フローサイトメトリーを用いてマウスの内耳の組織からのLacZの発現細胞を単離する

サマリー

フローサイトメトリーは、特定の細胞集団の単離と研究を可能にする強力なツールです。このプロトコルは、新生児トランスジェニックマウスの蝸牛組織からLacZ発現細胞を単離するための手順を説明しています。解離した蝸牛細胞は、フローサイトメトリーによる分離の前に、β-ガラクトシダーゼの蛍光標識基質を使用して標識されました。

要約

特定の細胞タイプを単離することで、幹細胞/前駆細胞などの希少な細胞集団を解析することができます。このような内耳組織の研究アプローチは、目的の細胞が不足しており、トランスジェニックレポーターマウスモデルが少ないため、独自の課題があります。ここでは、蛍光標識プローブを使用して新生児蝸牛由来のLacZ陽性細胞を選択的に標識するプロトコールについて説明します。

感音難聴の最も一般的な根本的な病理は、音波を神経インパルスに変換するために必要な蝸牛感覚有毛細胞の不可逆的な損傷と喪失です。最近の証拠は、マウスの聴覚器官と前庭器官が再生能を持つ可能性のある幹細胞/前駆細胞を保有していることを示唆しています^1,2。これらの知見は、幹細胞/前駆細胞の特性を持つ特定の細胞タイプの同定など、さらなる調査が必要である。Wntシグナル伝達経路は、いくつかの臓器系^3-7において幹細胞/前駆細胞集団の維持に重要な役割を果たすことが実証されています。最近、新生児蝸牛においてWnt応答性Axin2発現細胞を同定したが、その機能はほとんど不明である⁸。

これらのWnt応答性細胞のin vitroでの挙動をよりよく理解するために、Axin2-LacZレポーターマウス⁹の蝸牛からAxin2発現細胞を単離する方法を開発しました。フローサイトメトリーを使用して新生児蝸牛からAxin2-LacZ陽性細胞を単離すると、生きた細胞でさまざまな実験を行い、幹細胞/前駆細胞としての挙動を調べることができます。ここでは、新生児蝸牛の顕微解剖、これらの組織の解離、蛍光基質を用いたLacZ陽性細胞の標識、および細胞選別の手順について詳しく説明します。蝸牛を単一細胞に解離し、フローサイトメトリーを介して蝸牛細胞を単離する技術が記載されている^2,10-12。これらの技術に変更を加え、新生児蝸牛からLacZ発現細胞を単離するための新しいプロトコルを確立しました。

プロトコル

1. 蝸牛の顕微解剖

1. フードの下に70%エタノールで表面を拭き取り、氷の塊をセットして解剖顕微鏡を準備します。
2. 滅菌状態で10-15個の35mmシャーレを準備し、滅菌ハンクのカルシウム付きバランス塩溶液(HBSS)を半分(~2 ml)で満たします。
3. 滅菌状態で 2 つの 35 mm シャーレを調製し、滅菌済みの 1x リン酸緩衝溶液 (PBS) で半分 (~2 ml) を満たします。
4. マイクロ鉗子を50mlの円錐形ファルコンチューブで70%エタノールで滅菌します。
5. 滅菌フードとは別の部屋で、虹彩はさみを使用して、出生後12〜15匹の出生後(P)0〜3日齢のAxin2^{LacZ / +}レポーターマウスを斬首し、頭を氷ブロックの60mmシャーレに置きます。
6. #5デュモン鉗子と虹彩ハサミを使用して、下顎骨と舌を切除し、口蓋のレベルで頭蓋底を切断します。
7. 頭蓋骨の上にある皮膚を取り除き、大孔の下部から口蓋の中央にハサミを挿入して頭蓋底を横断します。
8. 耳嚢を傷つけないように注意しながら、口蓋の切り口から両側の頭蓋骨の上面まで虹彩はさみで別の切開を行います。
9. 大孔の上面から硬口蓋の冠状切開まで伸びる 2 つの 45 度の角度の切開を行うことにより、側頭骨を完全に分離します。
10. 分離された側頭骨を、HBSSを含む35 mmのペトリ皿に氷のブロックに置きます。
11. 犠牲にされた約12〜15匹の動物から側頭骨を集め、合計24〜30個の側頭骨を集めます。
12. 分離された側頭骨を有するペトリ皿を、事前に準備した滅菌解剖フードに移します(1.1)。
13. HBSS(1.2)を含む事前に準備された35mmペトリ皿に4つの側頭骨を移し、氷のブロックに置きます。
14. 2 つの #55 鉗子を使用してマイクロダイセクションを開始し、耳嚢の上にある側頭骨の皮質、脳幹、小脳を穏やかに切除します。
15. 耳嚢を取り外さずに、前庭蝸牛神経の入り口から始まる蝸牛嚢の一部から耳嚢に削り取ります。
16. 蝸牛の基部を露出させた後、蝸牛と周囲の組織を静かに引き出します。残っているらせん状神経節と基部から始まる脈管筋をすべて取り除きます。
17. 蝸牛をアイスブロック上のPBSを含む35mmシャーレに移します。
18. 最適な組織生存率を得るには、解剖の合計時間を60分未満にする必要があります。
19. Axin2-LacZマウスのコントロールとして、3〜5匹の野生型(WT)P0-P3マウスについて上記の手順を繰り返します。

2. 細胞の解離(前述の方法から変更)^2,10

1. 50 μLの滅菌PBSをウェルの中央に、コーティングされていない6ウェル培養皿に入れます。
2. 最大 20 個の Axin2^LacZ/+ 蝸牛を PBS の各 50 μl 液滴に移します。新しい50μlのPBS液滴は、20を超える蝸牛に使用する必要があります。
3. 0.125% トリプシンの 50 μl アリコートを 37°C の水浴で ~2 分間温めます。
4. 温めた0.125%トリプシン50μlを、蝸牛を含むPBSに加えます。
5. 6ウェルディッシュを振らないように注意しながら、37°Cに8分間置きます。
6. トリプシン化を終了するには、液滴100μlごとに50μlの大豆トリプシン阻害剤を添加します。
7. さらに50 μlのフルメディア (FM) (IGF-1、EGF、bFGF、HS、DMEM/F12中のアンピシリン)²
8. 300 μlのブラントピペットチップとp200ピペットマンを125 μlに設定して、気泡が発生しないように注意しながら、細胞を80回穏やかに回転させます。
9. 各液滴のトリチュレーション後、各ウェルにさらに200μlのFMを加えます。
10. 細胞を40 μmの青色のFalcon細胞ストレーナーに通して新しいウェルに入れます。
11. 細胞を標準的なFalcon FACSチューブに移します(トリチュレーションおよびろ過後に約300μlが残ります)。
    1. 野生型蝸牛の細胞を3本のチューブに分割し、各チューブに300μlのFMで100μlを希釈します。1 つのチューブをブランク コントロールとして使用し、1 つのチューブをヨウ化プロピジウム (PI、1 μg/ml) のみで染色します (このステップでは追加しないでください)、最後の 1 つは 3-カルボキシアンベリフェリ β-D-ガラクトピラノシド (CUG、2.15 を参照) で染色してバックグラウンド蛍光を検出します。
    2. Axin2-LacZ蝸牛由来の解離細胞400 μlを各FACSチューブに入れます。CUGのみのコントロールとして、10 μlの細胞を390 μl FMで希釈します(ステップ2.15のチューブFを参照)。残りのチューブの容量を400μlにします。
12. 37°Cの加湿インキュベーターで細胞を10分間インキュベートします。
13. CUG溶液を準備します。
    1. 染色が必要なFACSチューブごとに200 μlのCUGを調製します。
    2. FM 1:50でCUGを希釈し、暗いフードで光への露出を最小限に抑えます。
    3. 希釈したCUGを37°Cで3〜5分間予温します。
14. 次に、希釈したCUG200 μlを適切な各FACSチューブに加えます。CUGを持つように指定されていない真空管の場合は、FMのみを追加してください(2.15を参照)。
15. この時点で、次の内容の 5 つのカテゴリのチューブが必要です (この手順では PI を追加しないでください)。
    1. 野生型 - CUG または PI なし (補償については、ステップ 3.5-6 を参照)
    2. 野生型 - PIのみ(補償用)
    3. 野生型 - CUGおよびPIを使用(Axin2-LacZ細胞に対する制御用)
    4. Axin2-LacZ - CUGのみ(コンペンセーション用)
    5. Axin2-LacZ - CUGおよびPI付き(実際の細胞ソーティング用)
    6. Axin2-LacZ - CUGおよびPI付き(イベント解析用)
16. すべてのチューブを光から保護し、37°Cの加湿インキュベーターで25分間インキュベー
トします。
17. インキュベーション後の反応停止のための新鮮なHEPES + ウシ胎児血清(FBS)溶液を調製します。
    1. 解凍したばかりのFBS400 μlを、15 mLのFalconチューブ内の滅菌10 mM HEPES (PBS中) 10 mLで希釈します。
    2. 2.16が完了するまでチューブを氷の上に置きます。
18. 無菌フードの下に氷冷HEPES溶液1.8mlを無菌フードの下に加え、光の露出を最小限に抑えます。
19. 細胞を1200rpmで5分間遠心分離します。
20. 上清を除去し、細胞を300 μl FMに再懸濁し、ソーティングサンプル(CUGおよびPIで染色したAxin2-LacZ)のすべてのアリコートをプールします。
21. 各チューブにPIを添加して、最終濃度を1 μg/mlにします。
22. 細胞を氷の上に置き、光から保護します。

3. フローサイトメトリー

1. 488nm、633nm、407nmのレーザーを搭載したBD Aria IIを使用しています。CUGの検出は、スタンフォード共有FACS施設で407nmの紫色レーザーを使用して行われ、PIは488nmの青色レーザーを使用して行われました。
2. 訓練を受けたフローサイトメーターのオペレーターが必要です。レーザーをウォームアップし、製造元の指示に従ってサイトメーター検出器をキャリブレーションし、最適なソーティングパラメータを設定した後、次のステップに進みます。私たちの経験では、100 μmのノズルを使用すると、その後の実験で細胞の生存率が最適化されることがわかりました。
3. 次のパラメータを使用しました:5,000イベントでのしきい値、3,000イベント/秒未満の流量、125ボルトでの前方散乱(FSC)、250ボルトでのサイドスキャッター(SSC)、PIにはPE-Cy5チャネルを使用し、CUGにはカスケードブルーを使用しました。
4. サイトメーターチャンバーを70%エタノールとPBSでそれぞれ2回ずつフラッシュします。
5. 未染色の野生型細胞で解析を開始します(ステップ2.15のチューブA)。1,000 個のイベントを収集して、FSC 対 SSC プロット上の細胞分布を決定します。散布が望ましくない場合は、FSCおよびSSCパラメータを調整します。
6. 未染色のWT(チューブA)、PI染色したWT(チューブB)、およびCUG染色したAxin2-LacZ(チューブD)細胞を使用してコンペンセーションを行います。補償により、異なるレーザー波長間でより正確な信号識別が可能になります。
7. 野生型PIおよびCUG染色細胞(チューブC)で解析を開始し、以下のゲーティングパラメータを設定します。
   1. FSC対SSCプロットに基づく破片の除外。
   2. FSC高さ対FSC面積プロットを使用したダブレットと凝集子の除外。
   3. FSC面積対PE-Cy5面積プロットに基づく死細胞の除外。
   4. 任意のゲート配置でFSCエリアとカスケードブルーエリアのプロットを設定します。
8. 次に、Axin2-LacZ PIおよびCUG染色細胞(チューブF)を含むソーティングサンプルチューブから10,000イベントを解析します。
   1. 野生型セルを使用して設定されたすべてのゲートは、ここに適用する必要があります。
   2. 野生型細胞のプロットを使用して、イベントの総数の 1% 未満の Cascade Blue-high 細胞のゲートを作成します。
   3. この同じCascade Blue-highのゲートは、現在、Axin2-LacZサンプルの細胞の約15〜20%を包含しており、これらのAxin2-high細胞を構成しています。
   4. Axin2-LacZ細胞の解析プロットを使用して、最も蛍光性の低い15-20%の細胞、以下、Axin2-low細胞のゲートを作成します。
9. 前述のゲーティング戦略に基づいて、細胞を500μlのFMを含むFACSチューブに選別し、1つのチューブはAxin2-high細胞用、もう1つはAxin2-low細胞用です。選別中は、収集チューブが4°Cに冷却されたチャンバー内にあることを確認してください。
10. 各集団のフローサイトメーターでカウントされた細胞数を記録します。

4. 代表的な結果 (図 2 を参照):

上記のプロトコルでは、通常、野生型とAxin2^LacZ/+蝸牛の両方から40〜45%の破片のない細胞を回収します(図2AおよびB)が、そのうちの約70%にダブレットがありません(図2A'およびB'を参照)。ほとんどの選別された細胞は生存率であり、PIを取りませんでした(~95%)(図2A''およびB'')。平均して、上位~20%のCUG陽性細胞はAxin2-LacZ陽性細胞(図2B''')と見なされ、10-12匹あたり約15,000個のAxin2-LacZ-high細胞と相関します。

フローサイトメトリー再ソート解析では、Cascade Blueチャネルで93%を超える純度が明らかになりました。これらの細胞の同一性をさらに確認するために、抗β-ガラクトシダーゼ抗体を用いてAxin2-high細胞とAxin2-low細胞の両方に対してソート後免疫染色を行ったところ、Axin2-high細胞には~93.4%のβ-ガラクトシダーゼ陽性細胞(1,500細胞以上を解析)が含まれ、Axin2-low細胞には~4.8%のβ-ガラクトシダーゼ陽性細胞が含まれていることがわかりました。

図と表:

図 1.実験パラダイム。上の図は、プロトコルのセクションで説明した全体的な実験戦略と手法を示しています。野生型およびAxin2^LacZ/+マウス由来の蝸牛を採取し、単一細胞に解離した後、β-ガラクトシダーゼの蛍光基質であるCUGで処理しました。その後、Axin2-LacZ-high細胞と-low細胞をフローサイトメトリーで分離しました。この画像のフルサイズバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.ゲーティング戦略。この図は、使用されるフローサイトメトリーのゲーティング戦略を示しています。A) ここでは、Axin2-LacZ細胞と同じ処理を受けた解離野生型細胞を、合計10,000のイベントを用いて解析します。最初のパネルは、側面散乱領域(SSC-A)と前方散乱領域(FSC-A)を示しています。ここでは、イベントの明確なグループは、y 軸に近いイベントよりもはるかに大きなサイズになります。これらの事象は「デブリネガティブ」と呼ばれています。次のゲートであるA'は、イベントの総数の43.8%であるパネルAの「Debris Negative」セルを分析します(下の表を参照)。このパネルでは、前方散乱高さ(FSC-H)とFSC-Aを使用して、ダブレットを除外しています。プロットの予想される線形性から逸脱するイベントは除外されます。この調製物は、通常、指定されたゲート内で~70%のイベントをもたらし、残りの細胞は除外されます。パネルA''では、PE-Cy5チャネルによって検出されたヨウ化プロピジウム(PI)を使用して、死細胞(5.3%)を標識します。次のパネル(A''')では、Cascade青色チャンネルを使用して蛍光基質CUGを検出します。ここでは、LacZハイゲートに含まれるのは全イベントの1%未満です。B) CUGおよびPIで処理したAxin2-LacZマウスの解離細胞を、合計10,000イベントを用いて解析します。ここでは、パネルAと同じゲートが適用されます。B'は、細胞の29.5%がダブレットとして除外されていることを示し、B''は、5.4%が生存していないことを示しています。LacZ-highおよび-lowセルの初期ゲートは、パネルB'''を使用して描画され、LacZ-highは19.7%、LacZ-lowは20.4%に初期設定されています。この画像のフルサイズバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

円 千株 千株 人 名 千株 円 千株 千株 千株 名 名

		イベント番号	百分率
ある	野生型解析	10,000
A'	デブリネガティブ	4,381	43.80パーセント
A''	ダブレットネガティブ	3,116	71.10パーセント
あ'''	PIネガティブ	2,951	94.70パーセント
	LacZ-ハイ	16	0.54パーセント
	LacZ-ロー	2,790	94.50パーセント
イ	Axin2-LacZ解析	10,000
B'	デブリネガティブ	4,218	42.2パーセント
B''	ダブレットネガティブ	2,973	70.50パーセント
B'''	PIネガティブ	2,813	94.6パーセント
	LacZ-ハイ	553	19.70パーセント
	LacZ-ロー	573	20.40パーセント

表 1.図2のゲーティング戦略の定量分析。

ディスカッション

独立した調査研究により、新生児蝸牛内の再生能力が限られていることが特徴付けられています^2,10,12,13。Whiteらは、GFPレポーターマウスとフローサイトメトリーを使用して、特定の蝸牛支持細胞を単離し、それらが前駆細胞の特徴を持っていることを発見しました¹²。

標準的なWnt経路は、脳、乳腺、造血系、皮膚、消化管の陰窩を含む複数の臓器系の幹細胞/前駆細胞集団をマークすることが実証されています。最近の研究では、新生児蝸牛の特性が不十分な細胞集団で活性なWntシグナル伝達が発見^{されました8。}Axin2-LacZレポーターマウス⁹は、他のシステム^5,7と同様に、蝸牛⁸における活性Wntシグナル伝達の忠実な読み出しを生成する。このAxin2-LacZ陽性細胞集団をよりよく特徴付けるために、新生児蝸牛の再生調節におけるWntシグナル伝達の役割を調査するために、いくつかの確立されたアプローチを修正および組み合わせました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シャーレ、ポリスチレン、滅菌済み Geriner Bio-one 35 x 10 mm	VWR international	82050-540
BD Falcon Cell Strainers, Sterile, BD Biosciences, blue, 40 μm	VWRインターナショナル	21008-949
ハンクス' バランス塩溶液(HBSS)。 カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを含まない溶液、滅菌済み	VWR 国際	版 45000-456
Cellstar 遠心分離機チューブ、ポリプロピレン、滅菌済み、グライナー バイオ ワン、50 ml	VWR 国際	版 82050-346
Cellstar 遠心分離管、ポリプロピレン、滅菌、グライナー バイオ ワン、15 ml	VWR 国際版	82050-278
B-27 無血清サプリメント (50x)、液体	Invitrogen	17504-044
N-2 サプリメント (100x)、液体	Invitrogen	17502-048
bFGF、線維芽細胞成長因子-塩基性ヒト	Sigma-Aldrich	F0291
IGF-1、マウス由来インスリン様成長因子-1	Sigma-Aldrich	I8779
EGF、上皮成長因子ヒト	Sigma-Aldrich	E9644
Dulbecco'のモディファイドイーグル」s ミディアム/ハム's F-12 50/50 Mix: 1X, with L-Glutamine and 15 mM HEPES	VWR international	45000-350
BD Falcon Round-Bottom Tubes, Disposable, ポリスチレン, 12x75	VWR international	60819-295
Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA 4Na, liquid	Invitrogen	25200-056
ep Dualfilter TIPS 300uL、960 TIPS	Eppendorf	22491245
トリプシン阻害剤、大豆、精製	Worthington Biochemical	LS003570
BD Falcon 40um Cell Strainers	BD Biosciences	21008-949
マルチウェルプレート、ポリスチレン、Greiner Bio-One、未処理プレート、6ウェル	VWR国際	82050-846
マーカー遺伝子FACSブルーLacZベータ-ガラクトシダーゼ検出キット	マーカー遺伝子	テクノロジーM0255