の軸索再生を研究するために、低予算レーザー軸索切断システムの構築 C.エレガンス</em

サマリー

レーザー軸索切断に続くタイムラプスイメージングは、C. elegansにおける変異が軸索再生に及ぼす影響を評価するための感度の高い手法です。高品質かつ安価なレーザーアブレーションシステムは、ほとんどの顕微鏡に容易に追加することが可能です。15時間にわたるタイムラプスイメージングには、線虫を慎重に固定する必要があります。

要約

タイムラプス顕微鏡に続くレーザー軸索切断はCの軸索再生の表現型の高感度アッセイであるエレガンス^1。このアッセイの主要な難しさは認知コスト（$ 25 - 100K）とレーザーアブレーションシステム^2,3を実装するために必要な技術的専門知識です。しかし、控えめなコスト（<$ 10K）の固体パルスレーザーは、ターゲットの軸索は、組織の表面に"近い"透明な製剤中のレーザーアブレーションのための堅牢な性能を提供することができます。システムの構築と配置は一日で達成することができます。アブレーションレーザーに焦点を当てたコンデンサーからの光が提供する光路は、便利な位置合わせガイドを提供します。削除されたすべての光学系との中間モジュールがアブレーションレーザーに専念しない光学素子は、レーザーアブレーションのセッション中に移動する必要はありませんことを保証することができます。中間モジュールのダイクロイックは同時イメージングとレーザーアブレーションすることができます。レーザービームtをセンタリングOは、焦点を絞った顕微鏡の集光レンズからの出射ビームは、システムの初期配置をガイドします。レンズの様々な条件に使用され、選択された対物レンズの背面に開口部を埋めるためにレーザービームを展開されています。最終的なアラインメントとテストは、フロント面のミラー化ガラスのスライドのターゲットで実行されます。レーザパワーは、最小サイズのアブレーションのスポット（<1um）を与えるために調整されます。アブレーションのスポットは、イメージングのウィンドウで修正が十字カーソルに最後の運動学的にマウントされているミラーの微調整で中央に配置されます。軸索切断用レーザパワーは、ターゲットのスライド上の最小アブレーションスポット（これは、使用するターゲットと異なる場合があります）に必要なより高い約10倍になります。ワームは、アガロースパッド（またはマイクロ流体室⁴内）に取り付けてレーザー軸索切断とタイムラプスイメージングのために固定化することができる。アガロースパッドは簡単に電子レンジで溶かしたバランスのとれた食塩水で10％アガロースで作られています。溶融アガロースの液滴をガラススライド上に配置され、別の平坦化されパッドにスライドガラスは、厚さ約200ミクロン（隣接したスライド上に時間のテープの単層は、スペーサとして使用されます）。 "シャーピー"キャップは13mmの均一な直径の円形パッドを切り出すために使用されます。彼らは、その左側に横たわっているように、麻酔薬（1ULムシモール20mMの）とミクロ​​スフェア（クリス牙 - 円私信）（1UL 2.65パーセントポリスチレン水中0.1 UM）は指向3月5日ワームに続いてパッドの中央に追加されます。ガラスのカバースリップが適用され、その後ワセリンはカバーを密封し、試料の蒸発を防ぐために使用されます。

プロトコル

1。レーザーアブレーションシステムの構築

レーザーの安全ゴーグルを着用し、初期アライメント時に適切なレーザーの安全対策を使用してください。レーザーがオンのときに接眼レンズに目を通してみてはいけません。

1. 図に示すようにブレッドボード上のコンポーネントを配置します。 1（また、例^2を参照）。レーザーをかき込む（ライザープレートと必要に応じて）、ペリスコープのポスト、そして高架鉄道がサポートしています。
2. レールの軸に合わせてお使いの顕微鏡を置きます。顕微鏡の集光レンズからの透過光のビームを合わせます。レールの高さ（レベルを使用する）、調節可能な開口部またはレールに固定されたレンズとの位置を合わせます。絞り値やレンズは集光ビームのレールの両端に揃える必要があります。ラボジャックは、レールの高さ調整を支援することができます。
3. グラントムソン偏光子とレーザービームの半波長板の位置を合わせます。この位置合わせを行うためのレーザーを必要としません。 BEAMは、ちょうど彼らの端を押すことなく両方を通過する必要があります。ビームダンプ（図1）のための便利な方向と位置を提供するために、偏光板を回転させる。あなたは、レーザパワーを調整するために半波長板を回転します。ブレッドボードに部品を固定します。
4. 、100パルスの周波数を設定し、レーザーで連続モードをオンにして、半波長板を使用して、最小の電力を節約。レーザービームを可視化するためにポストイットノートやレンズペーパーを使用してください。
5. 高架レールの端にマウントされているミラーに光をもたらすレーザーから順番に運動学的にマウントされたミラーを調整し、修正。レーザービームは、ミラーの中心にほぼ揃っている必要があります。ミラーはレーザービームの軸（図1）にほぼ45度向きでなければなりません。
6. 粗く潜望鏡の上、顕微鏡からの透過光ビームの中心にレーザービームを合わせてレールの端に運動学的にマウントされているミラーを調節する。レーザービームとtの両方彼は顕微鏡からの光ビームを送信ビーム経路に紙を挿入することによって、同時に可視化することができる。中間モジュール内の任意のNDフィルターと開口部が出たり、完全に開いていることを確認してください。
7. 細かくトップ潜望鏡とレールのミラーで微調整して透過光ビームの中心にレーザービームの位置を合わせます。近くに鉄道のミラーに紙を押さえ、トップ潜望鏡の鏡と透過光ビームの中心にレーザービームの位置を合わせます。顕微鏡のポートの近くに紙を持って、レールのミラーの調整（図2）と透過光ビームの中心にレーザービームの位置を合わせます。
8. 投稿、それは置いて整列コンデンサーレンズとオープン客観のタレットとの間のビーム経路に注意してください。あなたが中心に近づくほど小さく、レーザービームと透過光のビームが表示されるはずです。中央レーザービームへのレールのミラーで微調整を使用してください。クランプで固定顕微鏡を修正。

手順10.9から1.12はオプションですが、それはビームの拡大レンズを追加する前に整列し、レーザーアブレーションを評価するための簡単​​で便利です。

9. レーザーの電源をオフにし、機械的な安全シャッタを従事する。ビームのパスから50％のダイクロイックを回転させる。直接的なレーザー光が接眼レンズに渡さなくなったにもかかわらず、反射光は非常に激しいことができます。 60Xの石油を目的とした微細な位置合わせや画像のターゲットスライドをマウントします。スライド上の傷に焦点を当てる。中間モジュールのND4とND8フィルターに入れ。
10. イメージターゲットのあなたのCLSMによるスライド、回転するディスク、またはCCDカメラシステム。レーザーのパスに50％のダイクロイックを回転させる。 アブレーションのレーザーがオンになっている間はこの時点から、接眼レンズに目を通すことはありません 。 10にアブレーションレーザーをオンにして、トリガモードを設定し、100〜周波数、およびパルス数。電源がまだ半波長板と最小値に設定し、機械的な安全シャッタを開いていることを確認してください。あなたがsimultaneouできます画像スライとアブレーションレーザーを使用してください。
11. イメージング対象のスライドをしながら、アブレーションレーザーをトリガします。直径アブレーションスポット10から10 UMのターゲットスライドを確認してください。アブレーションのスポットが現れるまで連続してNDフィルタを削除します。レールの鏡と画像の中心にアブレーションのスポットを調整します。あなたが細かく<1 UMアブレーションのスポットを与えるために半波長板とレーザパワーを高めるために部屋を持つようにNDフィルタを再び追加することになるでしょう。 0.2ミクロン/ピクセル以下と細かく画像の中心（512 × 512の画像との位置256256）にアブレーションスポットを調整する時のイメージ。
12. レーザービームの焦点と軸の深さを確認してください。上焦点と上下1〜2 UMをし、アブレーションの位置とアブレーションのスポットサイズを確認してください。レーザービームが軸方向に整列されている場合はアブレーションのスポットは移動しません。未調整レーザービームは、数μm（焦点の上から下まで約3-5 UM）を支配する力を配布します。

2。客観的なバックを埋めるためにレーザービームを拡大するためレンズを追加絞りとフォーカスを制御するための収束を調整する

1. このシステムは、客観的な（10 mm）の背面開口部を埋めるためにレーザービームを拡大するデュアルガリレイビームエクスパンダを使用しています。キャリアへ4レンズをマウントし（L1f1 + L2f2とL3f1'+ L4f2'）レールに取り付けます。レーザービーム（図2）ので、すべてのレンズが同じ光軸でいることと正確に直交する位置を調整します。
2. レーザーの電源をオンにして最小電力と連続モードにそれを調整する。ほぼレーザービームと顕微鏡のコンデンサーからの透過光ビームを参照する紙を使用して、各レンズを介してビームのアライメントを調整します。オフにするとシャッターレーザーを。
3. 顕微鏡の一方の側からクランプを取り外し、レーザービームのパスから顕微鏡を引き出します。レーザーをオンにして、安全シャッターを削除します。
4. レンズとレーザビームの微細な位置合わせは、近くの壁に展開されたレーザービームを表示することによって行うことができます。時ルビームは対称的に展開し、縮小すべきnsesが移動されます。ビーム（図3）を合わせて最後の二つの運動学的にマウントされたミラーを調整します。
5. 整列および拡大ビームプロファイルが円形および均一な明るさ（図3）のはずです。ビームの大きさと均一性は、ポストイットは、客観的なバック開口部の推定位置に注意して見ることができます。
6. ビームは無限光学系にゼロ収束に調整する必要があります。あなたが投稿、それは移動すると、レンズから遠くに注意して収束がどのようにビームサイズの変化に注目することによって推定することができます。レーザーの電源をオフにし、メカニカルシャッターを従事する。
7. 正しいアラインメントを定義するために、固定クランプを使用してレーザービームのパスに再び顕微鏡をスライドさせて。顕微鏡のフリー側のクランプを取り付けますが、下に締めないでください。
8. レーザーをオンにして、安全シャッターを削除します。開いた位置に客観的なタレットを回転させる。投稿 - それは、ステージ上に配置に注意してください。あなたは、透過光のBを中心に拡張し、均一なレーザービームが表示されるはずですコンデンサーからのEAM（図4）。あなたは、顕微鏡のクランプを緩めて慎重に顕微鏡を少しずつ動かして、中心に調整が必要になることがあります。
9. 安全シャッタをかけます、そしてモードをトリガするためにレーザーを設定します。場所とイメージターゲットのスライド上の表面の傷の60X目的を回転させる。
10. 、安全シャッタを削除するアブレーションレーザーをトリガし、最小アブレーションのスポットのためのレーザパワーを調整します。アブレーションのスポットは円形と画像中心の5-10 UM内でなければなりません。
11. センター運動学的にマウントされているレールのミラーの微調整とアブレーションのスポット。あなたが繰り返しアブレーションのスポットの両方中央にレールマウントとトップ潜望鏡のミラーを調整し、均一なビームプロファイルを維持する必要があります。
12. 1μMのステップで上下に体系的にフォーカスを移動させるとアブレーションレーザーをトリガすることによって、レーザーのZフォーカスを評価します。 、拡大して整列、およびコンバージェンス調整ビームは、すべて1のUM ABで弱いかどうか、画像の焦点に最大限に切除してくださいオベまたは下の焦点（図5）。
13. ガリレオ望遠鏡のレンズL3（図2）を移動することによって展開されたビームのZフォーカスを調整します。

3。レーザー軸索切断と軸索再生のタイムラプス顕微鏡

1. 完全に溶けたまで平衡塩類溶液にマイクロ波10パーセントアガロース（RPI分子生物学グレードEEO 0.1 A20090）。取付けのための使用中にそれが溶融保つためにホットプレート上で設定します。
2. 溶融アガロースの液滴をガラススライド上に配置され、厚さ約200ミクロン（隣接したスライド上に時間のテープの単層をスペーサとして使用されている）パッドへの別のスライドガラスでフラット化されます。
3. "シャーピー"マ​​ーカーのキャップは、13mmの均一な直径の円形パッドを切り出すために使用されます。
4. 彼らは、その左側に横たわっているように、麻酔薬（1ULムシモール20mMの）とミクロ​​スフェア（クリス牙 - 円、私信）は（1UL 2.65パーセントポリスチレン水中0.1 UM）指向の3月5日ワームに続いてパッドの中央に追加されます。ガラスのカバースリップが適用され、その後Vaselさ伊根は、カバーガラスを密封し、試料（図6）の蒸発を防ぐために使用されます。
5. アブレーションレーザーは、各セッションの開始時に、上記のように、十字線に整列されます。レーザーの安全性のシャッターをかけます。
6. ターゲットニューロンの適切な蛍光マーカーを用いてレーザのアライメントターゲットとイメージマウント大人のワームを削除します。同様の倍率（0.2ミクロン/ピクセルまたは高倍率）と十字（図7）の下の位置で画像の軸索。
7. レーザーの安全性のシャッターを開き、イメージングしながらアブレーションレーザーを誘発する。レーザーをトリガした後、軸索を評価し、軸索が切断されるまで徐々にレーザーパワーを増加させる。あなたは、アライメントターゲットのスライド（1uJ / nsパルス程度）でアブレーションのスポットを形成するよりも軸索を切断するために10倍以上のレーザーパワーについては必要になります。我々は、典型的には約0.27mW（2500 Hzでの連続に設定されたコヒーレントFieldMaxIIのパワーメータとレーザーで試料で測定された平均電力）に設定さ2.5 kHzのと、電源投入時100パルスで切断。アブレーションレーザパワーの設定は、将来の実験（図7）に軸索を切断するための一貫性が維持されます。
8. うまくカット軸索は、2つの切断端部（図7）で明るさを失うことなく、0.5から1まで約UMの休憩が表示されます。明るさや大きなギャップ（2-10 UM）の大規模な損失がしばしばキャビテーション気泡による軸索を超える甚大な被害を意味する。近位と遠位軸索は、（図8およびムービー）の横を30分かけて後退電球を分離して形成されます。
9. あなたの時間の経過の記録を開始する前に30分間あなたの顕微鏡のステージを使用してマウントされているワームを平衡化させます。これにより、温度差とアガロースの収縮に起因するドリフトを最小限に抑えることができます。
10. ）タイムラプスイメージングパラメータは、システムに関連付けられているイメージングソフトウェアを使用して設定されます。ゲイン、ピンホール、スキャン速度、および必要な空間分解能を与えながら露出を最小限に抑えるためのイメージングレーザパワーの設定を使用して0.1から0.2ミクロン/ピクセルで我々は通常、イメージ10-20 Z手順（1um/step）。サンプリング間隔が一般的です希望の時間分解能（図8およびムービー）に応じて15時間以上1〜5分LY。
11. 時間経過の画像データは、NISの要素またはImageJを使ってムービーに変換されます。

4。代表的な結果：

このシステムを用いてレーザー軸索切断は信頼できるとルーチンです。図7に示す結果が典型的である。軸索再生のタイムラプスイメージングは​​、このプロトコルを使用して、非常に堅牢です。我々は日常的に電動ステージを使用して、単一のスライド上の5つのワームの5軸索にまでカットして画像。唯一の制限は、それはあなたが180秒ごとにサンプリングしている場合は、ほとんどで、9軸索（9スタック）を試すことができますして軸索のためのスタックを収集するために20秒かかる場合には、例えば、それぞれの軸索の画像を収集するために要する時間です。図8と図9に示す例では、良い代表的な結果です。実験の約10％は、この品質の結果を与える。残りの実験は、再生の表現型の良いデータを提供しますが、審美unappealですINGのため、一般的に固定化の5-8時間後に開始するワームの小さなジッタリング運動の。

1レーザーアブレーションシステムを示します 。 532nmのNd：YAGレーザーは、他のコンポーネントの高さにそれを持って来るためにライザープレート上にマウントし、ブレッドボードにボルトで固定されています。 （光アイソレータはオプションであり、おそらく必要はない）。グラントムソン偏光板と半波長板は、細かくレーザパワーを制御するために使用されます。彼らは、細かく校正された回転マウントになります。ビームダンプの設定を注意してください。コー​​ナーミラーは、下のペリスコープのミラーにレーザービームを指示します。上部のペリスコープのミラーは、レールのミラーに光を送ります。レールは、2つのロッドサポートされるプラットフォームに搭載されている。デュアルガリレイレンズはスライディングレールマウントに取り付けられている。アブレーションレーザーに特化した付加中間モジュールを注意してください。システムは、光アイソレを削除することで、よりコンパクトにすることができるTorとコーナーミラー、およびブレッドボードの背面の端にレーザー、グラントムソン偏光板と半波板の再配置。

図2デュアルガリレオコンディショニングレンズはゼロ収束の一様な10 mmのサイズに300 UM TEMooレーザービームを拡大するために使用されます。ラボジャッキは、レールを保持しているプラ​​ットフォームのいずれかの下に配置されている。これは、アライメントの手順中にレールの高さを調整するのに役立ちます。粗雑にレールにL1のレンズを装着し、位置合わせガイドとコンデンサーのビームを使用してレールの高さを調整します。コンデンサーのビームは、レールの両端にレンズの中央に揃うようにレールを調整します。これは、レールが、顕微鏡の光軸に平行に整列されていることを確認します。あなたはレールの光軸と一致する最初の顕微鏡を調整する必要があります。顕微鏡の位置を固定するクランプを使用してください（図1参照）。目を削除します。Eレールマウントレンズ。今はレールの両端のコンデンサーのビームの中心にレーザービームの位置を合わせます。ビームのパス内のホワイトペーパーでは、同時に両方のビームを参照する便利な方法です。レールマウントのミラーに近いコンデンサーのビームにレーザービームを整列するトップ潜望鏡のミラーを使用してください。レールは、レールの遠端（顕微鏡に近い）でコンデンサーのビームにレーザービームを揃えるためにミラーをマウント使用。図に示すように、今レールにすべての4つのレンズをマウントします。レールの長さ、レンズの焦点距離、そしてレンズの手配はご顕微鏡と物理的なセットアップに応じて異なります。重要なパラメータは、レーザビーム径と選択した目的の背面開口部の大きさです。無限光学系は完全に平行にレーザビームを（ゼロコンバージェンス）を当てます。 L1とL2の間の距離は、レンズの焦点距離は、F1 + F2の合計である必要があります、とL3とL4の間の距離は、それに応じてF1'+ F2'でなければなりません。目間の距離電子デュアルガリレオのペアは重要ではない。 L3の位置を微ビームの収束を制御するために調整することができます。<1mmの調整は、画像のフォーカスへレーザーの焦点を調整するために必要とされる。ビームのパス（または彼らは何をすべきかを認識し、それに応じてシステムを調整する）にあるかもしれない中間のモジュールからすべてのレンズ、フィルタ、開口部等を必ず削​​除してください。

デュアルガリレイレンズを通してレーザビームの3位置図 。顕微鏡は、光パスの外に移動することができますが、残りのクランプは、顕微鏡を正確に再配置できるようになるので、顕微鏡の一方の側から顕微鏡のクランプを外します。 レーザーの安全性を考える 。レーザパワーはグラントムソン偏光板と最小値に調整されていることを確認します。レーザーの電源を入れ、壁にレーザーのビームパターンを表示します。あなたが壁にテープで紙はレーザーを表示するのに役立つかもしれませんスポット。体系的に彼らはビームの大きさや外観に何の感触を得るためにレンズの位置を調整します。あなたは強烈なスポットが偏心調光器のプロファイルに格納されているパネル、のようなものが表示されるはずです。今すぐトップ潜望鏡を使用するパネルBに示すように中心に強烈なスポットを調整するためにレールマウントのミラーを使用するには、均一な周辺機器のプロファイルを与えるためにミラーを装着。すべてが正しく整列されている場合はこの時点でレンズを移動すると、ビームは対称的に拡大および縮小するために引き起こすことを見つける必要があります。図2に示すように開始位置に戻ってレンズを移動する。今客観的なバック開口部の距離でビームを傍受。それはあなたの背部開口部を埋めるのに十分な大きさは、少なくとも、均一な明るさで、円形でなければなりません。それが大きい場合、それは、あなたの切除のための十分なレーザーパワーを持っている限り、OKです。客観的なバックの開口部と壁の距離でビーム径を比較することによって収束を評価する。ビーム径すべきゼロ収束ビームに対して同一である。スケールバーは10mmです。

コンデンサーのビームに拡張されたレーザービームの4位置図 。シャッターレーザーをし、アライメントが停止としてクランプを使用してレーザービームのパスに再び顕微鏡を移動する。 、オンに合わせて、 強烈な反射されたレーザ光 ​​が参照されるのを防ぐために、接眼レンズを介して対物レンズ。 テープの紙を使用してコンデンサーのビームを当てる。開いた位置に客観的なタレットを回転させる。コンデンサーのビームを閉塞するためにステージ上で一枚の紙を置く。連続モードへのレーザーの電源を入れ、機械的な安全シャッタを削除します。あなたには、いくつかのレーザー光は顕微鏡も来るはずです。顕微鏡のクランプを緩め、ゆっくりとコンデンサーのビームとレーザービームを揃えるために顕微鏡を微調整する。レーザービームは円形および均一な明るさのはずです。それは時々adjuに便利です。レールマウントレンズST。あなたは、アライメントが正しいかどうか一様にレーザービームを拡大および縮小することができるはずです。あなたはレールマウントのミラーを持つ最小の中心のコンデンサーのビームにセンター契約レーザービームをしてから、目的のサイズに拡張することができます。いったんレールのミラーと契約ビームの位置を調整すると、拡張されたビームの均一な輝度を維持するためにトップマウントされている潜望鏡の鏡を再調整する必要があります。あなたが円形の中心のレーザービームを得ることができない場合、あなたは以前の位置合わせ手順を戻る必要があります。

図5センターアブレーションのスポットをし、最適なフォーカスのレーザービームの収束を調整する。オフにするとシャッターレーザーを。用紙を取り除いて、ミラー化されたターゲットのスライドを（また、ターゲット²とカバースリップ上恒久的なマーカーのインクを使用することができます）をマウント。 60と鏡面上の画像の傷今すぐX 1.4na油のレンズ）焦点またはCCDと画像面は、 レーザがオンになっている間は接眼レンズから目をしないでください 。電源をオンにして、レーザーをシャッターを開ける。モード、低い消費電力、および100Hzのをトリガするためにレーザーを設定します。 10パルスについては、トリガ。あなたは、ビューの中央の10 UM内の直径の1から5μmのアブレーションのスポットが表示されるはずです。あなたがアブレーションのスポットが表示されない場合には、5〜10％のステップでレーザパワーを増やすことができます。一度アブレーションスポット、ビ​​ューのフィールドに中心、それを識別する。 512x512の画像を表示する場合256、256の座標に十字カーソルを置きます。あなたが中心にレーザースポットを調整する場合、それはズームの位置を変更しません。中央の十字線にアブレーションのスポットを移動するレールマウントミラーを使用してください。図4で説明したように除去する目的でビームを見ることによって、レーザビームの均一性を再評価。トップ潜望鏡マウントされたミラーとビームの均一性を調整します。アブレーションのスポット位置の評価を繰り返します。これは、pを繰り返しているアブレーションのスポットが中心と拡張されたビームが均一になるまで繰り返されるべきrocess。行っている場合、正しくアブレーションのスポットは、図中のフォーカスでのアブレーションのスポットに見られるように円形になる。次のZ軸にレーザビームの焦点を評価する。中央に約1μmのアブレーションのスポットを生成するためにレーザーを誘発する。今すぐ横方向に5μmの約スライドを移動し、ターゲットのスライドの表面下に1μMの焦点を合わせる。最初にアブレーションのスポットのために使用されているのと同じレーザーの設定を使用してレーザーを誘発する。対象となるスライドの表面上に1μMのを中心にした後、繰り返します。レーザービームは、画像の焦点に集束されている場合、あなたはこの図に示されているようなパターンが表示されるはずです。最大のアブレーションのスポットは対称的に小さくなるはず下の画像のフォーカスと、上記のアブレーションのスポットやフォーカスに対応している必要があります。焦点面を合わせるためにレンズL3を調整します。顕微鏡からのレンズL3を移動すると、ビームはより収束になりますし、アブレーションのスポットが近づくに移動します客観的。小<1mmの調整が焦点の近くに必要となります。これで、軸索を切断する準備が整いました。スケールバーは1ミクロンです。

レーザー軸索切断とタイムラプスイメージングについては、 図6装着ワーム。生理食塩水でアガロース10％が完全に溶融まで加熱される。小滴をガラス顕微鏡スライド上に配置し、フラットパッドを形成するために別のスライドで平坦化される。パッドの厚さは、隣接する2つのスライドにテープによって設定されます。パッドは、約1分間に設定することが許可され、その後スライドが分離されている。 "シャーピー"トップは13ミリメートル程度の均一なサイズのパッドを形成するために、クッキーのカッターとして使用されます。 10mMのムシモールおよびマイクロスフェアの1μlの1 ULは、パッドの中心（ファング - 円私信）に追加されます。ワームは、カバーガラスに置く前に、2 uL程度の低下と指向に追加されます。ワセリンは、それを密封するカバースリップの端にシリンジ（20-25 GA。ニードル）から適用されます。

線虫 C. elegansにおけるレーザー軸索切断の7典型的な結果を示しています。にはまもなくレーザー軸索切断前後で無傷の軸索を見ることができます。ギャップは0.5 - 1um程度、通常です。 Bは、約1μm離れて近くの軸索を損傷することなく、ある軸索のレーザー軸索切断を示しています。レーザーは約10％の電力（2500 Hzで0.3 mWの平均値）、および100パルスに設定されていました。スケールバーは5μmのです。

図8。代表的な野生型L4再生。これは、軸索再生のアブレーションとタイムラプス録画を示す時系列です。まもなくレーザー軸索切断後0分であなたは、撤回の電球を見ることができます。 138分によって後退電球は、その最も遠い範囲に引き戻され、現在は改造に着手。散発的な膜の突起（mircospikesまたは糸状仮足）が軸索のシャフト（矢印138と324）に沿って見ることができます。市販右の切り株は、360分で整形式のコンパクトな成長円錐を拡張します。 414分の時点で、両方の切り株は、成長円錐を拡張しました。彼らは背側神経索（414、519、597分）に向かって延びるように、初期胚のような成長円錐は、ジストロフィーとなる。背部神経索（960分）の短いジストロフィー成長円錐のストール。矢頭は、近位断端と成長円錐を指摘する。矢印は、近位軸索の軸に沿って膜の突起を指摘する。スケールバーは20um。

ムービー1。野生型の軸索再生のムービー。この映画は、図8に示す時間点と一緒に行く。ワームプロトコルと軸索で説明するようにマウントされていたが、約10時間3分ごとに画像化した。 Zスタックは（20 × 1um）各時点で採取し、最大射影アルゴリズム（NISの要素）によって、単一の画像にマージされました。 映画を見て、ここをクリックしてください。

ディスカッション

異なるレーザーシステムを用いたレーザー微小手術については、いくつかの優れた議論がなされています^3,5-11。フェムト秒IRレーザーは、細胞内レーザーアブレーションの「ゴールドスタンダード」であり¹²、イメージング設備と併用すれば便利ですが、個々のユーザーにとってコストが高すぎる場合が多くあります。イメージングの深さの関係でサンプルのイメージングにフェムト秒IRレーザーが必要な場合は、レーザー軸索切断（axotomy）にも同様のレーザーが必要になるでしょう。標的となる軸索が表面から30-50 um以内にある透明な組織であれば、高NA浸液レンズを用いて照射した20 uJ/pulse範囲の青色および緑色パルスレーザーで対応可能と考えられます。ナノ秒およびピコ秒レーザーでは、特に標的軸索の深さが増すにつれて、フェムト秒レーザーと比較して側副的な損傷が多くなります。C. elegansは透明であり、すべての軸索は表面から20-30 um以内にあります。我々は通常、表面から5 um以内にある運動軸索を切断しています。また、クチクラ表面から約20 umにある神経リング内の軸索も容易に切断できました。成虫の直径を通じた軸索切断の限界は約30-50 umであることがわかりました。ここで述べるレーザーアブレーションシステムは、透明性と標的軸索の深さという基準を満たす多くの異なる準備試料でうまく機能すると考えられます。それでも、フェムト秒IRレーザーの理論的な利点を考慮すると、ナノ秒およびピコ秒の355 nmおよび532 nmレーザーがC. elegansのレーザー軸索切断においてこれほど優れた性能を示すことは少々驚くべきことです^6,13。ナノ秒440 nm、ナノ秒532 nm、およびフェムト秒IRレーザーによるレーザー軸索切断に対する軸索再生において、我々は差異を認めていません。

固体355 nm UVレーザーは、532 nmのダイオード励起パッシブQスイッチ固体レーザーとほぼ同等のコストですが、より高い出力、またはこれらの短波長を効率的に透過させる光学系を必要とします。ほとんどの光学系は、可視光の400-700 nmで良好に動作するように設計されています。355 nmレーザーを用いると、プラズマ閾値の低下やスポットサイズの縮小などの利点があり⁶、またロングパスダイクロイックミラーを使用することで、アブレーションレーザーを100%効率的にターゲットへ導き、サンプル信号を損なうことなくGFPの同時イメージングが可能になります。青色の440 nmレーザーは、可視光レーザーで動作させる利点（標準的な光学系での良好な性能と安全性）を維持できます。しかし残念ながら、現時点ではDPP Qスイッチ固体440 nmレーザーのコストは、同出力の355 nmまたは532 nmレーザーの3倍になります。ターゲットの深さが最小限であるC. elegans用の新システムを設計する場合、UV透過レンズ（355 nmで透過率50-70%の40X 1.3na油浸レンズでコストは約3,000ドル）と、1-20 kHzで5-10 uJ/pulseを出力する355 nmレーザーを選択します。

軸索切除は、プラズマの形成に起因すると考えられています。パルス幅を短くすると、より低い出力でプラズマ閾値に達し、プラズマ体積も小さくなります⁶。目的は、パルスエネルギーを最低出力に調整することで、最小かつ最短寿命のプラズマを生成することです。寿命の長い大きなプラズマはキャビテーション気泡を発生させ、周囲の細胞に損傷を与えます。一般的に、最高周波数（すなわち 2.5kHz）で約 50-100 パルスの切除を行うことが最良の結果をもたらすことがわかっています。これは、一連のパルスにわたって損傷を徐々に蓄積させることで、損傷範囲をより適切に制御できることを示唆しています。ここで説明するレーザー切除システムは、ビームが正確に整列され、拡大されていれば、非常に許容範囲が広いです。成虫の軸索切断は、レーザー出力 10%（2500 Hz で測定した平均 0.3 mW、推定 1 uJ/pulse）から開始し、14% の出力までであれば局所的な損傷を限定して切断することが可能です。15-39% のレーザー出力では損傷範囲が拡大するのが観察されますが、出力が 40%（2500 Hz で測定した平均 約 1 mW）を超えると、大きなキャビテーション気泡による影響とクチクラへの損傷により、虫体が破裂します。

Steinmeyerら（2010年）²の論文は、レーザーアブレーションシステムの構築における優れたリソースです。また、Leon Averyは、安価なN2ガス337 nmレーザーに基づいたレーザーアブレーションシステムの優れた実用的解説を掲載しており、非常に有用な実用的アドバイスを提供しています（elegans.swmed.edu/Worm_labs/Avery/）。独自のシステムを設計する際は、まず顕微鏡の担当者に相談し、アブレーションレーザーをどのように顕微鏡対物レンズに導くかを決定する必要があります。顕微鏡は振動絶縁テーブル（Newport、TMI、Thorなど）に設置してください。ブレッドボード天板が最適ですが、マグネットポジションナーを使用すれば、強固なスチール製天板でも使用可能です。正立顕微鏡の専用中間モジュールを使用すると、すべての光学素子をそのまま配置できるため便利です。しかし、カメラポート（倒立顕微鏡）や、エピ蛍光ポートに取り付けた「コンバイナー」を使用する方が、費用を抑えられ、利便性が高い場合があります。使用予定の対物レンズの後方開口径と（アブレーションレーザーの波長における）透過率を把握しておく必要があります。レーザー（例：Crylas、TEEM、Crystal、CRCなど）を決定したら、適切な光学素子、ハードウェア、および安全装置の選定について、ThorまたはNewportに相談してください。本研究では、省スペース化のために二重ガリレオ式ビームエキスパンダーを採用しましたが、より単純なケプラー式エキスパンダーも選択肢となります（f2/f1＝拡大率）。カスタムのビームエキスパンダーが最も安価になりますが、NewportやThor、および複数のレーザーメーカーが高品質な市販のビームエキスパンダーを提供しています。一部のレーザーメーカーは、コスト効率が良く省スペースな手動または電子制御のアッテネーター（減衰器）も提供していますが、Glan-Thompson偏光子と半波長板ほどの汎用性はありません。また、レーザーの制御方法を決定する必要があります。LabViewベースのコントローラーを設計するか、市販のTTLジェネレーター、またはレーザー会社が提供するソフトウェアを使用できます。具体的なオプションについては、各レーザーメーカーと協議してください。

使用したハードウェアのリストは、あくまで一般的なガイドとして提供しています。ここに記載したシステムを既存のイメージングシステムに追加した際の費用は約$15,000でした。多くの場合、地域の物理学部などの専門部署に、フリービームレーザーを安全に取り扱うための実践的な導入を指導してくれる担当者がいるはずです。

C. elegansの固定およびタイムラプスイメージングのための代替手法が近年報告されています。¹⁴

トラブルシューティング

最も困難で重要なステップは、中心に合わせ展開されたビームを顕微鏡の光軸に整合させることです。ガリレイレンズを通してビームを中心させ展開させた後、ステアリングミラーを用いて最終的な中心合わせを行う前に、ビームを顕微鏡の光軸から5 um以内に整合させるよう努めてください。顕微鏡へのビーム整合にステアリングミラーを過度に使用すると、ビームエキスパンダーを通過する際の軸がずれてしまいます。細心の注意を払いながら、適切なNDフィルターでレーザービームを減衰させ、反射ターゲット（表面鏡）上でレーザービームプロファイルを直接観察します。顕微鏡を慎重に微動させ、60X対物レンズの視野内でビームを正確に中心に合わせます（上下の調整範囲内で中心に合わせられない場合は、レールの高さを調整する必要があります）。ビームプロファイルを用いて顕微鏡の光軸を正確に整合させ、中心に位置し、円形で対称的に「フレア」が生じているビームにします。フレアが非対称であることは、顕微鏡の軸が完全に整合していない（またはレールが水平ではない）ことを示しています。最後に、L3を調整し、ビームが均一かつ対称的に拡大・縮小することを確認します。顕微鏡をターゲット表面に正確にフォーカスさせ、次にL3を調整してレーザービームを最小のスポットに集光させます。これで、LSCMまたはCCDシステムで結像させた際にレーザービームが中心から5 um以内にあり、アブレーションスポットがZフォーカスから1um以内にあるはずです。

もし、虫が「破裂」したり、軸索を切断する際に大きなキャビテーション気泡が絶えず発生したりする場合は、多くの場合、アブレーションレーザーの微調整に問題があります。最小（<500nm）のアブレーションスポットが、Z方向の焦点（L3レンズで収束を調整）およびXY方向のリファレンススポット（最後のキネマティックマウントミラーで調整）に正確に位置していることを確認してください。

表面に近い軸索を標的にする場合、必要となるレーザー出力は少なくなります。同様に、成体で同じ軸索を標的にする場合と比較して、より小型の個体（L1およびL2）で軸索切断を行うには、より少ないレーザー出力で済みます。

野生型の軸索が再生しない場合や、軸索の退色（ブリーチング）が起こる場合は、イメージング用レーザーの出力を下げるか、サンプリングレートを下げて試してください。線虫が死亡したり、不健康な状態になったりする場合は、アガロースの濃度を1%刻みで下げて調整してください。線虫をマウントした後は、カバーガラスを動かさないように注意してください。高濃度のアガロースとマイクロスフィアを使用している場合、カバーガラスを動かすことで線虫が死亡することがよくあります。

タイムラプス撮影中に線虫が破裂または死亡した場合、その原因は以下の通りです：1. アガロース濃度が高すぎる。2. アブレーションレーザーによるクチクラへの損傷。3. マウント後のカバーガラスの移動。クチクラへの損傷が原因である場合は、アブレーションレーザーの照射対象となったマウント個体のみに影響が現れます。

タイムラプス撮影中に線虫が動きすぎる場合は、アガロースの濃度を0.5%刻みで上げてみてください。健康な線虫の健康な軸索は常に「活性」しており、一定レベルの蛍光を示します。蛍光や活性が急激に低下した場合は、線虫が死にかけているか、あるいは死んでいます。複数の数珠状または断片化した軸索が見られるのは、線虫が死にかけているか死んでいる確実な兆候です。

タイムラプス撮影の全セッションを通じて軸索のフォーカスを維持できない場合は、いくつかの異なる原因が考えられます。まず、ガラススライド上の不活性サンプルを10時間かけて撮影し、ステージドリフトを確認してください。数 µm のドリフトは熱的不安定性に起因することがありますが、5 µm を超える場合は、顕微鏡の機械的な問題である可能性が高いです。また、マウントに関する問題の方が一般的です。タイムラプスを開始する前に、マウントした線虫を顕微鏡ステージ上で30分間静置させ、平衡状態にしてください。また、タイムラプスセッションの途中で、ワセリンによる密封部に漏れが生じていないかを確認してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬名	メーカー	カタログ番号	備考（任意）
535 nm レーザー	Crylas	FDSS532Q3	（TEEM、Crystal、CRC社からも同等のレーザーが提供されています）
すべての光学部品およびハードウェア			（Thor社からも同等の光学部品およびハードウェアが提供されています）
SUPREMA 光学マウント、直径 1.0-in	Newport Corp.	SS100-F2KN	2
直径 1" ポスト、高さ 1"	Newport Corp.	PS-1	1
直径 1" ポストフォーク	Newport Corp.	PS-F	1
色消しゼロ次波長板、½ 波長遅延、400-700nm	Newport Corp.	10RP52-1	1
回転ステージ、開口径 1"	Newport Corp.	RSP-1T	1
直径 1" ポスト、高さ 1"	Newport Corp.	PS-1	1
直径 1" ポストフォーク	Newport Corp.	PS-F	1
グランレーザー方解石偏光子、430-700nm	Newport Corp.	10GL08AR.14	1
偏光子回転マウント	Newport Corp.	RM25A	1
直径 1" ポスト用 ¼" スペーサー	Newport Corp.	PS-0.25	1
高さ ½"、直径 1" ポスト	Newport Corp.	PS-0.5	1
フォーク、直径 1" ポスト	Newport Corp.	PS-F	1
ビームダンプ	Newport Corp.	PL15	1
顕微鏡対物レンズマウント	Newport Corp.	LH-OBJ1	1
直径 1" ポスト、高さ 1"	Newport Corp.	PS-1	1
直径 1" ポストフォーク	Newport Corp.	PS-F	1
高エネルギー Nd:YAG レーザーミラー、直径 25.4 mm、45°、532 nm	Newport Corp.	10Q20HE.2	4
SUPREMA 光学マウント、直径 1.0 inch、クリアランス取付穴	Newport Corp.	SN100C-F	2
高精度ノブ調整ネジ、移動量 12.7mm、100TPI	Newport Corp.	AJS100-0.5K	4
ネジアダプタ、¼-20 オス、8-32 メス	Newport Corp.	SS-1-B	2
直径 1.5 inch ロッド用ロッドクランプ	Newport Corp.	340-RC	2
ロッド、高さ 14 inch (35.5 cm)	Newport Corp.	40	1
X26用レールキャリア、正方形 40mm 長	Newport Corp.	CN26-40	4
スチールレール、長さ 384mm (15")	Newport Corp.	X26-384	1
直径 1.5 inch ロッド用ロッドプラットフォーム	Newport Corp.	300-P	2
ロッド、高さ 14 inch (35.5 cm)	Newport Corp.	40	2
平凹レンズ、直径 12.7mm、-25mm EFL、430-700nm	Newport Corp.	KPC025AR.14	2
平凸レンズ、直径 25.4mm、50.2mm EFL、430-700nm	Newport Corp.	KPX082AR.14	1
平凸レンズ、直径 25.4mm、62.9mm EFL、430-700nm	Newport Corp.	KPX085AR.14	1
固定レンズマウント、直径 0.5"、軸高さ 1.0"	Newport Corp.	LH-0.5	2
固定レンズマウント、直径 1.0"、軸高さ 1.0"	Newport Corp.	LH-1	2
マイクロスフィア 0.1um	Polysciences, Inc.	00876
アガロース	Research Products International Corp.	A20090	EEO matters
ムシモール	Sigma-Aldrich	M1523