フローサイトメトリーは、特定の細胞集団を単離して解析するための強力なツールです。本プロトコルでは、新生仔トランスジェニックマウスの蝸牛組織からLacZ発現細胞を単離する手順について説明します。単離した蝸牛細胞を、フローサイトメトリーによる分離に先立ち、蛍光標識されたβ-galactosidase基質を用いて標識しました。
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フローサイトメトリーは、特定の細胞集団を単離して解析するための強力なツールです。本プロトコルでは、新生仔トランスジェニックマウスの蝸牛組織からLacZ発現細胞を単離する手順について説明します。単離した蝸牛細胞を、フローサイトメトリーによる分離に先立ち、蛍光標識されたβ-galactosidase基質を用いて標識しました。
特定の細胞タイプを単離することで、幹細胞や前駆細胞のような希少な細胞集団を分析することが可能になります。内耳組織を研究する上でこのようなアプローチをとる場合、標的となる細胞数が極めて少なく、またトランスジェニック・リポーターマウスモデルも少ないため、特有の困難が伴います。本稿では、蛍光標識プローブを用いて、新生児の蝸牛からLacZ陽性細胞を選択的に標識するプロトコールについて説明します。
感音難聴の最も一般的な潜在的病理は、音波を神経衝動に変換するために不可欠な蝸牛感覚有毛細胞の不可逆的な損傷および喪失です。近年のエビデンスにより、マウスの聴覚および前庭器官には再生能を持つ可能性のある幹細胞/前駆細胞が存在することが示唆されています1,2。これらの知見は、幹細胞/前駆細胞の特性を持つ特定の細胞型の同定を含む、さらなる調査を正当化するものです。Wntシグナル伝達経路は、いくつかの器官系において幹細胞/前駆細胞集団を維持するために重要な役割を果たすことが実証されています3-7。我々は最近、新生児の蝸牛においてWnt応答性のAxin2発現細胞を同定しましたが、その機能はほとんど分かっていません8。
これらのWnt応答性細胞のin vitroにおける挙動をより詳細に理解するため、我々はAxin2-LacZレポーターマウス9の蝸牛からAxin2発現細胞を単離する方法を開発しました。フローサイトメトリーを用いて新生児蝸牛からAxin2-LacZ陽性細胞を単離することで、生細胞を用いて様々な実験を行い、幹細胞または前駆細胞としての挙動を解析することが可能となりました。本稿では、新生児蝸牛の微小解剖、組織の分散、蛍光基質を用いたLacZ陽性細胞の標識、および細胞ソートの手順について詳細に説明します。蝸牛を単一細胞に分散させ、フローサイトメトリーによって蝸牛細胞を単離する手法は既に報告されていますが2,10-12、我々はこれらの手法に修正を加え、新生児蝸牛からLacZ発現細胞を単離するための新規プロトコルを確立しました。
1. 蝸牛のマイクロダイセクション
2. 細胞解離(既報の方法を改変)2,10
3. フローサイトメトリー
4. 代表的な結果(図2を参照):
上記のプロトコルを用いることで、野生型およびAxin2LacZ/+の両方の蝸牛から、通常40-45%のデブリフリーな細胞を回収でき(図2AおよびB)、そのうち約70%がダブレットフリーでした(図2A'およびB'参照)。ソートされた細胞の大部分は生存しており、PIを取り込んでいませんでした(~95%)(図2A''およびB'')。平均して、上位~20%のCUG陽性細胞がAxin2-LacZ陽性細胞とみなされ(図2B''')、これは動物10-12匹あたり約15,000個のAxin2-LacZ高発現細胞に相当します。
Axin2-high細胞のフローサイトメトリーによる再ソート分析の結果、Cascade Blueチャンネルにおいて93%以上の純度が認められました。これらの細胞の同一性をさらに確認するため、Axin2-high細胞およびAxin2-low細胞の両方について抗β-ガラクトシダーゼ抗体を用いたソート後の免疫染色を行ったところ、Axin2-high細胞には約93.4%のβ-ガラクトシダーゼ陽性細胞が含まれており(1,500個以上の細胞を分析)、Axin2-low細胞には約4.8%のβ-ガラクトシダーゼ陽性細胞が含まれていることが判明しました。
図および表:

図1. 実験パラダイム。上の図は、プロトコルセクションで説明されている全体的な実験戦略および手法を示している。野生型およびAxin2LacZ/+マウスから蝸牛を採取して単一細胞に解離させ、次いでβ-ガラクトシダーゼの蛍光基質であるCUGで処理した。その後、フローサイトメトリーを用いてAxin2-LacZ-high細胞および-low細胞を分離した。ここをクリックして、この画像のフルサイズバージョンを表示してください。

図 2.ゲーティング戦略。この図は、使用したフローサイトメトリーのゲーティング戦略を示している。A) Axin2-LacZ細胞と同じ処理を施した解離野生型細胞を、計10,000イベントを用いて解析している。最初のパネルは、側方散乱光面積(SSC-A)対前方散乱光面積(FSC-A)を示している。ここでは、y軸に近いイベントよりもはるかにサイズの大きいイベントの明確なグループが存在する。これらのイベントを「デブリネガティブ」と定義する。次のゲートA'では、パネルAの「デブリネガティブ」細胞を解析しており、これは全イベント数の43.8%である(下の表を参照)。このパネルでは、前方散乱光高さ(FSC-H)対FSC-Aを用いてダブレットを除去している。プロットの予想される線形性から逸脱したイベントは除外される。この準備により、通常、指定されたゲート内に約70%のイベントが得られ、残りの細胞は除外される。パネルA''では、PE-Cy5チャネルで検出されるプロピジウムイオダイド(PI)を用いて死細胞(5.3%)を標識している。次のパネル(A''')では、Cascade blueチャネルを用いて蛍光基質CUGを検出している。ここでは、LacZ-highゲートは全イベントの1%未満である。B) CUGおよびPIで処理したAxin2-LacZマウス由来の解離細胞を、計10,000イベントを用いて解析している。パネルAと同一のゲートをここに適用している。B'は、細胞の29.5%がダブレットとして除外されたことを示し、B''は5.4%が生存していないことを示している。LacZ-high細胞およびLacZ-low細胞の初期ゲートはパネルB'''を用いて設定され、初期値はLacZ-highが19.7%、LacZ-lowが20.4%に設定されている。ここをクリックして、この画像のフルサイズバージョンを表示してください。
| イベント数 | パーセンテージ | ||
| A | 野生型解析 | 10,000 | |
| A' | デブリ陰性 | 4,381 | 43.80% |
| A'' | ダブルネガティブ | 3,116 | 71.10% |
| A''' | PI陰性 | 2,951 | 94.70% |
| LacZ高発現 | 16 | 0.54% | |
| LacZ低発現 | 2,790 | 94.50% | |
| B | Axin2-LacZ解析 | 10,000 | |
| B' | デブリネガティブ | 4,218 | 42.2% |
| B'' | ダブルネガティブ | 2,973 | 70.50% |
| B''' | PI陰性 | 2,813 | 94.6% |
| LacZ高発現 | 553 | 19.70% | |
| LacZ低発現 | 573 | 20.40% |
表 1. 図 2におけるゲーティング戦略の定量分析。
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独立した研究により、新生児の内耳蝸牛における再生能力は限定的であることが明らかにされています2,10,12,13。WhiteらによるGFPリポーターマウスおよびフローサイトメトリーを用いた研究では、特定の蝸牛支持細胞を単離し、それらが前駆細胞の特性を持つことを見出しました12。
標準的なWnt経路は、脳、乳腺、造血系、皮膚、胃腸の腸陰窩を含む複数の器官系において、幹細胞/前駆細胞集団を標識することが示されています。最近の研究では、新生児の蝸牛において、特性が十分に解明されていない細胞集団に活性化したWntシグナリングが存在することが見出されました8。Axin2-LacZレポーターマウス9は、他の系と同様に5,7、蝸牛における活性化したWntシグナリングの忠実なリードアウトを生成します8。このAxin2-LacZ陽性細胞集団の特性をより詳細に明らかにするため、我々はいくつかの確立された手法を修正および組み合わせて、新生児蝸牛における再生調節におけるWnt...
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利益相反はありません。
有意義な議論にご協力いただいたS. Heller、K. Oshima、R. Nusse、Y. Zeng、および技術的な支援を提供してくださったC. Tang、A. Lee、E. Liaw、そしてスタンフォード大学共通FACS施設スタッフに感謝いたします。本研究は、Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellowship、スタンフォード大学Medical Scholarsプログラム(ともにT.A.J.へ)、スタンフォード大学Dean's Fellowship(R.C.へ)、American Otological Society、Triological Society、Percy Memorial Award、Akiko Yamazaki and Jerry Yang Faculty Scholar Fund、およびNIDCD/NIH K08 DC011043(すべてA.G.C.へ)の支援を受けて行われました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| シャーレ、ポリスチレン製、滅菌済み Geriner Bio-one 35 x 10 mm | VWR international | 82050-540 | |
| BD Falcon セルストレイナー、滅菌済み、BD Biosciences、ブルー、40μm μm | VWR international | 21008-949 | |
| ハンクス’ 平衡塩溶液 (HBSS)。カルシウムおよびマグネシウム含有、フェノールレッド不含、滅菌済み溶液 | VWR international | 45000-456 | |
| Cellstar 遠心チューブ、ポリプロピレン製、滅菌済み、Greiner Bio-One、50 ml | VWR international | 82050-346 | |
| Cellstar 遠心チューブ、ポリプロピレン製、滅菌済、greiner bio-one、15 ml | VWR international | 82050-278 | |
| B-27 無血清サプリメント (50x)、液体 | Invitrogen | 17504-044 | |
| N-2サプリメント (100倍濃縮)、液体 | Invitrogen | 17502-048 | |
| bFGF, ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| IGF-1、マウス由来インスリン様成長因子-1 | Sigma-Aldrich | I8779 | |
| EGF, ヒト上皮成長因子 | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| ダルベッコ’修飾イーグル’培地/Ham’F-12 50/50 Mix:1X、L-グルタミンおよび15 mM HEPES含有 | VWR international | 45000-350 | |
| BD Falcon ラウンドボトムチューブ、使い捨て、ポリスチレン製、12x75 | VWR international | 60819-295 | |
| トリプシン, 0.25% (1X) EDTA 4Na含有, 液体 | Invitrogen | 25200-056 | |
| ep Dualfilter TIPS 300uL, 960本入り | Eppendorf | 22491245 | |
| 大豆トリプシンインヒビター、精製済み | Worthington Biochemical | LS003570 | |
| BD Falcon 40um セルストレーナー | BD Biosciences | 21008-949 | |
| マルチウェルプレート、ポリスチレン製、Greiner Bio-One、未処理プレート、6ウェル | VWR international | 82050-846 | |
| マーカー遺伝子 FACS Blue LacZ β-ガラクトシダーゼ検出キット | マーカー遺伝子技術 | M0255 |
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