方法論記事

DNA損傷の検出のための半人工分子機械とその使用のin vitroでの組立に

DOI：

10.3791/3628

⸱

2012年1月11日

 , 
1Neurosurgery, Baylor College of Medicine , 2Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 3Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、トポイソメラーゼのタンパク質を搭載した分子スケールデバイスのアセンブリとアプリケーションを示しています。構造は、その両端に二つの異なる蛍光色素を付加することにより組織切片におけるDNA切断の2つの主要なタイプを標識する生体分子センサーです。

要約

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天然由来のバイオ分子のマシンはすべての生きている細胞では機能とデザインを1-6の様々な表示。まだ方向運動、すなわち分子モーターの対応デバイス上で、そしてそのスケールダウンした機械部品（ホイール、アクスル、ペンダント等）7-9人工分子機械の中心の開発。これは、慣性と運動量の保存など、これらのデバイスに不可欠な物理特性は、ナノワールドの環境で10に使用できないにもかかわらず、マクロマシンを模したもの。機械的なmacromachinesスキームに従い、生体分子の進化に開発した機構を使用しない代替デザインは、、ナノワールドの特定の条件を活用することができます。に加えて、ナノ設計の目的のために実際の生体分子を適応させるナノテクノロジー製品がもたらす可能性のある潜在的な危険を減らすことができます。ここでは、そのようなバイオ対応構造のアセンブリとアプリケーションを示すように人工的な成分で、天然に存在する分子機械を組み合わせたEMI -人工分子デバイス。ビューの酵素学の観点から、私たちの構造は、デザイナーの蛍光酵素基質複合体の特定の有用な機能を実行するために一緒に入れています。それは1つの12が含まれているとして、このアセンブリは、定義により分子機械です。まだ、エンジニアリング部との統合-蛍光二重ヘアピン- DNA損傷12を標識する新しいタスクにそれを再指示する。

私たちの構造は32量体DNAと酵素ワクトポイソメラーゼI（VACC TOPO）から組み立てます。マシンは、2つの蛍光標識検出器ユニット（図1）を製造するために、独自の材料を使用しています。ユニットの一つ（緑色蛍光）が運ぶ共有結合その3'末端と別のユニット（赤色蛍光）に接続されているVACC TOPOは、ターミナル3'OH無料ヘアピンです。ユニットは短命で、すぐにその後recleavesオリジナルの構造に戻し、組み立て直す。DNAの非存在下で周期的に継続的に独立したとreligateこれら二つのユニットを壊します。 DNA損傷による組織切片では、トポイソメラーゼを運ぶ検出器ユニットは、選択的に蛍光ラベルを付けます、5'OHと平滑末端DNAの切断（DNase処理II型改）11,12に接続します。オリゴヌクレオチド開裂の後に形成された第二、酵素のないヘアピンT4 DNAリガーゼは、ソリューション13,14内に存在する場合、5'PO 4平滑末端ブレーク（DNアーゼI -型改）11,12、にライゲートされます。 T4 DNAリガーゼは、組織切片または5'PO 4平滑末端切断したDNAを含む溶液に添加されると、リガーゼは、準安定酵素- DNA複合体を形成し、5'PO 4 DNAの末端と反応する。平滑末端ヘアピンは、このように5'PO 4平滑末端DNAの切断をラベリング、DNAにリガーゼと共有結合リンクのヘアピンをリリースするこれらの複合体と相互に作用します。

この開発は、番目に新しい実用的なアプローチを例示している電子の分子機械の設計とは、固定された細胞や組織におけるアポトーシスとDNA損傷の検出に有用なセンサーを提供します。

プロトコル

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それらの調製方法は、分子デバイスの組立よりも時間がかかるため、分子機械ベースの検出のためのセクションは、最初に準備する必要があります。構造はパラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋組織ブロックから切り出した5量6μm厚のセクションでうまく動作します。このようなProbeOnプラスに帯電しprecleanedスライド（フィッシャーサイエンティフィック）または同様の同様のセクションを保持するスライドのブランドを、使用してください。我々はまず、デキサメタゾンで処理したアポトーシスラット胸腺13,14としてDNアーゼI -とDNase II型改の両方を含むDNA損傷のよく知られたパターン、とティッシュを使用してからをお勧めします。

1。セクションの準備

  1. 15分間、キシレンでスライドラックや〜からろうを除去するのセクションを配置、さらに5分間新鮮なキシレン槽に移す。
  2. 段階的エタノール濃度を通過することによって再水和する：96％エタノール2x5min、80％エタノール - 5分、水 - 2X5分。
  3. Proteinasとダイジェストセクション電子K.は、セクションごとの50μg/mL溶液の100μLを使用してください。加湿チャンバー内の室温（23℃）でインキュベートする1​​5'。時間は組織の種類に応じて調整が必要な場合があります。硬組織は、もはや消化が必要になる場合があります。 15〜25分の時間が通常使用されています。不十分な消化が弱い信号になることがあります。信号の消失とセクションの混乱の一方の結果でOverdigestion。
  4. 2 × 10分間蒸留水ですすいでください。
  5. preblocking 2％のBSAのセクションあたり100μLを適用します。室温で15分間（23℃）インキュベートする。この時間の間に分子機械を組み立てる。

2。分子機械組立

すべての試薬は、平均的な大きさの組織切片（10x10mm）で単一の検出のために十分である25μL合計体積に対して拡大または縮小されます。必要に応じてボリュームをスケールアップすることができます。

  1. このためには小さなプラスチック製のチューブで組み合わせる。
  1. 蒸留水;
  2. 15％のポリエチレングリコール- 8000;
  3. 、66 mMのトリス塩酸、pH7.5の、5 ​​mMのMgCl 2、0.1mMのジチオエリトリトール、1mMのATP、（すなわち、通常のT4 DNAリガーゼバッファー）の解
  4. オリゴヌクレオチド1の70ピコモル、
  5. 215ピコモル（1.76〜7.1μg）をVACC TOPO
  6. 10単位のT4 DNAリガーゼ（500 U / mL）を
  1. ピペッティングにより穏やかに混合。分子は、このソリューションでは、ほぼ瞬時に自己組み立て構築し、室温（23℃）ですぐに使用できます。温度を37増やす° CのブロックラベルのT4 DNAリガーゼベースのコンポーネント。

3。デュアルラベルの5'OHと5'PO4 DNA切断に組織切片での分子機械を使用する

  1. preblockingソリューションを吸引し、オリゴヌクレオチド1の70ピコモル、53を含む完全な反応混合物の25μlのを適用する - 215ピコモル（1.76〜7.1μg）をVACC66 mMのトリス塩酸、pH 7.5、5mMのMgCl 2を 、0.1mMのジチオエリトリトール、1mMのATP、および15％ポリエチレングリコール- 8000のソリューションでTOPOと10ユニットT4 DNAリガーゼ（500 U / mL）を。単一のFITCラベル、オリゴヌクレオチド2を運ぶ同じシーケンスのオリゴヌクレオチドは、DNA切断の単一のタイプの検出のために代わりに使用することができます。このような場合、標識反応からリガーゼを省略します。また、このような状況で50mMトリス- HCL、pH7.4の、の溶液を15％PEG - 8000を、T4 DNAリガーゼ緩衝液の代わりに使用できます。
  2. プラスチック製のカバー付き加湿チャンバー中、室温（23℃）で1時間インキュベートする。光から保護する。 16に温度の低下° Cがリガーゼベースの信号を減​​少させる、37の温度上昇は、° Cは完全にリガーゼベースの信号を除去する。リガーゼの部分的な阻害は、時々、反応ミックスにはトポイソメラーゼの準備で導入された汚染物質が原因の可能性が発生します。そのため、より長いインキュベーション（2-4時間）が必要になることがあります場合は特に秒リガーゼ標識休憩のignificant番号が存在する。リガーゼとTOPOの信号の両方がこの段階で観察することができますが、多くの例でリガーゼ信号はVACC TOPOと二重標識オリゴヌクレオチドを​​含まない反応混合物の再アプリケーションによってさらに強化されるが、ヘアピン状のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド3）を含むことができる（35 mg / mLの）とT4 DNAリガーゼ（250 U / mL）を。向上させるために信号は、ステップ5に進みます強化なしで反応を見るために、ステップ3に進みます。
  3. 穏やかに室温で水を含むコプリンジャーに垂直にスライドを浸してカバースリップを取り除きます。余分な水分を吸引除去する。
  4. VACC TOPOとオリゴヌクレオチド1なしの反応ミックス25μLを適用するが、オリゴヌクレオチド3を含むことによりリガーゼ信号を強化：66 mMのトリス塩酸、pH7.5の、5 ​​mMのMgCl 2、0.1mMのジチオエリトリトール、1mMのATP、および15％ポリエチレングリコール- 8000、5ユニットT4 DNAリガーゼは、35 mg / mLのオリゴヌクレオチド3（平滑末端ヘアピン）。ラベリングソリューションCAの合計量nが大きいセクションに対応するためにスケールアップする。プラスチック製のカバー付き加湿チャンバー中、室温（23℃）で18時間（一晩）インキュベートする。
  5. 穏やかに室温で水を含むコプリンジャーに垂直にスライドを浸してカバースリップを取り除きます。その後、蒸留水でセクション3 × 10分間洗浄する。
  6. 炭酸水素ナトリウム緩衝液ですすいでください。アルカリ溶液は、pH感受性であり、有意にpHを7以下に下がっているFITCの蛍光を、高めるすすいでください。
  7. antifading溶液（DAPIとVectashield）、カバースリップを持つセクションをカバーし、蛍光顕微鏡を用いて信号を解析する。 5'OHを持つ二重鎖DNA切断は緑、5'PO 4ブレイクを蛍光を発する-赤（図2）は蛍光を発する。

4。代表的な結果

figure-protocol-1
図1半人工分子機械は、2つのタイプのを検出in situで DNA損傷。 VACC TOPOがダブルヘアピン32 - merのために結合すると蛍光マシンは、自身により組み立てます。認識配列の3'末端にカットトポイソメラーゼ製経由でマシンには2つの検出器ユニットに分割すること自体が動作を開始します。 FITC標識ユニットが連続的に分離し、ローダミン標識ユニットに戻ってreligatesサイクリックプロセスでこの結果。検出可能なDNAのブレークが検出されるまでこれが持続します。このような代替アクセプタ（5'OH平滑末端のDNAのブレークが）組織切片内に存在する場合、FITC部分はそれにライゲートされます。残りのローダミンの部分は、T4 DNAリガーゼの助けを借りて、5'PO 4 DNA平滑末端の改行にアタッチされます。その結果、DNA切断の両方のタイプを同時に検出されます。

figure-protocol-2

図2。分子機械デュアルラベルDNA切断の2つのタイプデキサメタゾン処理した胸腺の組織セクションに表示されます。 DNアーゼI -とDNase II型の平滑末端DNAの切断は、アポトーシスを起こした胸腺皮質領域で検出されています。緑色の細胞質蛍光（5'OH DNA切断）がアポトーシスを起こした胸腺細胞の核物質を消化皮質マクロファージをマーク。この信号は、VACC TOPOによって生産され、5'OH二本鎖切断11,12を含むDNAとphagolysosomesに局在している。赤色蛍光（5'PO 4休憩）ラベルマクロファージによる貪食しないアポトーシスを起こした胸腺細胞の核を。胸腺細胞の大規模な数字は同時に、5'PO 4二本鎖切断の発生を伴うアポトーシスを起こすリガーゼベースの標識によって可視化した。これらの改行はリング状のパターンを形成し、核の周囲に配置されています。すべての細胞の核はDAPI（青色蛍光）との対比により可視化。

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ディスカッション

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このビデオでは、我々は、デュアルラベリングDNA損傷のセンサーを組み立て、使用する方法を示します。センサーは、生体分子のエンジン、人工的なコンポーネントにリンクされているウイルスでエンコードされたタンパク質VACCのTOPOによって駆動分子機械です。提示の開発は、非毒性の分子スケールデバイス12,15の設計に生物学的構造、アーキテクチャとセルの実際の部品とコンポーネントを適応提唱バイオ対応のアプローチを例示している。 1：このアプローチは、in vivoでのナノセンサーの分野に特有の二つの問題を解決します。従来のナノ材料を使用してナノ構造真に均一かつ再現することの難しさと、2。潜在的な毒性、およびナノプローブ、粒子と他の高度に分散ナノ材料の高い生物学的反応性。センサーは、DNA損傷のラベリングの新しい機能に、それを再度指示する人工的な成分で、天然に存在する分子機械を統合しています。このような統合の製品はSEです。マイル - 人工分子機械は、新しいタスクを対象。トポイソメラーゼ、ポリメラーゼ及び他の酵素のマシンが頻繁に生化学的研究で使用されていますが、それらは個々の分子アセンブリに...

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開示事項

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利害の衝突は宣言されません。

謝辞

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この研究は、国立神経疾患研究所と脳卒中、国立衛生研究所（VVD）からと神経疾患や脳卒中、国立ARRAを通じて衛生研究所（VVD）とR21の国立研究所からR21 NS064403の補助金によって助成金R01NS062842によってサポートされていました生体イメージングとバイオのEB006301国立研究所、健康（VVD）の国立研究所。

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材料

  1. キシレン
  2. 80および96％エタノール。
  3. 蒸留水でウシ血清アルブミン（BSA）の2％溶液。
  4. オリゴヌクレオチド1：ダブルヘアピン、デュアルフルオレセイン、テトラメチルローダミンで標識した。

5' - AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT GCG TT - 3'AT R、F - FITC - DT; R -テトラメチルローダミン- dTが。このようなBODIPY TR、ローダミンまたはTAMRAなど、他の赤色シフト蛍光体はRとしてテトラメチルローダミンの代わりに使用することができます。

あるいは、オリゴヌクレオチド2を使用することができます - フルオレセインで標識された二重ヘアピンのシングルを（DNA切断のシングルタイプ（DNase処理II型のみ）を検出するための単一フルオロフォアを運ぶプローブはかなり安価で、いつでもシングル便利です。 DNA区切りの種類が分類されることになります：5' - AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T - 3'; F - FITC - dTを

  1. オリゴヌクレオチド3。 T4 DNAリガーゼを用いたin situライゲーションの信号での強化のための平滑末端ローダミン標識ヘアピン：5' - GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC - 3'; R -テトラメチルローダミン- dTを
  2. ワクシニアDNAトポイソメラーゼL（VACC TOPO） - 3000 U /μL（ビビッドテクノロジーズ）。初期の実験では、反応混合物の各25μLあたりVACC TOPO 215ピコモル（7.1μg）を使用。しかし、トポイソメラーゼの濃度が大幅に感度を失うことなく減少させることができます。我々は、後で同じような結果とセクションごとにVACC TOPO（セクションごとに反応ミックス25μLの1.76μg）の4倍より少ない量を使用していました。 880 ngの（反応ミックス25μLで）への酵素の量を減らす弱い信号をもたらしたとVACC TOPOの8.8 ngのは、検出可能なシグナルを産生しなかった。
  3. T4 DNAリガーゼ5 U /μL（ロシュ）。この高濃度のリガーゼの準備は、我々の実験条件における最適な信号を提供します。
  4. T4 DNAリガーゼ用10 ×反応バッファー：660 mMのトリス- HCl、50 mMのMgCl 2、10mMのジチオエリトリトール、10mMのATP、pHが7.5（20℃）（ロシュ）。反応緩衝液中のATPは、容易に凍結を融解の反復的なサイクルで破棄されます。アリコートで小さい15から20μLの部分とストア内のバッファ - 20℃で一度だけ使用してください。
  5. 30％（w / v）の蒸留水でのPEG - 8000の溶液（シグマ）。 15％は反応ミックス中のPEG - 8000を強くボリュームの排除によって、その成分の有効濃度を増加させる、検出を刺激する。
  6. プロテイナーゼK（Roche社）を蒸留水に20 mg / mlのストック溶液。で保管して - 20℃の反応では株式から調製した、PBSで50mg/mLのソリューションを使用してください。再使用しないでください。
  7. DAPIとVectashield（ベクターラボラトリーズ）。
  8. 炭酸水素ナトリウム緩衝液：50メートルM NaHCO 3を 、15メートルのNaCl、pHは8.2。
  9. 22x22mmまたは22x40mmガラスまたはプラスチック製のカバースリップ。プラスチック製カバースリップは、彼らのように、反応中に好ましいセクションから削除するには、簡単に再。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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タグ

DNA K T4 DNA

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