層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

Summary

我々は、無菌連続流回路における層流のせん断応力を受ける接着細胞への方法を記述しています。細胞の接着、形態は、透明なチャンバーを通過代謝物の分析と将来の実験や培養のためのせん断曝露後に細胞を回収するための回路から得られた試​​料を研究することができる。

Abstract

この方法の全体的な目標は、層流の条件に接着細胞をさらすとよく定量化流体のせん断¹ストレスへの応答を評価する手法を説明することです。

私たちのフローチャンバーの設計とフローの回路（ 図1）は 、フロー中の様々な時点（ 図11C）で、フロー（ 図11A、B）の直前に細胞の形態の細胞接着とイメージングのテストを可能にする透過的な表示領域が含まれています、そして後のフロー（ 図11D）。これらの実験は、ヒト臍帯血由来内皮前駆細胞（EPC）とブタEPCは^2,3に図示されている。

また、このメソッドは、他の接着細胞タイプ、例えば平滑筋細胞（平滑筋細胞）または線維芽細胞に適用可能である。

チャンバーと回路のすべての部分が容易に蒸気オートクレーブで滅菌されています。他のとは対照的にチャンバは、例えば、マイクロ流体チャンバー、セル（セルサイズに応じて> 1万円）の多数は、細胞培養や他の実験で、例えば、DNAまたはRNAの抽出、または免疫組織化学（ 図11E）のための無菌条件下での流動実験後に回収することができますまたは電子顕微鏡^5をスキャン。せん断応力は、灌流液の流量、流体の粘度、またはチャネルの高さと幅を変えることによって調整することができます。一次元の流れが維持されることを確保しながら、後者は流体の体積やセルのニーズを減らすことができます。チャンバーの高さが大きく、複数の実験のしやすさを増大させるガスケットの使用、に依存しないので、それは、実験の間にチャンバーの高さを測定する必要はありません。さらに、回路設計が簡単に解析および/ ​​または流体せん断応力の曝露で細胞から分泌される代謝物の定量、例えば、一酸化窒素（ 図^12）6灌流液サンプルの収集を可能にします

Protocol

1。内皮前駆細胞の分離

1. 前の末梢ヒト血液中の任意のコレクションに、あなたの治験審査委員会（IRB）にあなたの研究プロトコルを提出し、その承認の後、ボランティアのドナーのインフォームドコンセント（末梢血のコレクションとEPC単離はデューク大学のIRBによって承認されていた入手し、 ）ヒトの研究の参加者の保護に関連する米国の規制要件に完全に準拠しています。
2. 動物由来のEPCを操作するとき、あなたの研究のプロトコールは、動物実験の認可を受けなければと委員会（IACUC）を使用してください。すべての私達のブタの実験は、デューク大学のIACUCによって承認されていたと人道的なケアの最高基準に準拠して実施された。
3. 内皮前駆細胞の分離には、抗凝固citratで満たされた採血バッグに同意のボランティアドナーからの標準的な瀉血技術を介して末梢血50mlを集めるEリン酸デキストロースとはハンクのバッファ塩溶液と1:1（のCaCl _{2、MgCl 2を} 、MgSO _4を除く）とHistopaqueの同じボリューム上に層が明確に定義されたレイヤーを作成するためのソリューションを希釈する。
4. 遠心分離（30分、740グラム、低ブレークの設定）および単核細胞（MNC）（バフィーコート）層を収集する。再懸濁し、ダルベッコのリン酸で洗浄多国籍企業× 3は、（MCDB - 131培地5のフルEPC増殖培地で2つの12ウェルプレートにプレーティングする前に、10％ウシ胎児血清（FBS）× 10分、515グラムで（DPBS）緩衝生理食塩水37 200mMのL -グルタミン、10％FBSとEGM - 2 SingleQuots）のml ° C、5％CO _2。
5. ゆっくりして最初の7日間、一日おきに24時間ごとに培地交換。 EPCのコロニーは、その石畳の形態に基づいて、14日間の平均時間の後に識別することができます。かつて12ウェル表面積の文化のカバー¼のEPCは、セルを展開し、表面マーカーの存在をテストすることによって、フローサイトメトリーによるEPCのアイデンティティを確認するCD31と、以前に^6を説明するようにCD14、CD45の欠如。実行することができる他のアッセイは、DII - AC - LDLによる細胞の形態とラベルが含まれています。
6. 実験では、本明細書に記載のために彼らは37℃加湿インキュベーター中、EPC培地中で3 T - 75細胞培養フラスコでほぼコンフルエントになるまで、隔離されたEPCを拡大° C、5％CO _2。

2。せん断応力計算

1. 我々は、これらの計算が達成できる条件を十分に理解を持っているチャンバーとチャネルを製造する前に実行されることをお勧めします。希望のせん断に基づいて、回路内の灌流液の流量は、式¹にしたがって細胞に適用する応力を計算する

Qは、所望の流量である、τは、ターゲットのです。細胞の接線方向に働く応力を聞く、wはフローチャンバーの幅、hはフローチャンバーの高さであり、μは灌流液の粘度（流動媒体）です。

2. 使用される媒体の粘度の標準値（μ）0.9 CP（0.009グラムcm ^-1の秒^-1）です。粘度もので^、7を必要に応じて、高分子量デキストランを使用することによって発生する可能性があることに注意してください。ターゲットのせん断応力の典型的な値（τ）は、上記生理的なせん断応力を希望する場合は、15ダイン/ cm ^2、（典型的な動脈せん断応力）または100ダイン/ cm ²である使用。 267μmの-私たちの部屋は、通常、166の範囲では1.9センチ、高さ（H）の幅（w）を持っています。

3。フローチャンバーの製造

1. 目の上部と底板をカット7 × 2 × 0.5"7 × 2 × 0.25のと底部の寸法"の最上位のディメンションを持つアルミニウム合金6061長方形の在庫からの電子チャンバー。
2. 1.375"（幅）× 0.3125"深い流体貯留のためのエンドごとに"0.950を残して深い、"0.125〜凹部中央部にトッププレートを。
3. 下側から1 / 16"（幅）× 0.625"長いスロットが流入し、流出端の貯水池に侵入するために穴を開けます。
4. 各トッププレートの最後に、流体リザーバを貫通してホース中心部に位置する32分の10"ポリプロピレン1 / 8インチあたりのトラック数（TPI）の穴を"ドリル。流入側では、ホース口"ポリプロピレン1 / 8穴を通してTPI"32分の10とサイドのプラグインを作成。
5. テーパー流体流入からの流体の十分な混合のための0.518度でウィンドウを表示してガラスに底面、上面。
6. 上部表示窓に沿って、底板にガラスのスライド窓をカット。チャンバー内に水族館のセメント、接着剤、ガラスのスライドを使用する。少なくとも24時間は治療することができます。表示窓が75 × 25 × 1mmの顕微鏡のスライドガラスは、チャンバー内のフラッシュ座っれるように凹んでいることを確認してください。
7. "彼らは0.02離隔されるように、上部と下部プレートの下面の周囲にO -リングのための凹部を作成します。ゴム製O -リングを挿入します。
8. 平頭ねじ10に一致する32分の8"8 / 32で使用するための上部および下部チャンバーのTPIの穴"をあけます。

4。流回路アセンブリ

1. 第一全体の流れの回路を組み立てる、その殺菌に進みます。
2. "（接続パルスダンパー8分の1を経由）の一端にハードチューブのセグメント36"を取り付けます。もう一方の端に、ソフトチューブの18"セグメントを添付する。
3. ステップ4.2で述べたようにソフトチューブのセクション1 / 8"18の端にはオス型ルアーアダプター"を、置きます。 1 / 8オスルアーを接続する"メスルアーアダプター。新しい18にメスルアーを添付"セグメントソフトチューブ。
4. チューブを収めるために、250mlのガラスビーカーのキャップに3つの穴を開けます。 I250mlガラスボトル（タンクなど）（ 図2）にキャップの他の2つの穴に通しつの穴とハードとソフトチューブの自由端部にソフトチューブの1.5"セグメントを（換気口など）nsert。ハードチューブはタンクの底を（貯水池からの流出のチューブなど）に達することを確認してください。
5. 121℃蒸気オートクレーブによる上記部品を滅菌℃で60分間。さらに"× 5 / 16、6"8から32までのフラットヘッドネジ、ピンセット1組つの完全なフローチャンバーをオートクレーブ、3 × 2"ソフトチューブのセグメント、男性1と1 / 8メス"ルアーアダプター、4 × ½一75 × 25 × 1mmのガラススライド（または他の所望の細胞の表面材）、および2外科タオル。
6. 層流フード内に滅菌タオルを置きます。この滅菌野に流れ回路、フローチャンバー、4 × 4ウェイストップコック、1 × 1方活栓、およびステップ4.5からすべて滅菌部品を置きます。
7. 今すぐ2つの4ウェイストップコックを接続するための滅菌手袋を使用してください。オープンサンプルポートにキャップを置きます。
流回路の2つのソフトチューブのセグメントを接続する雄と雌のルアーアダプターを外し、接続されている三方活栓（ 図3）を挿入する。
8. 30mlの注射器にリザーバーに挿入された柔らかいチューブを取り付け、注射器のピストンを取り外します。 EPC培地（ 図4）125mlの瓶に詰める。
9. 通気孔（ 図4）に滅菌シリンジフィルターを置きます。
10. 37℃加湿インキュベーター中に流路を移動° C、5％CO _2。
11. チューブのこのタイプ（ 図5）で使用するために示されているローラーポンプヘッドにハードチューブをクランプする。チューブはトラックをマウントローラーポンプとオーバーラップしていないことを確認してください。ここで、それが終了するマーキングペンでいずれかの側のポンプヘッドをチューブにマークを付けます。
12. すべてのストップコックはサンプルポートに向かって閉ざされていることを確認し、流路に沿って開きます。ポンプを起動します。流れの方向を確認してください。灌流液は、frを移動してくださいOM、パルスダンパーにハードチューブを通してガラスの貯水池。

5。 EPC蛍光標識

1. 37に流れ回路が温まるには° C、スライド上にシードするためにセルを準備しながら。細胞が不透明な材料、例えばチタン（Ti）で視覚化されるかどうか蛍光標識が必要であることに注意してください。
2. ジメチルスルホキシド（DMSO）の90μlを50μgのCTO粉末を希釈することによりセルトラッカーオレンジ（CTO）の1 mMのストック溶液を作成します。光照射（流フードの下で働いている間ライトをオフにする）から、この混合物を保護してください。
3. 無血清MCDB - 131培地18 mlにCTOのストック溶液36μlを希釈してCTOの2μMのワーキングソリューションを作成します。
4. 10ミリリットルDPBS（カルシウムまたはマグネシウムなし）でコンフルエントT - 75細胞培養フラスコに近い3にEPCをすすいでください。
5. 各フラスコに2μMCTOワーキング溶液6mlを追加。 37℃で15分間インキュベート℃に10mlのDPBS（カルシウムまたはマグネシウムなし）を各フラスコ× 2をすすぐ。
6. EPC培地5mlで600グラムを再懸濁しますで遠心分離× 5分で洗浄する。

6。チャンバーアセンブリを流す前に、スライドの細胞播種

1. ガラス、チタン、または他の材料で作られたスライドを使用することができます、そしてスライドの表面は、ポリマーをスピンコーティングによって変更または金属の層を追加することができます。滅菌長方形の四室の細胞培養容器（またはポリスチレン表面が所望される場合、組織培養スライドのフラスコを使用）にスライドを置きます。コンフルエントな細胞層がフローの開始（ 図11A）で希望する場合はEPC培地× 6時間の5mlにスライド上に細胞や種子1.5 × 10 ⁶細胞を数える。
2. 流体せん断応力下で細胞拡散と接着性を試験するためには、3 × 10 ⁶細胞は、フローの開始（クイック播種）の前にわずか15分間付着することができます（

7。フローチャンバーアセンブリ

1. 滅菌手袋を使用して、メス型ルアーアダプター"1 / 8にソフトチューブのセグメント"1つの2を接続してください。オスルアーアダプター"1 / 8にソフトチューブのセグメント"別の2を接続してください。
2. "流入ポートにメスルアーアダプターとソフトチューブ2のアタッチ"2を添付する流出口にオスルアーと柔らかいチューブを。これらのルアーアダプターの両方に4ウェイストップコックを取り付けます。バブルトラップを抜け側のポートのコネクタに、残りの2"ソフトチューブの部分を接続し、1方活栓（ 図6）を添付してください。
3. 滅菌ピンセットを用いて、細胞培養容器から細胞シードのスライドを（またはスライドのフラスコを使用している場合は、スライド上にフラスコを削除）削除し、フローチャンバーの底板にくぼみに置きます。スライドを上に向けて、セルシードの側に置かれていることを確認してください。
4. スライド上に暖かいEPC培地のピペットで10ミリリットル。培地は、スライドとフローチャンバー、BをカバーすることができますUTは、底板上にO -リングを介してメディアをこぼさないでください。
5. ネジ穴を合わせ、ボトムプレートにフローチャンバーの上部プレートを置きます。 2つのプレートが平行に保つことによって、このステップの間にチャンバー内に気泡を導入しないように注意してください。
6. 一緒にネジのプレート（このプロセスまで自動バッテリ駆動ドライバーの速度）。
7. 10mlのシリンジを使用してEPC培地で流入チューブをフラッシュ優しく流入側の気泡トラップのポートに接続し、1方活栓を開いて、流入気泡のトラップから気泡を取り除く。その後、（ 図7）このコックとキャップを締めます。
8. 今再び10 mlの注射器を使用して、流出ポート4方活栓を開いて、ゆっくりとフローチャンバーを通じてEPC培地をフラッシュすることによりチャンバーのチャンネルから気泡を取り除く。大きな気泡が残っている場合、45 °の角度（ 図8）への室の流出側の端を上げる。
9. キャップ4方活栓の接続のすべてと密接なそれらのオフ。組み立てフローの回路（ 図9）とインキュベータにフローチャンバーを移動します。
10. 流回路のポンプを一時停止します。漏れを防止し、チャンバーの内部が無菌に保つために流れの方向に流路のストップコックをオフに閉じてください。流回路に流フードからフローチャンバーを運んでください。流回路にフローチャンバーを接続します。流れの方向にストップコックを開きます。フローポンプを再開する。灌流液は、正しい方向に流れることを確認してください。希望のせん断応力に流量を調整します。
11. 流動実験中に、フローチャンバーは、光や蛍光顕微鏡を介してイメージする回路からセルを削除することができます。そのためには、コック - コックの接続部で流路からのフローチャンバーを外してください。室の無菌性を維持するために、流れの方向に流れ回路のコックとフローチャンバーのコックをオフに閉じて、流れの回路を除去する前にすべてのストップコックにキャップを（ 図9）インキュベーターから。

8。灌流液のサンプルコレクション

1. 分析のための灌流液のサンプルを簡単に収集、（例えば、一酸化窒素の合成）、最初の休止ポンプ用。
2. パルスダンパーに一番近いコックを閉じます。その保護キャップを取り外し、サンプルポートに小型の注射器、例えば、3 mlの注射器を、挿入する。キャップを保持し、それが上下逆さまに置くことによって汚染されないことを確認してください。
3. パルスダンパー開放の方向にサンプルポートと回線を維持し、フローチャンバーの方向にコックを閉じます。
4. 回路から、例えば、150μL、試料の所望量を描きます。シリンジを取り外す前に、サンプルポートに向かってコックをオフに閉じてください。 80 ° C（後の時点での一酸化窒素測定用） - でラベルされたバイアルと凍結で灌流液のサンプルを保管してください。
5. サンプルポートを要約し、開始する前に、すべてのストップコックが開いていることを確認してください流れ。

9。代表的な結果

私たちのクイックシード法を用いて、ヒト血液由来の内皮前駆細胞は、15分間チタンのスライド上に播種し、15ダイン/ cm ²の生理（動脈）せん断力の下に付着することができます。

図10に示すように、EPCは657に、すぐに播種後、210からの流れの影響± ^11.4μm2の下に広がって3時間後、及び1152 ± ^39.1μm2と ± 15の流体せん断応力の24時間後に^55.3μm2とダイン/ cm ^2（群間差は p <0.0001、1元配置分散分析で統計的に有意である）。光や蛍光灯のどちらか顕微鏡で透明な容器を通して撮影可能セル面積の増加、に平行、真円度は式^（2）6にしたがって計算

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878 × 10 ^-3 ± 5.9 671 × 10 ^-3、すぐに播種後、× 10 ^-3 ± 19.2 × 10 3時間後に^-3、に526 × 10 ^-3 ± 19.2 × 10 ^-3 48時間後から減少同じ流体のせん断応力の曝露から（群間差は p <0.0001、1方向ANOVAと再び統計的に有意である）。

図11Dは、図11Aに示すように6時間の静的な播種期、後にランダムな方向に比べて、そのEPCは、15ダイン/ cm ²の流体せん断応力の48時間後の流れの方向に整列して向きを示しています。

我々の手法は、分析および/または分泌細胞の代謝物の定量化のための所定の時点で灌流液のサンプルを入手することができます。代表的な例として、私たちは生産を表しています図12のブタEPCSに48時間の流れの実験中-亜硝酸る（NO _2）。我々は、直接6時間で12.0 nmolの、12時間で13.1 nmolの、24で16.3 nmolのように異なる時点で流れ回路から採取した培地試料中のNOのためのサロゲートマーカーとしての一酸化窒素（NO）のこの主要な酸化生成物を測定時間、および15ダイン/ cm ^{2 6}で1 × 10 ^6個の細胞のための48時間後に24.6 nmolの。

図1のフロー回路の組み立てや流れの実験の概要を示す回路図。フローチャンバーなし（A）フロー回路アセンブリ。貯水池、パルスダンパー、ハードチューブ、ソフトチューブ、4ウェイのコックと接続されているルアーアダプターだけでなく、エアフィルターはここに含まれる。 （B）流量のポンプヘッドにハードチューブのセグメントを経由してフローチャンバーを接続する。 （C）でフローチャンバー（D）の底板にEPC -シードのスライドのsertion。フローチャンバーを使用して、フロー回路の組み立てを完了する。

図2：完全滅菌のためのフロー回路を組み立てた。

図3：付属のコックで滅菌した後、流れの回路を組み立て。

図4。EPC培地125 mlのガラス製リザーバーの充填。

図5。フローの回路は、前のフローチャンバーの挿入に流量ポンプヘッドにクランプ。

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図6。トップチャンバープレートアセンブリ。

図7。チャンバーの流入側から気泡を除去するためにEPC培地でバブルトラップのフラッシュ。

図8。チャンバーのスライドと流出側から気泡を除去するためにEPC培地でチャンバーのフラッシュ。

図9。流動実験中に挿入されたフローチャンバーで完全に組み立てられたフロー回路。

図10。EPCの面積は^（μm2との）流れの実験の時間の経過とともに増加する。

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図11（）× 6時間前の100 ×の倍率で流れにフィブロネクチンコーティングしたスライドガラス上に播種HUCB EPCの光学顕微鏡像。 （B）チタンスライド前の流れに15分間×にCTOと迅速なシードで標識HUCBのEPCは、100 ×の倍率での蛍光顕微鏡で可視化した。 HUCB EPCSに（C）同じチタンスライド下のような（B）、100ダイン/ cm ²でのフローの3時間後と100 ×の倍率で透明なチャンバーを撮像。フローの3時間後の細胞の広がりが、それでもランダム向きに注意してください。今100 ×の倍率でフローへの暴露の48時間後に（D）と同じチタンスライド、。 EPCのCTOおよび細胞核で標識されていますが、フローの後にHoechst色素（青）で染色されています。流れの方向のセルの配置を注意してください。 （E）チタン上の比較のためにブタのEPCは流れの48時間と15ダイン/ cmの後

図12グラフは、流量の48時間の間にブタのEPCのNO産生を示していない。 NOの主要な酸化生成物、亜硝酸（NO ₂ - ）、フロー中に異なる時点で採取した培地試料からのNOのためのサロゲートマーカーとして測定した。

図13。フローチャンバーは、上部セクションの次元で（）0.5という"× 2"× 7"と底部（B）0.25"× 2"× 7"で、アルミ合金6061長方形の在庫から作られています。トップは、"上部が0.125、その中央部に凹んでいる。シーリングのための平坦性を保証するために"0.45にその下面O -リングの接触面に予定だった、X 1.375"フルードリザーバー"0.3125のため終了につき、"0.95を残している。上部セクションの貯水池は、"スレッド化ステンレス鋼のプラグを受け取るように深い3/8-24 TPIと0.25スレッド化されています。 "× 0.625"1 / 16を測定するスロットは、貯水池に浸透底面に機械加工された。流入側のプラグは、三方活栓に接続するホース口"ポリプロピレン1 / 8穴を通して"32分の10を持っています。各ユニットの終わりには、0.25"ポリプロピレン1 / 8の深い部分"0.45"× 2"最後にホースを中心部に位置するスレッド32分の10 TPIを持っています。 "貯水池に浸透することによってスレッドの底から穴。上部セクションの下側はテーパーエリア0.6875持っている"端は0.07を使用して1.460の距離"のためのLHのスロットの中心から0.518度、広いし。このテーパGLASの終わりから"0.6875"幅× 0.0118"深いと0.590フラットエリアにブレンドの（または他の表面、例えばチタンスライド）休会。スライドがインストールされていると、このフラットは、ガラス（または他の表面、例えばチタンスライド）と同じ高さでなければなりません。テーパーとフラットが研磨されています。スライドの表面は0.0118"下側の表面から奥に入った。0.0118"される凹部はRH端に貯留スロットに続く。 O -リングは、O -リング溝とスライドの間に、元の面の0.020残しスロットおよびスライド"の周りに完全に奥に入った状態になります。上部と下部のユニットは、10個の穴を開けている。上部のセクションは、32分の8 TPI皿フラットのためのクリアランス穴を持っている頭のネジ。下部のセクションには、上部の穴に一致する配置した穴があり、32分の8 TPIをスレッド化されています。下部のユニットが細胞表面のガラスのスライド（またはチタンスライド）上にある、その表面に透明なガラスのスライド窓埋め込み式のフラッシュを持っている。単位は底のスライドと内側のO -リング溝との間の元の表面の0.04"を残すために幅とトップユニットのスロットを包含するO -リングの溝があり。 O - RINGSは、底部の赤いシリコン上のセクションのためのAS568A、ダッシュ番号044と046です。

Discussion

私達の流れの回路とフローチャンバーは、私たちが定義されている流体のせん断応力への付着細胞、例えば、EPCを、服従することができます。チャンバーの上部と底部が透明なので、細胞接着と形態は、リアルタイムで、チャンバー自体を介して、または流れの実験の後と解体フローチャンバーのいずれかを評価することができます。その時点で、細胞は、無菌条件下で収穫することができると再メッキのどちらか、またはさらなる分析のために彼らのDNAまたはRNA等を、収集するために使用。

層流を実現するために、チャンバーの設計は、いくつかの条件が満たされているようにする必要があります。

最初に、流れは粘性力に対する慣性力の比である、そのレイノルズ数（Re）を 、計算することによって検証することができます層、である必要があります。 （粘性力が支配する場合、 日時は小さく、流れは層流または"完全に開発された"です-通常RE <2300。慣性力が支配的であれば 、RE> 4000の場合のようにそれは、乱流になるまで、流れはますますランダムになります。）我々は、式^（3）8にしたがって再計算することができます。

ρは流体密度、Qは流量である、μは粘度であり、wとhは、それぞれチャンバーの幅と高さ、であり、そしてD _hは 、式^（4）8によると定義され、水力直径です。

166からまでの高さと私たちの3つのフローチャンバーのレイノルズ数、 - 267μmの、13.9の範囲 - 流量で34.6℃15ダイン/ cm ²のせん断応力を得るためにalculated。 234から100ダイン/ cm ²のせん断応力について計算された流速で、チャンバーのレイノルズ数は90.4の範囲であった。これらのレイノルズ数のすべての2300よりはるかに低いものであり、層流のための基準を満たしている。

第二に、速度場と流路（すなわち、完全に開発された）に沿った距離とは無関係であることがせん断応力のため、流体入口からスライドへの距離は、入り口の長さ、Lは_Eよりも長くなければなりません。これは、式⁵によれば、入り口の長さを計算することによって満たすことができます。

上記の値については、入り口の長さは0.01〜0.25 cmまでの範囲。

第三に、横方向の速度とせん断応力が変化しないことを確実にするために著しく一次元チャンネル流（Δ 中 、Ph / 2L）の値から、比はH / W 1よりもはるかに小さくする必要があります。一次元流れの下、壁面せん断応力の95％になるように二次元流れの条件下での平均壁面せん断応力の場合、H / Wは0.10以下である必要があります、そして二次元流れの条件下での壁面せん断応力のためになるために一次元流れの下の壁面せん断応力の97.5％は、H / Wは0.05以下である必要があります。私たちの設計したフローチャンバーの大きさ1.7幅のcmと166との - 高さ267μmの、これらの条件が満たされている。

入り口では横方向の圧力勾配がない場合、圧力は流れの方向にのみ変化します。これは、流路に染料または粒子を用いて評価することができる。さらに、定常流実験のために、パルスダンパーは、流路に挿入されます。パルスダンパーでは、PULSの大部分を取り出しatilityは、回路内のローラーポンプによって引き起こされ、私たちは定常流の近似仮定することができます。注目すべきは、利用パルスダンパーでは、それが効果的にローラーポンプの特定の周波数に対する出力の流れに脈動をなくすことができるように、回路で使用されているポンプとチューブと互換性があります。とI / P 26チューブ - どんなMasterflex L / Sシリーズポンプ（600 RPMは0）と排出ライン上で使用するときに私たちのデモではMasterflex L / Sパルスダンパーでは、層流を実現しています。拍動流の場合は、プログラム可能なポンプは、様々な波形を生成するために使用することができます。

拍動流の場合は、プログラム可能なポンプは、様々な波形を生成するために使用することができます。

さらに、回路は、灌流液のようにサンプルが容易に細胞や流れ媒体の汚染を危険にさらすことなく、異なるタイムポイントで収集することができるように設計されています。この例では、NO ₂の濃度は、 -で化学発光によって測定したオニクス/ Sieversの一酸化窒素アナライザー（NOA 280、Sieversの楽器、ボールダー、CO）は、以前に^10を説明した。亜硝酸の分析に使用される還元剤はNOに亜硝酸塩に変換しないように削減の可能性を秘めているが、そのような硝酸塩等の窒素のいずれか高い酸化物を減らすには不十分であるため、相対的にである酢酸のヨウ化カリウム（14.5 M酢酸と0.05 M KI）であった亜硝酸塩の特定。サンプル^6をしながら失われたボリューム用に調整しながら生産総量の亜硝酸が生成される濃度と回路の総体積の積として算出した。

次の手順では、流れの実験の成功した実行のために重要です。

1. 気泡がその表面から細胞をティアオフする可能性があるので、それは、フロー設定時に気泡の形成を避けることが望ましい。これは、最適な底の部分、上のフローチャンバーの上部に配置する際に世話をすることによって回避することができます。お互いに両方の平行を維持し、再調整せずに1つの動きの底にトップを下げることにより実現。そうすることで、流路内に存在および/またはフローティング可能性がある小さな気泡は、アルミニウム筐体のどちらかの端に泡のトラップに転送されます。
2. 貯水池の流出管がタンクの底に達することを保証することが重要です。そうでなければ、空気が灌流液レベルがわずかにチューブの端を下回った場合、タンクからチャンバーにつながるチューブに吸い込まれる可能性があります。
3. 研究者は、回路とチャンバーに吸い込まれる空気という結果になる、ポンプが誤ってフローの開始時に逆方向に実行されないようにポンプの流れの方向を理解しておく必要があります。
4. 泡の形成を（血清中に含まれる変性タンパク質に起因する）を避けるために、我々はperfusaより約1インチにチャンバーからタンクにつながるチューブを下げるアドバイス貯水池内のTEのレベル。しかし、流れ媒体のレベルを超えてそれ​​を維持することで、実験中に貯水池への流入を確認することができます。
5. 一緒にチャンバーの部品をねじ込む場合、それはもう片方の手で電動ドライバーを動作させながらしっかりと片手でハウジングを把握することが重要です。電動ドライバーの動きは、ネジが締まっている一度'の周りにチャンバーを放り出す"可能性を秘めているトルクに変換されることに注意してください。
6. 回路の形成とその表面から細胞を持ち上げてから、任意の圧力波を避けるために、すべてのストップコックは、フローを開始する前に、開いていることを確認してください。
7. 特に長期的な流れの研究のために（> 48時間）我々は、より困難かつ弾力性のあるチューブを配管の破断を防ぐために、ポンプヘッドに挿入する使用することをお勧めします。
8. それは、チューブが精神的に不安定なポンプヘッドの歯のために、ポンプヘッド内部に"移行"することが可能です。したがって、我々はどのように浴槽に細心の注意を払って提案しますINGは、ポンプヘッドに固定し、チューブは"に引っ張ら'や実験中に外れている場合、簡単に気づくことができるようなマーキングペンでチューブの両端をマーキングしています。
9. 常に慎重に接続不良が原因で実験中の灌流液の漏出を防ぐために灌流を開始する前に、回路とチャンバーのすべての単一のコネクタを確認してください。これは、パルスダンパーの流入と流出のコネクタのために特に重要です！
10. あなたが蛍光標識を使用する場合、光の露出を制限するために覚えている。

私たちのフローチャンバーの可能な制限は、高さは、アルミニウムに加工チャネルの高さで固定されているということです。しかし、これは各実験の前にチャネルの高さの検証と調整する必要がないという利点があるため、単に所望の値にポンプの流量を調整することによって、せん断応力の計算を簡素化します。あなたの研究の目標に応じて、それはすることが望ましい場合がありますポンプの速度を増加させずにせん断応力を増加させる。このケースでは、例えば媒体¹¹にデキストランを加える、灌流液の粘度を増やすことをお勧めします。

流回路の可能な制限は、細胞の代謝物の非常に低濃度を定量化しようとしたときに問題がある可能性がある使用される媒体の大ボリュームです。ここに示されていませんが、それは実質的に小さく貯水池及びパルスダンパーを使用して、回路量を削減し、チューブの長さと直径を小さくすることが可能です。

さらに、培養中の細胞に流体せん断応力を適用するために使用できるいくつかの他の市販のシステムがあります。マイクロ流体ベースのシステムでは、これらのチャネル^12,13,14の入力と出力の貯水池として機能しているウェルプレートへの解決策でロードされる様々なマイクロ流路内のセルの同時分析を可能にする、流出からBioFluxシステムを例えば。しかし、これらおよびその他のマイクロ流体システムは、標準的な顕微鏡のスライドとは互換性がないので、そのようなRT - PCRやウエスタンブロットなどの更なる実験のための細胞が十分な数の回復のために許可されていません。さらに、彼らは、あまりユーザーフレンドリーは$ 40,000の最小のコストおよび付属機器に応じて、10万ドル以上の合計に到達する可能性があります。

Flexcellインターナショナル株式会社、FlexcellストリーマーとFlexFlowのシステムから使用可能な2つのマクロ流体のシステムが、うまく内皮細胞^15,16,17、流体の流れの条件の下で人間のアニュラスのセル¹⁸と線維芽細胞^19を研究するために使用されている。 GlycoTechを通じて利用可能なサードシステムは、腫瘍細胞の接着²⁰および内皮単層への白血球接着^21を研究するために利用されている。

ストリーマーのシステムは、複数のスライドを一度に同一のせん断応力条件の下で実行することができますが、表示ウィンドウを欠いていると - 私たちとは違って設計 - フロー下での細胞のリアルタイム可視化のために許可されていません。

FlexFlowシステムが表示するウィンドウを持っていますが、ほとんどの実験室で使用されている標準的な顕微鏡ではないかもしれない正立顕微鏡が必要です。さらに、FlexFlowシステムは、フローチャンバー内に配置するときに反転するセルでコーティングされたカバースリップを必要とします。これは、我々の研究で実証チタンでコーティングされたガラス、などの不透明な表面上に蛍光細胞の可視化を排除する。最後に、特殊なカバースリップは、マルチ千ドルの価格帯でFlexcell Streamerのシステムに似ているFlexFlowシステム、専用に購入する必要があります。

GlycoTechは、大幅に安価な、しかし、便利な私たちの部屋のようなオートクレーブ幹になることができないキャストアクリルの組み合わせにより製造されて円形と長方形の平行平板フローチャンバーを、提供しています。注、オートクレーブ可能なように記載されている他のフローチャンバーの彼らは特殊な顕微鏡レンズ^22,23を必要と^するため、非現実的に表示されます。 GlycoTechシステムは、繰り返し使用して厚さに変更するため、（メーカーは毎10使用後に新しいものを購入されることをお勧めします）時間の経過とともにチャンバーの高さを変更する上部と底板との間にシリコンゴムのガスケットを、利用しています。 O -リングを内蔵した当社のアルミチャンバーは、上部と底板の完全な反対を可能にし、実験の間に一定の室の高さを保証します。最後に、真空ポンプは、当社の設計では必要ではないGlycoTechチャンバー、を含む多くのフローチャンバー設計における漏れ防止のシールを、達成するために必要です。

ここに示されていないのに対し、フローチャンバーは細胞の接着及び/または動作のリアルタイムイメージングのための全体の流れの実験中に、顕微鏡下に保持することができます。これが望まれている場合、我々は37灌流液の温度を維持するために、加熱ランプまたはチャンバーの下で加熱パッドを使用することをお勧め℃を毛皮細胞や代謝物または治験薬またはエージェントのない"再循環"が^24を希望されない場合がある、ローラーポンプは、シリンジポンプに置き換えることができます。

それは、流体せん断応力下で細胞間相互作用を評価するためにコンフルエントEPCの層上に接着細胞、例えば蛍光血小板（Achneckらによって記載された血小板アッセイを使用して^。6,25）を介して異なる方法で標識された細胞を流すことも可能です。私たちのフローチャンバーは、灌流液サンプリングポートと表示ウィンドウなど、他の利用可能なフローチャンバー、の貴重な機能を組み合わせて、どちら倒立または正立顕微鏡との互換性の重要な利点があります。それは完全にオートクレーブ可能であり、一定の室の高さに漏れ止めシールを達成するために真空ポンプを必要とせずに繰り返し実験が可能になります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
製品/試薬	会社	製品＃
10mlのシリンジ	コー​​ルパーマーインストゥルメント（株）	07940〜12
1ウェイStopcoks	コー​​ルパーマーインストゥルメント（株）	30600〜00
30mlのシリンジ	BDメディカル	309650
4ウェイストップコック	コー​​ルパーマーインストゥルメント（株）	30600〜04
アルミ合金	N /	6061
細胞培養皿（4ウェル、長方形）	サーモサイエンティフィック、ヌンク	267061
細胞トラッカーオレンジ	インビトロジェン	C34551
DMSO	研究オーガニック	2162D
DPBS (-/-)	インビトロジェン	14190-144
EGM - 2 Singlequots	ロンザ	CC - 4176
メス型ルアーアダプター	コー​​ルパーマーインストゥルメント（株）	SI - 45500〜04
フィブロネクチン	シグマ	F0895 - 2mgを
キャップ付きのガラスボトル（250ミリリットル）	コー​​ルパーマーインストゥルメント（株）	34594〜24
ハードチューブ	コー​​ルパーマーインストゥルメント（株）	06508〜16
HBSS	シグマ	H8264 - 500ML
Histopaque	シグマ	H8889 - 500ML
ヘキストStain Solutionが	シグマ	H6024
Hyclone FBS	サーモサイエンティフィック	SH30071.01
L -グルタミン	ロンザ	17 - 605E
男性のルアーアダプター	コー​​ルパーマーインストゥルメント（株）	EW - 45505〜04
MCDB - 131、1Xミディアム	Cellgro	15から100 - CV
とげのあるポリプロピレン継手	コー​​ルパーマーインストゥルメント（株）	06365〜90
O -リング	N /	AS568A
パルスダンパー	コー​​ルパーマーインストゥルメント（株）	07596〜20
ポンプドライブ（Masterflex L / S可変速経済のドライブ）	コー​​ルパーマーインストゥルメント（株）	7524〜40
ポンプヘッド（Masterflexイージーロードポンプヘッド）	コー​​ルパーマーインストゥルメント（株）	07518〜60
スライド	コー​​ルパーマーインストゥルメント（株）	48500〜00
ソフトチューブ	コー​​ルパーマーインストゥルメント（株）	96400〜16
シリンジフィルタ	コー​​ルパーマーインストゥルメント（株）	02915〜12
SYTOXオレンジ核酸は染色	インビトロジェン	S - 11368
トリプシンEDTA	ロンザ	CC - 5012
トリプシン中和液	ロンザ	CC - 5002