方法論記事

HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

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DOI:

10.3791/3702

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2012年3月26日

 , 
1RNA Biology, New England Biolabs

この記事について

サマリー

本手法では、Gaussiaルシフェラーゼ（GLuc）遺伝子を含む線状化プラスミドから、キャップ付きおよびキャップなしの両方のmRNAを高収量でin vitro合成する方法について解説します。合成したRNAを精製し、キャップなしRNAの一部にVacciniaウイルスキャッピング酵素を用いて酵素的にキャップを付加します。最終ステップとして、mRNAをHeLa細胞にトランスフェクションし、細胞培養上清のルシフェラーゼ活性を測定します。

要約

In vitro転写とは、対応するプロモーター配列（T7、T3、SP6）および転写対象の遺伝子を含む線状DNAテンプレートから、RNAポリメラーゼによってRNA転写産物を合成することである（図 1A）。一般的な転写反応は、テンプレートDNA、RNAポリメラーゼ、リボヌクレオチド三リン酸、RNase阻害剤、およびMg2+イオンを含む緩衝液で構成される。

さまざまなアプリケーションにおいて、高品質なRNAが大量に必要となることがよくあります。 in vitro スプライシングなどのRNAの構造および機能研究において、転写が報告されている。1, 哺乳類細胞におけるRNAi実験2、「エバーワイン法」によるアンチセンスRNA増幅3, マイクロアレイ解析4 およびRNAワクチン研究において5本手法は、放射標識および色素標識プローブの作製にも利用可能です。6ウォーレン、 他 最近報告された、～のトランスフェクションによるヒト細胞のリプログラミング in vitro 転写後のキャップ付きRNA7New England Biolabs社のT7 High Yield RNA Synthesis Kitは、1反応20μlあたり最大180μgのRNAを合成できるように設計されています。本キットを用いて、最大10kbまでの長さのRNAの転写に成功しています。転写対象となる遺伝子の上流にT7プロモーター配列が含まれていれば、線状化プラスミドDNA、PCR産物、および合成DNAオリゴヌクレオチドを転写テンプレートとして使用することが可能です。

真核生物において、RNAへの5'末端キャップ構造の付加は重要なプロセスである。これはRNAの安定性8、効率的な翻訳9、核輸送10、およびスプライシング11に不可欠である。このプロセスでは、RNAの5'三リン酸末端に7-メチルグアノシンキャップが付加される。RNAのキャップ付加は、キャップ付加酵素を用いて転写後に、あるいはキャップアナログを用いて転写同時に行うことができる。酵素法では、Vacciniaウイルスのキャップ付加酵素を用いてmRNAにキャップを付加する12,13。この酵素は、GTPとS-アデノシルメチオニンをドナーとして、RNAの5'末端に7-メチルグアノシンキャップを付加する（キャップ0構造）。どちらの手法においても、トランスフェクションや、リバースジェネティクスシステム用のウイルスゲノムRNAの作製15、eIF4Eなどのキャップ結合タンパク質の結晶学的研究16といった他のアプリケーション14に適した、機能的に活性なキャップ付きRNAが得られる。

以下に述べる手法では、NEB社のT7 High Yield RNA Synthesis Kitを用いて、Gaussia ルシフェラーゼ（GLuc）および Cypridina ルシフェラーゼ（CLuc）のキャップ付きおよびキャップなしRNA転写体を合成します。キャップなしGLuc RNAの一部には、Vaccinia Capping System（NEB社）を用いてキャップ処理を施します。テンプレートDNAとしては、GLucまたはCLuc遺伝子とT7プロモーターを含む直線化プラスミドを使用します。転写されたRNAをHeLa細胞にトランスフェクションし、細胞培養上清中のルシフェラーゼ活性を測定します。キャップ付きCLuc RNAは、GLuc発現を標準化するための内部コントロールとして使用します。

プロトコル

RNaseは一般的に皮膚、毛髪、塵埃、実験室の表面、溶液などに存在します。RNaseによるコンタミネーションを防ぐため、手袋を着用し、使用前にベンチ表面やピペットなどを十分に清掃してください。ヌクレアーゼフリーのピペットチップ、チューブ、ガラス器具、および試薬の使用を強く推奨します。

1. T7 High-yield RNA Synthesis Kitを用いたIn vitro転写

転写反応用のDNAテンプレートには、Gaussia luciferase遺伝子と、コーディング配列の上流にT7プロモーターを含む線状化プラスミドを使用します（図1B）。

  1. T7 High Yield RNA Synthesis kitの構成成分を融解し、氷上で保持する。
  2. キャップなしRNAの場合、室温で以下の順序で反応液を調製する。
成分容量 (μl)最終濃度
ヌクレアーゼフリー水*X 
10X 反応バッファー21X
ATP (100 mM)210mM
CTP (100 mM)210mM
UTP (100 mM)210mM
GTP (100 mM)210mM
鋳型DNA *X1 μg
T7 RNAポリメラーゼミックス2 
合計20 

1 μgのDNAを加え、ヌクレアーゼフリーウォーターを用いて全反応容量を20 μlにします。添加する水の量は、鋳型DNAの濃度によって異なります。

  1. キャップ付きRNAの場合：室温で以下の順序に従って反応液を調製します：
構成要素容量（μl)最終
ヌクレアーゼフリー水*X 
10X反応バッファー21倍
ATP (100 mM)210mM
CTP (100 mM)210mM
UTP (100 mM)210mM
GTP (20 mM)22mM
3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G キャップアナログ (ARCA) (40mM)48mM
鋳型DNA*X1 μg
T7 RNAポリメラーゼミックス2 
合計20 

1 μgのDNAを加え、ヌクリーゼフリー水で全反応量を20 μlに調整します。加える水の量は、テンプレートDNAの濃度によって異なります。

  1. ボルテックスで十分に混合し、ドライエアインキュベーター内で37 °Cで2時間インキュベートする。
  2. ステップ1.3〜1.4を用いて、CLuc遺伝子を含む直線状プラスミドからキャップ付きのCypridinaルシフェラーゼ（CLuc）転写物を合成する。このmRNAは、GLuc発現の標準化（ノーマライゼーション）のため、キャップ付きおよびキャップなしのGLuc mRNAと共に共導入する。

2. テンプレートDNAの除去

精製に進む前に、DNAテンプレートを除去するため、転写反応液にDNase I処理を施します。

  1. 転写反応液にヌクレアーゼフリーウォーター 70 μl を加え、続いて DNase I 反応バッファー 10 μl を加える。
  2. 反応液に DNase I 2 μl を加える。
  3. ドライエアーインキュベーターを用いて 37 °C で 15 分間インキュベートする。

3. キャップ付きおよびキャップなしRNAのカラム精製

  1. 製造元の手順に従い、MEGAclearKitを用いてキャップ付きおよびキャップなしRNAを精製する（スピンカラムベースの任意のRNA精製キットが使用可能である）。
  2. NanoDrop分光光度計を用いてRNAを定量する。
  3. 製造元の手順に従い、Agilent RNA 6000 Nano KitおよびAgilent 2100 Bioanalyzerを用いてRNAサンプルの品質を評価する。

4. Vaccinia キャッピングシステムを用いたRNAキャッピング

  1. 精製したキャップ未付加GLuc mRNAを10 μg分量用意する。

標準的なキャッピング反応では、最大 10 μg（100nt 以上）の RNA をキャッピングできます。より多量の RNA をキャッピングする必要がある場合は、それに応じて反応量をスケールアップしてください。

  1. ヌクレアーゼフリーウォーターを用いて、液量を 15 μl に調整します。
  2. RNAを 65 °C で10分間加熱し、二次構造を除去します。その後、氷上で5分間静置します。
  3. キャッピング反応を準備するために、変性させた 15 μl のRNAに、2 μl の 10X Capping Buffer、1 μl の GTP (10 mM)、1 μl の調製直後の S-adenosyl methionine (2 mM)、および 1 μl (10 units) の Vaccinia capping enzyme を添加します。
  4. 軽くボルテックスして十分に混ぜ合わせ、ドライエアインキュベーター内で 37 °C で30分間インキュベートします。

5. キャップ付RNAのカラム精製

  1. MEGAclear Kitを用いて、キャップ処理したRNAを精製します（スピンカラムを用いた任意のRNA精製キットが使用可能です）。
  2. 製造元の指示に従い、Agilent RNA 6000 Nano KitおよびAgilent 2100 Bioanalyzerを用いて、RNAサンプルの品質を評価します。

6. TransIT mRNA Transfection Kitを用いたHeLa細胞へのトランスフェクション

  1. 10%胎児牛血清を添加したHigh Glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 150 μlを用いて、HeLa細胞を48ウェルプレートに播種する（0.7-2.3 × 105 cells/well）。
  2. 細胞のコンフルエンシーが60-90%になるよう、37 °Cで16-24時間インキュベートする。
  3. GLuc（cappedおよびuncapped）およびCLuc RNAを100 ng/μl濃度に希釈する。

各トランスフェクションは8連で実施します。

  1. エッペンドルフチューブを8本準備する チューブに。各チューブに以下を添加する。 1 μl キャップ未付加GLuc RNA、 1 μl キャップ付きCLuc RNA（標準化用）および 25 μl の無血清DMEMを加える。よく混ぜ合わせる。
  2. エッペンドルフチューブを8本用意し、各チューブに以下を添加する。 1 μl キャップ付きGLuc RNA（キャップアナログ）、 1 μl キャップ付きCLuc RNA（標準化用）および 25 μl 無血清DMEMで。よく混ぜ合わせる。
  3. 8本のエッペンドルフチューブを用意し、各チューブに以下を添加します。 1 μl キャップ付きGLuc RNA（ワクシニア), 1 μl キャップ付きCLuc RNA（標準化用）および 25 μl 無血清DMEMの。よく混ぜ合わせる。
  4. 追加 0.2 μl 最初の8本のチューブにmRNA Boost Reagentを加え、混合する。
  5. 追加 0.2 μl 翻訳最初の8本のチューブのセットにIT mRNA試薬を加え、混合する。
  6. 室温で2〜5分間インキュベートする（5分を超えてインキュベートしないこと）。
  7. HeLa細胞培養液を含むウェルに、トランスフェクション混合液を滴下して加えてください（参照 図3 （プレートセットアップ用）。
  8. 2を用いて、ステップ7から10を繰り返します。nd および3rd 8本1組のチューブ。
  9. 〜にて一晩（16時間）インキュベートする。 37 °C 5% CO条件下で2.

7. Gaussia ルシフェラーゼ (GLuc) アッセイ

BioLux Gaussia Luciferase Assay Kitを用い、以下の手順で各ウェルの上清のGLuc活性を測定します：

  1. BioLux GLuc Assay Buffer 1.5 mlにBioLux GLuc Substrate 15 μlを加えて、新鮮なアッセイ溶液を調製する（サンプル1つあたり50 μlのアッセイ溶液が必要）。サンプル分およびルミノメーターのインジェクターのプライミングに必要な量を調製する（製造元の指示書を参照）。
  2. チューブを数回反転させて十分に混合する（ボルテックスミキサーは使用しない）。

ルミネッセンスは、Berthold Technologies社のCentro LB 960マイクロプレートルミノメーターを用いて測定します。

  1. ルミノメーターの注入量を 50 μl、積分時間を 2-10 秒に設定します。
  2. 各ウェルの細胞培養上清を 10 μl ずつ 96 ウェルブラックプレートに分注します。
  3. インジェクターをアッセイ溶液でプライミングし、発光測定を行います。
  4. 非導入ウェルから得られた値を陰性コントロールとして使用します。

8. Cypridina ルシフェラーゼ (CLuc) アッセイ

BioLux Cypridina Luciferase Assay Kitを用い、以下の手順で各ウェルの上清のCLuc活性を測定します。

  1. キットのマニュアルに従い、新鮮な再構成基質（100x）を調製する。
  2. BioLux Cypridina Luciferase Assay Bufferを解凍し、よく混ぜ合わせる（遮光すること）。
  3. CLucアッセイ溶液を調製するため、BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer 1.5 mlに、再構成基質（100x）15 μlを加える（サンプル1つあたり50 μlのアッセイ溶液が必要）。サンプル分およびルミノメーターのインジェクターのプライミングに必要な量を調製する（製造元の指示を参照）。
  4. チューブを数回反転させてよく混ぜ合わせる（ボルテックスミキサーは使用しない）。
  5. 溶液を室温で30分間保持する（遮光すること）。

ルミネッセンスは、Berthold Technologies社製のCentro LB 960マイクロプレートルミノメーターを用いて測定します。

  1. ルミノメーターを、注入量 50 μl、ディレイタイム 1-2 秒、積分時間 2-10 秒に設定します。
  2. 各ウェルから細胞培養上清を 10 μl ずつ、96ウェルブラックプレートに分注します。
  3. インジェクターをCLucアッセイ溶液でプライミングし、発光量を測定します。
  4. 未導入ウェルから得られた値を陰性コントロールとして使用します。

9. 代表的な結果

T7 High Yield RNA Synthesis Kitを用いると、20 μlの反応あたり最大180 μgの非キャップRNA、および40から50 μgのキャップRNAを合成できます。Agilent 2100 Bioanalyzerで分析した際、品質が良く分解されていないRNAであれば、RNA転写物を表す単一の鋭いピークが示されます。幅の広いピークや複数のピークが現れる場合は、RNAの分解を示しています。また、RNAのサイズを確認することも重要です。予想よりも長いRNA転写物が得られた場合は、テンプレートプラスミドDNAの消化が不完全であった可能性があります。RNAの分解や収率の低下は、通常、テンプレートDNAから反応系に混入した不純物が原因となります。図 2は、品質の良い分解されていないRNAをBioanalyzerで解析した際のエレクトロフェログラムとゲル画像の例です。

キャップ付きおよびキャップなしのGLuc RNAをHeLa細胞にトランスフェクションした後、インキュベーションを行い、細胞培養上清中のルシフェラーゼ活性を測定します。5'キャップ構造は、エキソヌクレアーゼによる分解からRNAを保護し8、mRNAの翻訳開始を促進する9ために重要です。したがって、RNAキャッピングはトランスフェクション実験において不可欠な工程です。共転写（キャップアナログ）法では、約80%がキャップされたRNAが約40 μg得られます。ワクシニアキャッピング酵素を用いたプロトコルでは、1反応あたり最大10 μgのRNA（100 nt以上）を、ほぼ100%の効率でキャッピングできます。

図 4は、キャップ付きおよびキャップなしのRNAサンプルを導入した培養細胞におけるルシフェラーゼ発現の差を示しています。キャップ付きRNAを導入した細胞培養では、キャップなしRNAを導入した細胞（ルシフェラーゼ活性を示さない）と比較して、著しく高いルシフェラーゼ発現が見られることが明確に分かります。さらに、図 4は、キャップアナログを用いる方法とワクチニアキャップ酵素を用いる方法の両方のキャッピング技術が、タンパク質に翻訳可能な機能的なキャップ付きRNA転写物を正常に生成できることを検証しています。t検定から得られた両側p値は0.2583であり、2つのキャッピング方法によるルミネッセンスデータに統計的な有意差はないことが示されました。

T7転写の模式図。DNAテンプレート、RNA転写産物、ヌクレオチド配列のプロセス。

図1A. T7 RNAポリメラーゼによるRNA合成

pCMV-GLucのプラスミドマップ、5764 bp；遺伝子発現、クローニングベクター、制限酵素部位。
図 1B. GLuc遺伝子とT7プロモーターを含むpCMV-GLucベクター。

RNAクロマトグラフィーの結果。キャップなしRNAとキャップありRNAの分析。電気泳動チャート。
図 2. キャップありおよびキャップなしRNAのBioanalyzerエレクトロフェログラムおよびゲル画像。X軸はヌクレオチド（nt）単位のRNAサイズ、Y軸は蛍光単位（FU）を示す。A) 精製後のGLuc mRNA（キャップなし）のエレクトロフェログラム。B) Vaccinia キャップ酵素を用いてキャップ処理したGLuc mRNAのエレクトロフェログラム。C) キャップアナログを用いて共転写的にキャップ処理したGLuc mRNAのエレクトロフェログラム。D) Bioanalyzerによって生成されたゲル様画像。「L」レーンはRNAラダー、レーン1はキャップなしGLuc mRNA、レーン2はキャップアナログを用いてキャップ処理したGLuc mRNA、レーン3はVaccinia キャップ酵素を用いてキャップ処理したGLuc RNAである。

遺伝子発現実験のプレートレイアウト図。サンプルタイプ：uncapped/capped GLuc および CLuc。
図 3. HeLa細胞へのトランスフェクションにおけるプレートセットアップの例。各ウェルには、コンフルエンシーが60-90%のHeLa細胞が播種されている。適切なGLuc RNA（uncapped、キャップアナログによるcapped、またはVacciniaキャッピング酵素によるcapped）、capped CLuc RNA（ノーマライゼーション用）、mRNA Boost Reagent、およびTransIT mRNA Reagentからなるトランスフェクションミックスを各ウェルに添加する。各トランスフェクションは8反復で行う（図中の同色のウェル）。

正規化されたルミネッセンスの棒グラフ。キャップありおよびキャップなしのGLuc RNA。RNA解析結果。
図 4.HeLa細胞におけるGLucの発現。精製したキャップありおよびキャップなしのGLuc mRNAをHeLa細胞にトランスフェクションし、37 °Cで一晩（16時間）インキュベートした。各ウェルの細胞培養上清を用いてGLucおよびCLuc活性を測定し、ルミネッセンス値を記録した。GLucのルミネッセンス値は、キャップありCLuc RNAのルミネッセンス値で正規化した。

GLuc発光比の公式、発光測定、正規化値の方程式、RLU。

* 正規化の前に、非導入細胞からのルミネッセンスをGLucおよびCLucの値から差し引いた。

商標

BioLuxは、New England Biolabs, Inc.の商標です。

TransITはMirus Bio LLCの登録商標です。

MEGAclearはAmbionの商標です。

ディスカッション

In vitro転写は、さまざまな用途に向けて高収量のRNAを得るための有用な手法です。T7 High Yield RNA Synthesis Kitを使用する最大の利点は、RNAの高収量を達成するために組成が最適化されていることです。さらに、キットに含まれる試薬にはヌクレアーゼ汚染がないため、高品質で完全なRNA転写産物を合成できます。本キットは高い安定性と柔軟性を備えて設計されており、mRNA、色素標識RNA、高比放射能放射能標識プローブ、およびキャップ付きRNAの合成に使用可能です。キットのマニュアルには、これらの各用途に必要な特定のプロトコルと追加材料のリストが記載されています。また、PCR産物や合成DNAオリゴヌクレオチドを転写テンプレートとして使用するための技術情報も含まれています。なお、この転写キットではT7プロモーターを含むDNAテンプレートのみが使用可能である点に注意してください。

本記事で解説する手法では、Vaccinia capping enzymeを用いた転写後RNAキャッピングと、RNAキャップ構造アナログを用いた共転写キャッピングについて実証します。これら両方の手法で、トランスフェクション後に機能的に活性を持つキャップ付きRNAが合成されることを示しました。5'キャップ構造はRNAの安定性と翻訳効率を向上させるため、マイクロインジェクション11やトランスフェクション7の実験において重要です。共転写キャッピング法では、約80%のキャップ率を持つRNAを40-50 μg生成します。m7Gの3'-ヒドロキシ基がブロックされた3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA cap analog (ARCA)を使用することで、キャップが正しい方向で組み込まれることが保証される点に注意が必要です17。より大量のRNAをキャッピングする場合、両方の手法において標準的な反応系をスケールアップすることが可能です。しかし、共転写キャッピングでは比較的高価な成分であるキャップアナログを使用するため、コスト面ではVaccinia Capping Systemの方が現実的な選択肢となります。また、Vaccinia Capping Systemはキャッピング効率がほぼ100%に達するため、より優れた手法と言えます。

上述のRNAキャッピング法では、5'末端にCap 0構造を持つRNAを合成します。Cap 1構造は、RNAの5'末端の最初のヌクレオチドのリボース糖の2'-O位に、さらなるメチル化が加わったものです。Cap 1構造はRNAの翻訳効率を高めることが報告されており18、2'-O-メチルトランスフェラーゼを用いることで導入が可能です20, 21。

本論文で述べる手法は、任意のmRNAの転写、キャッピング、およびトランスフェクションに利用できます。本プロトコルでは、多くの利点があることから、特にルシフェラーゼであるGLucおよびCLucを使用しました。これらは細胞培地中に直接分泌されるため、細胞溶解の必要がありません。また、高い生物発光信号強度を示し、活性測定が高感度で容易に実施できるという特徴があります。細胞内でのGLucの発現は、RNA自体の機能以外のさまざまな要因によって影響を受ける可能性があることに注意してください。具体例としては、ピペッティングエラー、ウェルごとの細胞数のばらつき、トランスフェクション効率などが挙げられます。これらの要因を考慮するために、データの正規化が行われます。本プロトコルでは、内部標準としてCLuc RNAをGLuc RNAと共に共トランスフェクションします。GLucの発光強度をCLucのコントロール値で除することで、トランスフェクションにおけるエラーやばらつきが正規化されます19。

開示事項

著者はすべてNew England Biolabs, Inc.の従業員です。

謝辞

Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
T7 High Yield RNA 合成キットNew England BiolabsE2040S
3’-0-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNA キャップ構造アナログNew England BiolabsS1411S
DNase I（RNaseフリー）New England BiolabsM0303S
Vaccinia Capping SystemNew England BiolabsM2080S
MEGAclear キットAmbionAM1908
NanoDrop 分光光度計Thermo Fisher Scientific, Inc.
Agilent RNA 6000 Nano キットAgilent Technologies5067-1511
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AA
TransIT mRNA トランスフェクションキットMirus Bio LLCMIR2250
HyClone* 古典的液体培地：Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High GlucoseThermo Fisher Scientific, Inc.SH30285.01
HyClone 非必須アミノ酸Thermo Fisher Scientific, Inc.SH30238.01
Centro LB 960Berthold Technologies
BioLux Gaussia ルシフェラーゼアッセイキットNew England BiolabsE3300S
BioLux Cypridina ルシフェラーゼアッセイキットNew England BiolabsE3309S
RNase インヒビター（マウス）New England BiolabsM0314
RNase インヒビター（ヒト胎盤）New England BiolabsM0307
pCMV-GLuc コントロールプラスミドNew England BiolabsN8081

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