ることができます。 138分によって後退電球は、その最も遠い範囲に引き戻され、現在は改造に着手。散発的な膜の突起（mircospikesまたは糸状仮足）が軸索のシャフト（矢印138と324）に沿って見ることができます。市販右の切り株は、360分で整形式のコンパクトな成長円錐を拡張します。 414分の時点で、両方の切り株は、成長円錐を拡張しました。彼らは背側神経索（414、519、597分）に向かって延びるように、初期胚のような成長円錐は、ジストロフィーとなる。背部神経索（960分）の短いジストロフィー成長円錐のストール。矢頭は、近位断端と成長円錐を指摘する。矢印は、近位軸索の軸に沿って膜の突起を指摘する。スケールバーは20um。

ムービー1。野生型の軸索再生のムービー。この映画は、図8に示す時間点と一緒に行く。ワームプロトコルと軸索で説明するようにマウントされていたが、約10時間3分ごとに画像化した。 Zスタックは（20 × 1um）各時点で採取し、最大射影アルゴリズム（NISの要素）によって、単一の画像にマージされました。 映画を見て、ここをクリックしてください。

ディスカッション

さまざまなレーザーシステムを使用したレーザー顕微手術については、いくつかの良い議論があります^3,5-11。フェムト秒赤外レーザーは、細胞内レーザーアブレーションの「ゴールドスタンダード」であり¹² 、イメージング設備と組み合わせると便利ですが、多くの場合、個々のユーザーにとってはコストがかかりすぎます。イメージングの深さのためにサンプルのイメージングにフェムト秒IRレーザーが必要な場合は、おそらくレーザー軸索切開術にフェムト秒IRレーザーが必要になります。表面から30〜50 um以内のターゲット軸索を持つ透明な組織は、高NA浸漬レンズを介してターゲットを絞った20 uJ /パルス範囲の青色および緑色パルスレーザーでおそらく実現可能です。特にターゲット軸索の深さが増すにつれて、フェムト秒レーザーと比較して、ナノ秒レーザーとピコ秒レーザーでは、より多くの巻き添え損傷が生じます。 C.エレガンスは 透明で、すべての軸索は表面から20〜30μm以内にあります。私たちは、表面から5μm以内にある運動軸索を日常的に切断しています。また、キューティクル表面から約20um離れた神経輪内の軸索も簡単に切断しました。軸索を切断する限界は、成虫の直径で約30〜50μmであることがわかりました。ここで説明するレーザーアブレーションシステムは、標的軸索の透明度と深さの基準に適合する多くの異なる準備でうまく機能する可能性があります。それでも、フェムト秒赤外レーザーの理論上の利点を考えると、ナノおよびピコ秒の355 nmおよび532 nmレーザーがレーザー軸索切開術に非常に優れた性能を発揮するのは少し驚くべきことです 線 虫^6,13。ナノ秒440 nm、ナノ秒532 nm、およびフェムト秒IRレーザーを使用したレーザー軸索切開に応答して軸索再生に違いは見られません。

固体355nm UVレーザーは、532nmダイオード励起パッシブQスイッチ固体レーザーとほぼ同じコストですが、これらの短い波長を効率的に通過させるより高い出力または光学系のいずれかが必要です。ほとんどの光学系は、可視400〜700nmの光で良好に機能するように設計されています。355 nmレーザーには、プラズマ閾値の低減、スポットサイズの縮小、ロングパスダイクロイックなど、いくつかの利点⁶ があり、アブレーションレーザーの100%をターゲットに効率的に向け、サンプル信号を失うことなくGFPの同時イメージングが可能になります。青色の440nmレーザーは、可視光レーザーで作業する利点(標準的な光学系での優れた性能と安全性)を保持します。残念ながら、DPP Qスイッチソリッドステート440nmレーザーのコストは、現時点で同様の出力の355nmまたは532nmレーザーの3倍です。ターゲットの深さが最小限のC .エレガンス 用の新しいシステムを設計している場合、UV透過レンズ(355nmで50〜70%の透過率を持つ40X 1.3naオイルレンズで約3,000ドルの費用がかかります)と355nmレーザーを選択し、1〜20 kHzで5〜10 uJ/パルスを生成します。

軸索アブレーションはプラズマ形成によるものと考えられています。パルスが短いほど、より低い電力で血漿閾値が生成され、血漿量は小さくなります⁶.目標は、パルスエネルギーを最低電力に調整することにより、最小かつ寿命の短いプラズマを生成することです。寿命の長いプラズマが大きいほど、キャビテーション気泡が発生し、周囲の細胞に損傷を与えます。一般に、最高周波数(つまり2.5kHz)で約50〜100パルスを使用したアブレーションが最良の結果をもたらすことがわかりました。これは、損傷の程度をより適切に制御するために、一連のパルスにわたって損傷を徐々に統合できることを示唆しています。ここで説明するレーザーアブレーションシステムは、ビームが正確に位置合わせされ、拡張されていれば、非常に寛容です。成虫の軸索を10%のレーザー出力(2500Hzで測定された平均0.3 mW、推定1 uJ/パルス)で切断を開始し、14%の出力で限られた局所的な損傷で切断できます。15〜39%のレーザー出力でより広い範囲の損傷を観察できますが、40%の出力(2500Hzで測定された平均約1mW)を超えると、大きなキャビテーション気泡とワームのキューティクルの損傷によりワームが爆発します。

Steinmeyer et al. 2010² 論文は、レーザー アブレーション システムを構築するための優れたリソースです。Leon Avery は、安価な N2 ガス 337 nm レーザーに基づくレーザー アブレーション システムについても実用的な説明をしており、いくつかの素晴らしい実用的なアドバイスを提供しています (elegans.swmed.edu/Worm_labs/Avery/)。独自のシステムを設計するときは、まず顕微鏡の担当者と話し合って、アブレーションレーザーを顕微鏡の対物レンズにターゲットにする方法を決定する必要があります。顕微鏡は防振テーブル(Newport、TMI、Thor)に取り付ける必要があります。ブレッドボードトップが最適ですが、頑丈なスチール製トップは磁気ポジショナーでも使用できます。直立スコープの専用中間モジュールは、すべての光学素子を所定の位置に置いたままにしておくことができるので便利です。ただし、落射蛍光ポートに取り付けられたカメラポート(反転)または「コンバイナー」を使用する方が安価で便利な場合があります。使用する対物レンズの背面開口部のサイズと透過率(アブレーションレーザー波長)を知る必要があります。レーザー(Crylas、TEEM、Crystal、CRCなど)を決定したら、ThorまたはNewportに連絡して、正しい光学素子、ハードウェア、安全装置の選択について支援を受ける必要があります。スペースを節約するためにデュアルガリレオビームエキスパンダーに決めましたが、より単純なケプラービームエキスパンダーがオプションです(f2 / f1 =膨張係数)。カスタム ビーム エキスパンダーは最も安価ですが、ニューポート、トール、およびいくつかのレーザー メーカーは、優れた品質の商用ビーム エキスパンダーを提供しています。一部のレーザーメーカーは、費用対効果が高く省スペースである可能性がある手動および電子制御の減衰器も提供していますが、グラントンプソン偏光子や半波長板ほど汎用性が高くありません。また、レーザーの制御方法を決定する必要があります。LabViewベースのコントローラを設計したり、市販のTTLジェネレータ、またはレーザー会社が提供するソフトウェアを使用したりできます。特定のレーザーメーカーとオプションについて話し合ってください。

使用したハードウェアのリストは、一般的なガイドとしてのみ提供しています。ここで説明するシステムは、既存のイメージング システムに追加すると約 15,000 ドルの費用がかかりました。地元の物理学部には、フリービームレーザーを安全に使用するための実践的な紹介を提供してくれる人がいることがよくあります。

固定化とタイムラプスイメージングの代替方法 C. elegans 最近、説明されています。¹⁴名

トラブルシューティング

最も困難で重要なステップは、中央の拡張ビームを顕微鏡の光軸に合わせることです。ビームを中央に配置し、ガリレオレンズを通して拡張したら、ステアリングミラーを使用して中心に最終的に位置合わせする前に、顕微鏡の光軸から5μm以内にビームを位置合わせするように一生懸命作業する必要があります。ビームを顕微鏡に合わせるためにステアリングミラーを過度に使用すると、ビームエキスパンダーを介してビームが軸から外れてしまいます。細心 の注意を払って、 適切なNDフィルターでレーザービームを減衰させ、反射ターゲット(前面ミラー)でレーザービームプロファイルを直接表示できます。顕微鏡をそっと動かして、60倍の対物レンズ視野でビームを正確に中央に配置できます(上下の範囲でビームを中心に配置できない場合は、レールの高さを調整する必要があります)。ビームプロファイルを使用して、顕微鏡の光軸を正確に整列させ、円形で対称的に「フレア」する中心ビームを与えることができます。非対称フレアは、顕微鏡の軸が完全に位置合わせされていない(またはレールが水平ではない)ことを示しています。最後に、L3を調整して、ビームの均一で対称的な膨張と収縮を確認する必要があります。顕微鏡をターゲット表面に正確に焦点を合わせ、L3を調整してレーザービームを最小のスポットに焦点を合わせます。LSCMまたはCCDシステムを介して画像化した場合、レーザービームは中心から5um以内にあり、アブレーションスポットはZ焦点から1um以内にあることがわかります。

ワームを「爆破」したり、軸索を切断するために大きなキャビテーション気泡を一貫して生成したりしていることに気付いた場合、問題はアブレーションレーザーの微細な位置合わせである可能性が最も高いです。最小(<500nm)アブレーションスポットがZフォーカス(L3レンズとの収束調整)とXYフィデューシャリースポット(最後のキネマティックマウントミラーで調整)に局在していることを確認します。

表面に近い軸索をターゲットにすると、必要なレーザー出力が少なくなります。同様に、小型動物 (L1 および L2) は、成体の同じ軸索を標的とする場合と比較して、軸索切開に必要なレーザー出力が少なくなります。

野生型軸索が再生しない場合、または軸索が白化する場合は、イメージングレーザー出力を下げるか、サンプリングレートを下げてみてください。ワームが死んだり病気になったりした場合は、アガロースの割合を1%ステップで減らしてみてください。ワームを取り付けた後、カバーガラスを動かさないように注意してください。

タイムラプスセッション中にワームが破裂したり死んだりする場合は、次のことが原因です。1.アガロースの割合が高すぎます。2.アブレーションレーザーによるキューティクルの損傷。3.取り付け後のカバーガラスの動き。キューティクルの損傷が原因である場合、アブレーションレーザーの標的となったマウントされたワームにのみ影響します。

タイムラプスセッション中にワームが動きすぎる場合は、アガロースの割合を0.5%ステップで増やしてみてください。健康なワームの健康な軸索は常に「活性」であり、一定のレベルの蛍光を示します。蛍光や活性が突然低下した場合、ワームは死にかけているか死んでいます。複数のビーズ状または断片化された軸索は、ワームの死または死の確かな兆候です。

タイムラプスセッション全体を通して軸索に焦点を合わせ続けるのが難しい場合は、いくつかの異なる問題がある可能性があります。まず、スライドガラス上で不活性サンプルを10時間かけてイメージングして、ステージドリフトを確認します。数ミクロンのドリフトは熱不安定性が原因である可能性がありますが、5 μmを超えるのは顕微鏡の機械的な問題が原因である可能性があります。取り付けに関する問題はより一般的です。タイムラプスを開始する前に、取り付けられたワームを顕微鏡ステージと30分間平衡させます。タイムラプスセッション中にワセリンシールに漏れが発生していないことを確認してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント (オプション)
535 nm レーザー	Crylas	FDSS532Q3	(TEEM、Crystal、CRC も同等のレーザーを提供)
すべての光学系とハードウェア			(トールは同等の光学系とハードウェアを提供)
SUPREMA オプティカルマウント、直径 1.0 インチの	ニューポートコーポレーション	SS100-F2KN	2
1 "直径ポスト、1 "高さ	ニューポート株式会社	PS-1	1
1インチ径ポストフォーク	ニューポートコーポレーション	PS-F	1
無彩色ゼロ次ウェーブプレート、½波遅延、400-700nm	ニューポートコーポレーション	10RP52-1	1
回転ステージ、1インチ アペラチャー	ニューポートコーポレーション	RSP-1T	1
1 "直径ポスト、1 "高さニュー	ポートコーポレーション	PS-1	1
1インチ径ポストフォーク	ニューポートコーポレーション	PS-F	1
グランレーザー方解石偏光子、430-700nm	ニューポート コーポレーション	10GL08AR.14	1
偏光子回転マウント	ニューポート社	RM25A	1
¼「直径1インチポストニューポートコーポレーション用スペーサー	」	PS-0.25	1
½高さ、直径1インチポスト	ニューポートコーポレーション	PS-0.5	1
フォーク、直径1インチポストニュー	ポートコーポレーション	PS-F	1
ビームダンプ	ニューポート社製	PL15	1
顕微鏡対物レンズマウント	Newport Corp.	LH-OBJ1	1
1 "直径ポスト、1 "高さ	ニューポート株式会社	PS-1	1
1インチ径ポストフォーク	ニューポートコーポレーション	PS-F	1
高エネルギーNd:YAGレーザーミラー 直径25.4 mm、45°、532 nm	ニューポート	10Q20HE.2	4
SUPREMA オプティカルマウント、直径 1.0 インチ、クリアランス取り付け穴	Newport Corp.	SN100C-F	2
高精度ノブ調整ネジ 12.7mm トラベル 100TPI	ニューポート	AJS100-0.5K	4
スレッドアダプター、¼-20オス、8-32メス	ニューポートコーポレーション	SS-1-B	2
直径1.5インチ	Newport Corp.	340-RC	2
ロッド、高さ14インチ(35.5 cm)	ニューポートコーポレーション	40	1
X26用レールキャリア、正方形40mm長さ	ニューポートコーポレーション	CN26-40	4
スチールレール、長さ 384mm (15")	ニューポートコーポレーション	X26-384	1
ロッドプラットフォーム、直径1.5インチロッド	ニューポートコーポレーション	300-P	2
ロッド、高さ14インチ(35.5 cm)	ニューポートコーポレーション	40	2
平凹レンズ、直径12.7mm、-25mm EFL、430-700nm	ニューポートコーポレーション	KPC025AR.14	2
凸レンズ、直径25.4mm、50.2mm EFL、430-700nm	ニューポートコーポレーション	KPX082AR.14	1
平凸レンズ、直径25.4mm、62.9mm EFL、430-700nm	ニューポートコーポレーション	KPX085AR.14	1
レンズマウント、直径0.5インチ、軸高1.0インチ	ニューポートコーポレーション	LH-0.5	2
固定レンズマウント、直径1.0インチ、軸高1.0インチ	Newport Corp.	LH-1	2
マイクロスフェア 0.1um	Polysciences, Inc.	00876
アガロース	・リサーチ・プロダクツ・インターナショナル・コーポレーション	A20090	EEOの問題
Muscimol	Sigma-Aldrich	M1523