フローサイトメトリーは、特定の細胞集団を単離して解析するための強力なツールです。本プロトコルでは、新生仔トランスジェニックマウスの蝸牛組織からLacZ発現細胞を単離する手順について説明します。単離した蝸牛細胞を、フローサイトメトリーによる分離に先立ち、蛍光標識されたβ-galactosidase基質を用いて標識しました。
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この記事について
サマリー
要約
特定の細胞タイプを単離することで、幹細胞や前駆細胞のような希少な細胞集団を分析することが可能になります。内耳組織を研究する上でこのようなアプローチをとる場合、標的となる細胞数が極めて少なく、またトランスジェニック・リポーターマウスモデルも少ないため、特有の困難が伴います。本稿では、蛍光標識プローブを用いて、新生児の蝸牛からLacZ陽性細胞を選択的に標識するプロトコールについて説明します。
感音難聴の最も一般的な潜在的病理は、音波を神経衝動に変換するために不可欠な蝸牛感覚有毛細胞の不可逆的な損傷および喪失です。近年のエビデンスにより、マウスの聴覚および前庭器官には再生能を持つ可能性のある幹細胞/前駆細胞が存在することが示唆されています1,2。これらの知見は、幹細胞/前駆細胞の特性を持つ特定の細胞型の同定を含む、さらなる調査を正当化するものです。Wntシグナル伝達経路は、いくつかの器官系において幹細胞/前駆細胞集団を維持するために重要な役割を果たすことが実証されています3-7。我々は最近、新生児の蝸牛においてWnt応答性のAxin2発現細胞を同定しましたが、その機能はほとんど分かっていません8。
これらのWnt応答性細胞のin vitroにおける挙動をより詳細に理解するため、我々はAxin2-LacZレポーターマウス9の蝸牛からAxin2発現細胞を単離する方法を開発しました。フローサイトメトリーを用いて新生児蝸牛からAxin2-LacZ陽性細胞を単離することで、生細胞を用いて様々な実験を行い、幹細胞または前駆細胞としての挙動を解析することが可能となりました。本稿では、新生児蝸牛の微小解剖、組織の分散、蛍光基質を用いたLacZ陽性細胞の標識、および細胞ソートの手順について詳細に説明します。蝸牛を単一細胞に分散させ、フローサイトメトリーによって蝸牛細胞を単離する手法は既に報告されていますが2,10-12、我々はこれらの手法に修正を加え、新生児蝸牛からLacZ発現細胞を単離するための新規プロトコルを確立しました。
プロトコル
1. 蝸牛のマイクロダイセクション
- 70%エタノールで表面を拭き、氷ブロックを配置して、フード内で解剖顕微鏡を準備する。
- 無菌条件下で35 mmペトリ皿を10〜15枚準備し、滅菌済みのカルシウム含有ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を半分（約2 ml）まで満たす。
- 無菌条件下で35 mmペトリ皿を2枚準備し、滅菌済みの1xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を半分（約2 ml）まで満たす。
- 50 mlコニカルファルコンチューブに入れた70%エタノールでマイクロピンセットを滅菌する。
- 滅菌フードとは別の部屋で、アイリスシザーを用いて生後（P）0〜3日のAxin2LacZ/+レポーターマウス12〜15匹を斬首し、頭部を氷ブロック上の60 mmペトリ皿に置く。
- #5 Dumontピンセットとアイリスシザーを用いて、下顎と舌を摘出し、口蓋のレベルで頭蓋底を切断する。
- 頭蓋冠の表皮を除去し、大後頭孔の下部から口蓋の中央に向かってシザーを挿入し、頭蓋底を切断する。
- アイリスシザーを用いて、口蓋の切断端から頭蓋冠の上端に向かって両側を切開する。この際、耳胞を損傷しないように注意する。
- 大後頭孔の上端から始まり、硬口蓋の冠状切断線まで至る45度の角度の切開を2箇所行い、側頭骨の単離を完了させる。
- 単離した側頭骨を、氷ブロック上のHBS....
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ディスカッション
独立した研究により、新生児の内耳蝸牛における再生能力は限定的であることが明らかにされています2,10,12,13。WhiteらによるGFPリポーターマウスおよびフローサイトメトリーを用いた研究では、特定の蝸牛支持細胞を単離し、それらが前駆細胞の特性を持つことを見出しました12。
標準的なWnt経路は、脳、乳腺、造血系、皮膚、胃腸の腸陰窩を含む複数の器官系において、幹細胞／前駆細胞集団を標識することが示されています。最近の研究では、新生児の蝸牛において、特性が十分に解明されていない細胞集団に活性化したWntシグナリングが存在することが見出されました8。Axin2-LacZレポーターマウス9は、他の系と同様に5,7、蝸牛における活性化したWntシグナリングの忠実なリードアウトを生成します8。このAxin2-LacZ陽性細胞集団の特性をより詳細に明らかにするため、我々はいくつかの確立された手法を修正および組み合わせて、新生児蝸牛における再生調節におけるWnt.......
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開示事項
利益相反はありません。
謝辞
有意義な議論にご協力いただいたS. Heller、K. Oshima、R. Nusse、Y. Zeng、および技術的な支援を提供してくださったC. Tang、A. Lee、E. Liaw、そしてスタンフォード大学共通FACS施設スタッフに感謝いたします。本研究は、Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellowship、スタンフォード大学Medical Scholarsプログラム（ともにT.A.J.へ）、スタンフォード大学Dean's Fellowship（R.C.へ）、American Otological Society、Triological Society、Percy Memorial Award、Akiko Yamazaki and Jerry Yang Faculty Scholar Fund、およびNIDCD/NIH K08 DC011043（すべてA.G.C.へ）の支援を受けて行われました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| シャーレ、ポリスチレン製、滅菌済み Geriner Bio-one 35 x 10 mm | VWR international | 82050-540 | |
| BD Falcon セルストレイナー、滅菌済み、BD Biosciences、ブルー、40μm μm | VWR international | 21008-949 | |
| ハンクス’ 平衡塩溶液 (HBSS)。カルシウムおよびマグネシウム含有、フェノールレッド不含、滅菌済み溶液 | VWR international | 45000-456 | |
| Cellstar 遠心チューブ、ポリプロピレン製、滅菌済み、Greiner Bio-One、50 ml | VWR international | 82050-346 | |
| Cellstar 遠心チューブ、ポリプロピレン製、滅菌済、greiner bio-one、15 ml | VWR international | 82050-278 | |
| B-27 無血清サプリメント (50x)、液体 | Invitrogen | 17504-044 | |
| N-2サプリメント (100倍濃縮)、液体 | Invitrogen | 17502-048 | |
| bFGF, ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| IGF-1、マウス由来インスリン様成長因子-1 | Sigma-Aldrich | I8779 | |
| EGF, ヒト上皮成長因子 | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| ダルベッコ’修飾イーグル’培地/Ham’F-12 50/50 Mix：1X、L-グルタミンおよび15 mM HEPES含有 | VWR international | 45000-350 | |
| BD Falcon ラウンドボトムチューブ、使い捨て、ポリスチレン製、12x75 | VWR international | 60819-295 | |
| トリプシン, 0.25% (1X) EDTA 4Na含有, 液体 | Invitrogen | 25200-056 | |
| ep Dualfilter TIPS 300uL, 960本入り | Eppendorf | 22491245 | |
| 大豆トリプシンインヒビター、精製済み | Worthington Biochemical | LS003570 | |
| BD Falcon 40um セルストレーナー | BD Biosciences | 21008-949 | |
| マルチウェルプレート、ポリスチレン製、Greiner Bio-One、未処理プレート、6ウェル | VWR international | 82050-846 | |
| マーカー遺伝子 FACS Blue LacZ β-ガラクトシダーゼ検出キット | マーカー遺伝子技術 | M0255 |
参考文献
- Li, H., Liu, H., Heller, S. Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear. Nat. Med.. 9, 1293-1299 (2003).
- Oshima, K. Differential distribution of stem cells in the auditory and vestibular organs of the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol
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