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I ·クライオキットを使用してマウスの精子の凍結保存と回復

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DOI：

10.3791/3713

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2011年12月12日

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1Genetically Engineered Models and Services, Charles River , 2Research Models and Services, Charles River

この記事について

サマリー

ここでは、マウス精子の凍結保存のための新開発のI•クライオキットを示しています。凍結融解精子を持つ二細胞期胚の開発は、このキットの使用で5マウス系統で一貫して改善された。 1.5年の期間に、49遺伝子改変マウス系統は、I•クライオキットで精子の凍結保存によってアーカイブされ、後に正常IVFによって回収。

要約

マウスの新たな遺伝子組み換え（GM）株の何千もの遺伝子導入やノックアウト技術の出現以来、作成されている。これらの貴重な動物の多くは、緊急の場合のバックアップなしプランで、生きている動物としてのみ存在します。胚の凍結保存は、このバックアップを提供するが、高価であることができる、長い手順である、と一般的には成功のための動物の多数を必要とすることができます。マウスの精子が正常に18％ラフィノース、3％スキムミルクで構成される基本的な凍結防止剤（CPA）で凍結保存することができることが発見されて以来、精子の凍結保存は、アーカイブの配布およびこれらの貴重な株の回復のために受け入れ可能でコスト効果の高い手順となっている。

ここでは、マウス精子の凍結保存のための新開発のI•クライオキットを示しています。近交系マウス五一般的に使用されている菌株からの精子は、このキットを使用して凍結し、回収した。精子の運動性の高い保護率（>60％）と制御（基本CPA）に比べて急速に進行性の運動性（> 45％）5近交系マウスで、このキットで凍結精子のために見られた。回収した精子で体外受精後の二細胞期胚の開発は、調査全5マウス系統で一貫して改善された。 1.5年の期間にわたって、49 GMのマウス系統は、I•クライオキットで精子の凍結保存によってアーカイブされ、後にIVFにより回収。

プロトコル

1。マウス精子の凍結保存

  1. 凍結保存される各行は、開始前に以下を準備。
    1. キットCPAの240リットルの4ウェルディッシュの1ウェル
    2. 次のように15精子の凍結保存ストロー
      1. 注射器に最も近い綿栓で1 mLシリンジに0.25mlのストローを接続します。それぞれのわらでは、次に体外受精培地の8センチメートル（約160μl）を、空気の1cmをロードする。保持される行の名前で藁にラベルを付けます。
  2. LN 2は泡箱の奥深くに15センチメートルでなければなりません。蓋を閉じます。
  3. 凍結保存される各行から2雄マウスを安楽死させる。マウスは、10〜60週齢の間でなければなりません。各マウスから輸精管と一緒に2つ尾副睾丸を削除します。
  4. 事前に準備されたCPA -含む4ウェルディッシュ（ステップ1.1）のウェルに上体を置きます。
  5. 各精巣上体5-7長手方向のカットを作成し、静かに精子を押し出すために、各輸精管を絞る。
  6. 3〜5分間、室温で軽く手でCPAおよび精巣上体混合物を振る。これは、精子が出て泳ぐことができるようになります。
  7. 事前に準備したわらを使用して、精子懸濁液の5mmの（約10μl）を吸引除去し、空気の1cm。
  8. 15ストローの合計で最大で、このプロセスを繰り返します。最高の精子の生存のための10分以内にロードし、シールのストロー。
  9. 慎重にわらの両側をシール加熱する。第一精子の列で凍結キャニスターにストローを置きます。
  10. ハンドルを延長するキャニスターにキットの一部として提供されている1 mlのピ​​ペットを取り付けます。蓋の穴から泡箱にLN 2のキャニスターを置きます。 10分間LN 2で垂直に浮いてキャニスターを許可する。
  11. LN2のキャニスターを浸し。精子は、現在凍結されており、長期的なLN 2ストレージに移動することができます。
  12. キャニスターはには使用しないでください次の行はそれまで、室温まで加温している。

2。マウスの過剰排卵

  1. 一般的に、精子のドナーと同じ背景の若いメスのマウスを使用してください。
  2. マウスは〜12グラム（生後3〜4週間）になります。
  3. 妊馬血清ゴナドトロピン（PMSG）の5〜10 IUと腹腔内注射を行います。
  4. 46〜48時間を待つ。
  5. ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）の5〜10 IUと腹腔内注射を行います。
  6. 収穫の卵母細胞後述するようにhCGを注射後14〜16時間。

3。マウスの精子の回収と体外受精

  1. 体外受精の前に、各ストロー融解するため、以下を準備し、37℃CO 2インキュベーターで1時間以上平衡化します。
    1. 精子の培養皿：ある35ミリメートルペトリ皿、油で覆われた精子処理媒体（STM）の90μlのドロップで。
    2. 料理を切断：卵のコレクションには10秒の最大値からuperovulated女性、体外受精培地3mlワン35ミリメートルペトリ皿。
    3. IVFも：体外受精のための5過排卵女性、体外受精培地の500μlの（。。。あなたが10過排卵女性を使用している場合、たとえば、あなたは2井戸が必要となります）4ウェルディッシュの1つのウェルの各グループについて
    4. 洗濯料理：使用される4もIVFディッシュの各ウェルを洗浄するためのカリウムシンプレックス最適化された培地（KSOM）3mlのワン35ミリメートルペトリ皿
    5. 培養皿：IVFディッシュの各ウェルから胚培養のためのオイルで覆わKSOM培地50μl滴ワン35ミリメートルペトリ皿。
  2. LN 2からわらを外し、2〜3分間37℃の水浴中での場所。
  3. 水浴からストローを取り出して、余分な水分を除去するために拭きます。綿栓最も近い第1の空気の列の近くに最初のカットを行います。体外受精培地にストローをカットすることも、精子の列の前に表示される気柱が存在します。
  4. その後、s内のストローの端をカットecond気柱、精子の列をカットするように注意しながら。 45の角度でカット - これは、精子を吸引することが容易になります。
  5. 200μlのピペッターとストローの先端から精子懸濁液を吸引除去する。
  6. STMのドロップの中心に精子懸濁液を置き、37℃、5％CO 2インキュベーターで45〜60分間皿をインキュベートする。
  7. 精子のインキュベーションの間に、切削皿に過剰排卵の雌の卵管を細かく分析。卵丘 - 卵子複合体（COCs）を放出、各卵管を引き裂くために30gの針やピンセットを使用してください。汚れたメディアが余分な洗浄ステップのためになるように体外受精培地の脂肪と血を避けてください。
  8. 一度、すべての卵管が引き裂かれて、雌5から各IVF井戸にCOCsを転送する。排卵によって生成COCsの数は非常に依存株である。
  9. STMのドロップの周辺から精子の10〜15μlを収集し一体外受精の受精も約14-16時間はhCGのINJを投稿するection。よく使用されるそれぞれの受精を繰り返します。最終的な精子の濃度は約100万/ mlとなります。
  10. 37℃5％CO 2インキュベーターで4〜6時間共培養精子と卵母細胞。
  11. 37℃5％CO 2インキュベーター内で開発するためのKSOM降下で2倍と文化のKSOM最小で胚を洗浄してください。
  12. 体外受精率は、一晩培養した後に使用される総卵母細胞の二つ細胞期胚外として算出した。

4。代表的な結果

5チャールズリバーマウス近交系から精子を凍結させた。保護率は新鮮精子の評価値によって凍結精子の評価値で割って算出されています。精子の運動性の保護率はそれぞれ60.2パーセント、81.3パーセント、78.6パーセント、66.5パーセント、C57BL/6NCrl、129S2/SvPasCrl、FVB / NCrl、DBA/2NCrl、およびBALB / cAnNCrlのための61.0パーセントであった。急速な進歩的な運動のための保護率は47.3％、69.4パーセント、57.0パーセント、52.8パーセント、C57BL/6NCrl、129S2/SvPasの54.1％であった CRL、FVB / NCrl、DBA/2NCrl、それぞれBALB / cAnNCrl、（図1）。

凍結融解精子で体外受精率はそれぞれ55.7パーセント、26.4パーセント、87.3パーセント、C57BL/6NCrl、129S2/SvPasCrl、FVB / NCrl、DBA/2NCrl、およびBALB / cAnNCrlで87.8パーセントと26.2％（図2）であった。

1.5年の期間にわたって、49 GMのマウス系統は、精子の凍結保存によってアーカイブされた。これらの行は、後に正常女性4系統の体外受精（C57BL / 6、BALB / C、DBA / 1と129Sv）（図3）で（として生まれたライブ子犬によって定義される）を回収した。

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図1マウスにおける精子の運動性と急速な進歩運動の保護比

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マウスにおける凍結融解精子と図2。体外受精

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図3。GMのマウスにおける凍結融解精子による体外受精で

ディスカッション

1990年以来、18％ラフィノース、3％スキムミルクを使用して基本的な精子の凍結プロトコルは、マウスの多くの株で信頼性が証明されているとマウス系統の多数は、1,2,3,4,5,6,7を凍結保存されている。凍結と融解過程で精子細胞の損傷の主な原因は、氷の形成8,9および活性酸素種10に関連している。凍結培地のようなモノチオグリセロールなどのアミノ酸などのフリーラジカルスカベンジャー、および還元剤、、補充を調査し、大幅にC57BL / 6 11,6含む近交系における凍結融解精子で体外受精率を高めることが証明されました。

現在のプロトコルでは、我々は市販の抗酸化物質と氷のブロッカーとの基本的なCPAを最適化することで、精子の凍結や体外受精の手順を変更することにより、マウスの精子の凍結保存のために新しいI•クライオキットを開発しました。精子の運動性の保護率（> 60％）と急速進行性の運動性は、（> 45％）I•クライオキットで凍結five近交系マウスからの精子のために見られた。 5マウス近交系における凍結融解精子2細胞期の胚発生率が著しく基本的なCPA 11,6とそれに比べて改善されました。

キットを使用して、ユーザは、各行の2人の男性からの凍結精子で濃縮された精子懸濁液を作成します。唯一の凍結15ストローによってプロセスが簡単に、高速で、短期または長期の保管のための少ないストレージスペースを占有。ほとんどの時間は、マウスの線は、1または2ストローを融解​​することによって回復することができます。

開示事項

著者らは、チャールズ川、このキットのメーカーの社員です。

謝辞

ここで紹介する研究は、チャールズリバーによってサポートされていました。著者らは、動物のケアとホルモンの注射のための遺伝子組み換えモデルとサービスのグループと発生学のスタッフに最も感謝しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CPACharles River Laboratoriesキットに付属
STMCharles River Laboratoriesキットに付属
IVF培地Charles River Laboratoriesキットに付属
0.25 ml プラスチックストローCharles River Laboratoriesキットに付属
精子凍結キャニスターCharles River Laboratoriesキットに付属
ケーンおよびゴブレットCharles River Laboratoriesキットに付属
ミネラルオイルSigma-AldrichM5310胚テスト済みであること
KSOM培地EMD MilliporeMR-106-D
35 mm ペトリ皿Falcon BD351008
ヒートシーラーABTECTISH-200
4ウェルマルチディッシュNalge Nunc international73521-424
ピペッターGilson, Inc.
ピペットチップ各種
37°C + 5% CO2 インキュベーター各種
LN2 保存システム各種
37°C ウォーターバスVWR international89032-196
実体顕微鏡Nikon InstrumentsSMZ800
hCGIntervet Inc.
PMSGEMD Millipore367222
1cc シリンジ（26G 3/8 針付き）BD BiosciencesBD309625
マイクロ解剖用はさみRoboz Surgical Instruments Co.RS-5602
30ゲージ ½ 針BD Biosciences305106
はさみRoboz Surgical Instruments Co.RS-6802
ピンセットRoboz Surgical Instruments Co.RS-5135, RS-5110, RS-5005

参考文献

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