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脳の細胞の不均質性からプライマリミクログリアを分離すると、生理学的および病理学的条件の両方で彼らの役割を調査することが不可欠である。このプロトコルは、機械的な分離と高収率かつ高純度を提供する混合細胞培養技術、実行可能な主なミクログリア細胞について説明します。
ミクログリアは、哺乳類の脳の全細胞人口の約12%を占めています。ニューロンとアストロサイトは神経系の主要な細胞タイプと考えられていますが、ミクログリアは、組織の破片や病原体を監視し、食作用活性を介して実質の恒常性を維持することにより、正常な脳生理学において重要な役割を果たしています1,2。ミクログリアは、神経変性疾患、外傷性脳損傷、神経系感染症など、さまざまな傷害や疾患で活性化されます3。 これらの活性化条件下では、ミクログリアは食作用活性を高め、形態学的および増殖性の変化を受け、活性酸素および窒素種、炎症誘発性ケモカインおよびサイトカインを活発に分泌し、しばしばパラクリンまたはオートクリンループを活性化します4-6。これらのミクログリア応答は神経学的状態における疾患の病因に寄与するため、ミクログリアに焦点を当てた研究が必要です。
脳の細胞の不均一性により、in vivo実験中に高純度のミクログリアサンプル材料を十分に得ることは技術的に困難です。ミクログリアの神経保護機能および神経毒性機能に関する現在の研究では、研究に十分な収量で純粋で健康なミクログリアを一貫して生成するための日常的な技術的方法が必要です。さまざまなダウンストリームアプリケーションのために、混合グリア培養物から純粋な初代ミクログリアを単離するプロトコルをテキストとビデオで紹介します。簡単に言うと、この技術は、新生児ラットの子犬の解離した脳組織を利用して、混合グリア細胞培養物を作製します。混合グリア培養物がコンフルエントに達した後、初代ミクログリアは短時間の振とうによって培養物から機械的に分離されます。 その後、ミクログリアは実験的研究のために高純度でめっきされます。
この方法論の原理とプロトコルは、文献7,8に記載されています。 さらに、初代ミクログリアを単離するための代替方法論がよく説明されています9-12。均質化された脳組織は、密度勾配遠心分離によって分離され、一次ミクログリア12が得られる。しかし、遠心分離は中程度の長さ(45分)であり、細胞の損傷や活性化を引き起こすだけでなく、濃縮されたミクログリアや他の細胞集団を引き起こす可能性があります。別のプロトコルは、培養9-11中に長期(16時間)振とうすることにより、さまざまな生物の一次ミクログリアを単離するために利用されています。 振とうした後、培地上清を遠心分離してミクログリアを分離します。このより長い2段階の単離法は、ミクログリアの機能と活性化を乱す可能性もあります。(1)初代ミクログリアは、不死化したげっ歯類のミクログリア細胞株よりも忠実に生体内生物学をシミュレートする、(2)名目上の機械的破壊により潜在的な細胞機能障害または活性化を最小限に抑える、(3)混合グリア細胞培養を経ることなく十分な収量が得られる、など、いくつかの理由から、主に以下のミクログリア単離プロトコルを利用しています。
このプロトコルは、ミクログリアを分離するために新生仔ラットの仔の脳組織を使用し、ミクログリアを分離するために高齢のラットを使用することは、単離されたミクログリアの収量、活性化状態、および機能特性に大きな影響を与える可能性があることに注意することが重要です。老化はミクログリアの機能障害、神経炎症の増加、神経変性疾患と関連しているという証拠があるため、以前の研究では、老化が重要なパラメーターである神経変性疾患におけるミクログリアの役割をよりよく理解するために、ex vivoの成体ミクログリアを使用していました。 しかし、ex vivoミクログリアは長期間培養することはできません。したがって、このプロトコルは培養中の初代ミクログリアの寿命を延ばす一方で、ミクログリアは成体ミクログリアとは異なる振る舞いをすることに注意すべきであり、in vitro研究をin vivo環境に翻訳する際には慎重に検討する必要があります。
1。新生仔ラットの脳組織の解剖
2。混合グリア細胞集団の準備
3。混合グリア細胞培養のメッキとメンテナンス
4。プライマリミクログリアの分離とめっき
5。代表的な結果
高純度の主ミクログリア培養の結果、上記のプロトコル。としてマクロファージ/ミクログリア細胞特異的マーカー（Iba1）の免疫組織化学によって決定される、メッキミクログリア培養は> 90％純粋（ 図2）です。さらに、アストロサイト、オリゴデンドロサイトとニューロン細胞特異的マーカーを染色すると、最小限の汚染（ 図2）を示しています。混合グリア細胞培養を確立した後、ミクログリアは4つの連続した回まで振とうすることにより単離することができる。初期ミクログリアの分離は、約2.2×106細胞/ mlまたは10フラスコ当たり約9万個の細胞が得られると予想される収量は、それぞれの連続したSHAとともに減少するKE。この方法により単離されたミクログリアが貪食能力など、一酸化窒素の生産として機能し、神経毒性（ 図3）13 から14を調査するために首尾よく使用されています。
図1混合グリア細胞培養、プライマリミクログリアの分離を準備するためのプロトコルの概要。
ミクログリア（IBA-1、赤）、アストロサイト（GFAP、緑）、ニューロン（NeuN、赤）とオリゴデンドロサイト（CC1、赤）は、特定のマーカーを用いて免疫組織化学的分析によって検証として高純度のミクログリアの図2。分離。 DAPI（青）で培養中の細胞のDNAを染色も表示されます。
図3ミクログリアは、メソッドdescriで分離されたベッドは、貪食アッセイ、機能アッセイと神経毒性の研究に限定を含むではなく、多くのアッセイで使用されています。これらの研究で、我々が制御するために露出したミクログリア（IBA-1陽性、緑）、（）またはLPS（B）が扱われているメディアを発見した、定量することができる蛍光標識ラテックスビーズ（赤）、それらの貪食を増加させる（ C）。さらに、LPS（1ng/ml）治療は、ミクログリア（D）で一酸化窒素の産生を増加させることができます。最後に、トランスウェルインサート区切りまたは直接ミクログリア - ニューロン培養の両方を介して、我々は、乳酸脱水素酵素（LDH）放出（E、F）によって測定されたLPSとともにインキュベートしたミクログリアが神経細胞死を誘導できることを見出した。
利害の衝突が宣言されません。
脳の細胞の不均質性からプライマリミクログリアを分離すると、生理学的および病理学的条件の両方で彼らの役割を調査することが不可欠である。このプロトコルは、機械的な分離と高収率かつ高純度を提供する混合細胞培養技術、実行可能な主なミクログリア細胞について説明します。
制服サービス大学の学内プログラムによって資金を供給。
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| 60ミリメートルX 15ミリメートルのペトリ皿 | フィッシャーブランド | 0875713A | |
| シャープ解剖はさみ | ファイン科学ツール | 14094から11 | |
| デュモン＃曲線7bの鉗子標準のヒント、11センチメートル | ファイン科学ツール | 11270から20 | |
| デュモン＃5鉗子標準のヒント、ストレート、11センチメートル | ファイン科学ツール | 11251から10 | |
| 50 mlコニカル遠心チューブ | VWR | 89039-656 | |
| 5ミリリットル血清ピペット | グルニエバイオOne | 606180 | |
| 10ミリリットル血清ピペット | グルニエバイオOne | 607180 | |
| 100μmの滅菌ナイロンセルストレーナー | ファルコン | 35から2360 | |
| 75センチメートル2組織培養フラスコ | コーニング | 430641 | |
| ダルベッコの最小必須培地（DMEM） | GIBCO（インビトロジェン社） | 31053-028 | |
| リーボビッツのL-15培地 | GIBCO（インビトロジェン社） | 11415064 | |
| ウシ胎仔血清 | GIBCO（インビトロジェン社） | 16000-036 | |
| 胎児のウマ血清 | フィッシャー | SH3007402 | |
| ペニシリン - ストレプトマイシン | GIBCO（インビトロジェン社） | 15140163 | |
| 100％エタノール | ワーナー·グラハム·カンパニー | 64-17-5 | |
| リン酸塩は、食塩水、10X、pH7.4を緩衝 | 質生物学、株式会社。 | 119-069-131 | 無菌の蒸留水で1X |
| バイオハザードバッグ | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser科学 | 1492 | |
| cellBIND表面を有する6ウェル細胞培養プレート | コーニング | 3335 |
