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このビデオでは、我々は特定の膜受容体を標的と量子ドットを使用して、完全な単一粒子追跡実験を提示します。この実験の主な目的は、生細胞の細胞膜内で測定した分子拡散挙動の識別異なる種類で構成されています。確かに、膜に生じる分子の動きは一般的に直線的に例えば26から29ナノドメイン内の指示または密閉されることによって、ブラウン拡散から逸脱することができます。我々は、生細胞の膜内で発生するダイナミクスで生じる様々なスナップショットを提供するために、同時に技術的に可能な限り多くの受容体として以下を目指しています。これは最終的に細胞表面受容体のシグナル伝達を調節するメカニズムの解読できるように期待されています。
1。細胞培養
- 細胞のサンプルを準備します。付着したCOS-7内因性上皮成長因子受容体（EGFR）30を発現する細胞を使用しています。時抗生物質なしで生細胞での作業は準備中にすべての回で適切な無菌テクニックを使用することによって隠れたサブ検出可能な汚染がないようにしてください。
- その中を持って世話をして、7％CO 2で37℃、完全培地（10％子牛血清を含むDMEM、1％グルタミン、1％HEPES、1％ピルビン酸ナトリウムは、以下の特定の試薬 の表を参照）で細胞を成長させるラボ·テックでそれらを拡散する前に、サブコンフルエント、指数関数的成長。
- 実験前日、8ウェルチャンバー（LAB-TEK）でよく/ 5,000細胞を広げ、一晩インキュベートする。カウント細胞が故に一定の細胞密度、細胞当たりの量子ドットの再現率を保証します。
2。細胞標識
特定のコーティングを施した量子ドットを準備します。量子ドットは、半導体から成る蛍光ナノ粒子である。彼らは古典に比べて非常に明るく、光安定であるため、これらのナノ粒子は高い金利を提示単一分子イメージングのための雑音比（SNR）に適切な信号の達成を可能にする蛍光プローブ31,32、。
- 実験前に、前述の21としてパパインで消化し 、ハイブリドーマ細胞株からEGFR（MAB 108、ATCC HB-9764）に対するFabフラグメントを生成します。
- メーカーの指示に従って、ビオチンとの結合体は、Fab、（EZ-リンクスルホ-NHS-LC-ビオチン化キット、サーモフィッシャーサイエンティフィック、 図1A）。
- 605 nmの（細胞自家蛍光から輝き、検出および分離するための最適な発光波長）でストレプトアビジン（Invitrogen社製）と発光で官能量子ドットを使用しています。
- 量子ドットの周りに存在ストレプトアビジンと同様に、凝集し、細胞へとカバースリップへの非特異的結合を防ぐために飽和するためには、（特定の試薬の表を参照）完全培地中での標識溶液を調製します。
- 二つの中間ソリューションを準備します。量子ドット - ストレプトアビジンとビオチン化は、Fab、20 nMのそれぞれに別のものと1。
- これら2つのソリューションの等量を混ぜる：量子ドット複合体：10nMのFabの最後の仕事濃度を得るために1:1の比率のFabを持つ量子ドットを混在させること。等モル比を使用すると、1つの量子ドットと1ビオチン化Fab断片で構成されるモノ官能化複合体の形成に有利である。これは、受容体33,34を架橋に起因するアーティファクトの観測を制限して、一価の標識を支持する。
- 凝集を防ぐために、毎分1,200回転でシェーカーを使用して、25℃で15分間インキュベートします。ミックスはその後生きている細胞に使用できるようになりました。
- 7％CO 2で37℃で5分間混合液100μlで細胞をインキュベートします。
- 非自己蛍光イメージング媒体（HBSS緩衝液、1％HEPES、特定の試薬の表を参照してください）37℃で温め℃で細胞を洗浄
- 国連を防ぐために慎重にラベルの過剰を取り除く必要に応じて、広範囲のイメージング媒体、最後の洗浄の前に少なくとも5分の遅延、室温で一般的に5回、各ウェルを洗浄することにより、ピントが量子ドットの、バインドされていないことでSNRを損なう。
3。光学装置
ビデオ顕微鏡のセットアップは、次の4つの主要部分で構成されています。
- 特定の蛍光キューブ（FF01-457/50励起、FF495-Di02ダイクロイック、およびFF01-617/73発光フィルター、Semrock）と高開口数（1.3または1.49）油浸100倍を目的とした倒立顕微鏡。
- 100 W水銀ランプ（体温調節に干渉を避けるため、光ファイバを介して顕微鏡に結合された）。
- 512×512ピクセルの高感度は、十分なSNRを達成するためにカメラをEMCCD。
- 実験中に37℃での生物学的サンプルを保つためにインキュベーター。
4。買収
- 孤立したとよく拡散セルを選択します。この最高の膜分子の平面運動を探しに適応良い、平坦な葉状仮足の拡張を支持する。
- 透過光と蛍光の両方で、その外観によって、細胞の生理状態を評価する：強烈な小胞輸送、壊死またはアポトーシスの兆候の有無、低自家蛍光、および平均の強力な量子ドット標識（通常はセル当たり最大1,000量子ドットを参照してください図1B、C）。
- 同時にできるだけ多くの受容体として監視するために重要である高い標識密度を選択します。これは実際に両方の生理的な（表面発現、エピトープのアクセシビリティ、横方向の動き）と、アルゴリズムのパラメータ（たとえ適切な検出および再接続を可能にするために、運動によるアカウントのぶれを考慮して、重複しない点広がり関数（PSF）、）によって制限されます。
- 各セルは、最初のさらなるセルの側面をチェックし許可することができます明視野像を（可能であれば優先的に、DICを使用して）を取得と葉状仮足の空間を制限します。
- これらの規則で、以来、DICという名前のサブフォルダに、ビデオ·スタック（例えばcell1.tif＆cell1.stkなど）と同じ名前を使用して、このイメージを保存すると、アルゴリズムは自動的に一致する画像を再生見つけることができます各スタック。
- 通常は36ミリ秒の速度、このカメラでは、フルフレームで達成可能な最も速い速度で、連続して、セルごとに1から3の動画を取得します。しかし、1が増加し感度および/または以下の画素と、専用のCCDを使用して、最大1 msの速度に、高い周波数で取得することができます。フレーム転送技術は、フレーム間のごくわずかの遅延を提供します。
- 電子乗算強化は、常に一般的に25〜30デシベルの周囲に、少なくとも20デシベル（効率的なピークの検出1）の上、十分なSNRと、単一分子感度に到達できるように、（ちょうど飽和以下、該当する場合）、最大に設定する必要があります。
- 通常、ビデオ、罪あたり300フレームを取得するCEの軌跡は、ほとんどが長い点滅するイベントによって制限され、平均で約100フレームを介して再構築されます。ビデオ周波数と長さは、例えば長いトレースが必要になる場合があります与えられた測定値に対して適応させることができます。
5。 MTT分析
- MatlabやOctaveは、与えられたデータセットを評価するためにビデオファイルを含むディレクトリへのパスを選択します。
- 完全に自動化を分析1,35を起動するには 、Octaveでコマンドdetect_reconnex23を入力するか、MatlabのMTT23i。このプログラムは、 "ユーザーインターフェイスを備えた、バージョン2.3"の略で、以前のバージョン2.2と一緒に、ダウンロードすることができます。それは、最初の図に示すように、使用されるすべてのパラメータを一覧表示するグラフィックインターフェースを表示します。 2。
6。代表的な結果
MTTは、自動的にさらに補完、検出されたと推定ターゲットのトレースを実現するために、各レコーダーの映像を分析し、このような閉じ込め検出などvestigations、。これは最終的に細胞の画像（ 図1C＆3）を介してマッピングをトレースすることができます。
MTTの説明
コアMTT分析は主に3つのタスクを実行します（ 図3）を呼び出し、各フレーム上で実行されています。
- PSFは双方向次元ガウスピークとしてmodelizedのいずれかの信号の存在下で、二つの仮説を比較して連続して各ピクセルを中心としたスライディングサブ領域、内のターゲット（量子ドット）の有無の検出 、 、またはフレームあたり1つ未満のスプリアス検出と、十分に低い誤警報を保証するしきい値を使用してノイズだけ、。これは、検出確率のマップにつながる。それぞれの極大は、その確率レベルが誤警報（PFA）の所望の確率に応じて設定する最小値よりも高いことを保証する、推定対象と見なされます。この制限は、効率的な信号を識別するのに十分低く設定されていますノイズからnals、依然として検出が十分に高い確率を許可しながら、理論的に予測、最適な1に達し、最高のスプリアス検出（デフォルトでは10 -6のPFA、512×512ピクセルの画像が少ない複数のエラーを確実にするため）で回避できます。サブ領域を使用しての要件は、イメージの境界（7×7ピクセルのデフォルトのウィンドウの3つのピクセルが、）を評価することができないことを意味することに注意してください。
- そのようなサブピクセルの位置や信号強度などの関連パラメータの推定、検出された各ターゲットの、。すべての検出されたターゲットに対して、最小二乗ガウス·ニュートン近似は次の検出されたガウス分布の位置、幅と高さを推定するために実行されます。これは特に色素のサブピクセル位置（代表的なSNR値と動かない、または徐々に拡散染料の10から20 nmの精度が0.1μm2 / sで拡散染料のために〜100 nmまで増加する）を提供します。
- を持つ新しいターゲットの再接続トレースはすでに前のフレーム上に構築。新しいターゲットのセットは、以前のトレースのセットと照合されます。この目的のために、可能であれば、トレースに各ターゲットを割り当てるために、検出工程から得られる利用可能なすべての統計情報は、位置だけでなく、強さ、幅、点滅すると、関連する統計だけでなく、使用されます。したがって、目標は単に最寄りのトレースに割り当てられていない：交差トレース、強度、速度、幅と点滅の場合には考慮されます。これは統計的に最適な再接続のスコアを提供しています。最寄りの隣人に向かって再接続をバイアス可能な場合は、この戦略は、避けることができます。
検出されたピークは、推定または再接続が失敗した場合は拒否された事後にすることができます。特別なテストでは、新しいトレースを開始するような新しいピークの検出を処理します。このテストは、より厳格なPFA（10 -7）を使用してトレースにピークを再接続するので、検証oとしてデファクトと解釈することができます Fとの関連性（この基準は、新たなピークには適用されない定義である）。
流跡線解析
可能な一時的な閉じ込めは、次の反比例ローカル拡散24から29に関連した関数によって評価されています。しきい値を適用すると、閉じ込められたかどうかのエピソードを定義することができます。すべてのトレースを介してこれらを繰り返すことにより、我々は一時的な閉じ込めの観点から/イベントを遅くし、膜のダイナミクスをマッピングすることができます。これは、代わりにバイナリまたはこの閉じ込めインデックスの離散値のいずれかを使用して表現することができます。
各ビデオフレーム（7行のグループ）とトレース（列）のフレーム番号、iとjの位置、信号強度、半径、オフセットと点滅し、デフォルトでは、MTTは自動的に8ピークテキストファイル内のパラメータを保存し、それらのタスクを実行します。 。に例示したように、これらの出力パラメータは、MatlabやOctaveはさらにすなわちトレースまたは信号強度を解析するためfread_data_sptスクリプトを使用して再ロードすることができます付録の"https://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_exampleスクリプトを実行します。
さらなる分析は、各セルの上にトレースをマッピングする（ 図1C＆3）と、関連するパラメータ（例えば、ピーク強度、SNR、またはローカルの拡散値など）のヒストグラム分布を提供するために導く。各ファイルについて、各パラメータの平均値と標準偏差は、一緒にヒストグラムのイメージで、テキストファイルに保存されます。そのような正方形の変位R 2のように対数のディストリビューションでは、幾何平均につながる。拡散係数Dは、MSDカーブの5最初のポイント上に線形近似から計算されます。これらの値は、細胞の反応や膜組織に影響を与える医薬品/酵素処理の例では、動力学のために関連する実験の概要を説明します。 MTTは、オープンソースのコードであるため、この側面は、容易に任意の専用調査に適合させることができる。
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図1。 MTTによる細胞膜受容体の動態を監視するなど EGFR（）の膜成分は、ビオチン化Fabフラグメント（各分子の約正しいスケーリングの模式図）に結合量子ドットでタグ付けされます。 （B）典型的な蛍光画像を個別に標識した受容体に対応する回折限界のピークを描いた、36ミリ秒の露光時間で、ライブCOS-7細胞から得られた。 （C）MTT分析の出力は、細胞の明視野画像上に重ね受容体の再構成軌道を、表示されます。
図2。 MTTの入力パラメータを設定します。実行MTT23iは私達の前の出版物1に記載したようにすべての入力パラメータ、名前とデフォルト値を、リスト、グラフィックユーザーインターフェースを開きます。アルゴリズム、空間と時間のパラメータ（検索窓、ピーク半径、最大の拡散にと点滅）無次元標準ユニット、ピクセルとフレームにあります。キャリブレーションは、出力結果を変換するための事後適用することができます。 156 NM / PXLとフレーム遅延：36ミリ秒/フレーム100倍のカスケード512BFTに対応するデフォルトの値は、ピクセルサイズです。
調査官は、そのような予想される最大の拡散係数（ "差分MAX"）と最大点滅消失（ "T オフ "）のようないくつかの重要なパラメータを最適化する必要があります。これら二つの空間と時間の制限はほとんど与えられた実験条件、堅牢なデフォルト値に設定されている他人のために再検討する必要がある唯一のものです。例えば、偽アラームの数を直接ほとんどの場合十分であるフレームごとに1つ、より少ないので万画素未満つのエラーを確認するために設定されています。すべてのパラメータは、ユーザーが分析のために使用された設定を後で確認することができ、出力フォルダ内のテキストファイルに保存されます。
s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpgの "alt ="図3 "/>
図3。 MTT分析の主要な手順を実行します。蛍光画像の実験スタックから始めて、ピークが連続しており、自動的に検出し、フレーム（操作の最初の範囲、フローチャートの上部）を介してガウシアンフィットして、再接続することによって推定した。トレースは、さらに最終的に、関連する記述子の動的マップ（操作の第2の範囲、下部）につながる、例えば、推定される閉じ込めのために分析することができます。
図4。ラベリング価は、MTTには影響しません。artefactual多標識によって導入された可能性バイアスを評価するために、MTT分析は、軌跡のマップを生成し、分析するために、2つの異なる方式を使用してタグ付けされ内因性EGFRを追跡するために行われた。プロトコルで説明したように（A）受容体は、ビオチン化Fabおよび量子dots605-ストレプトアビジンでタグ付けされた。このケースでは、量子ドットとストレプトアビジンの多価は、単一の染料にいくつかの受容体を結合する可能性があります。 （B）受容体を直接有機色素、Atto647Nに結合したFabでタグ付けされた。このケースでは、1は、Fab、それ故に1受容体は、複数の色素に結合させることができる。 （C）の平均二乗変位（MSD）曲線は、量子ドットやアト染料（左と右のグラフは、それぞれ）のいずれかで標識し、各セルのすべてのトレースに対して計算された。拡散係数は、MSDの5最初のポイント（赤い点線）上の線形近似で計算された。類似した拡散値（中央のグラフ）につながったラベリングの各スキーム。 Qdot®標識：量子dots605（N = 5細胞）を、アト：Atto647N（n = 7の細胞）、NS（スチューデントt-検定のp値> 0.05）に有意ではない。