脳の細胞の不均質性からプライマリミクログリアを分離すると、生理学的および病理学的条件の両方で彼らの役割を調査することが不可欠である。このプロトコルは、機械的な分離と高収率かつ高純度を提供する混合細胞培養技術、実行可能な主なミクログリア細胞について説明します。 in vitroで研究と下流のアプリケーションに最適です。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
ミクログリアは、哺乳類の脳における全細胞集団の約12%を占めています。ニューロンやアストロサイトが神経系の主要な細胞型であると考えられていますが、ミクログリアは、組織内のデブリや病原体を監視し、食作用を通じて実質内の恒常性を維持することで、正常な脳生理において重要な役割を果たしています1,2。ミクログリアは、神経変性疾患、外傷性脳損傷、神経系の感染症を含む、多くの損傷および疾患条件下で活性化されます3。これらの活性化条件下で、ミクログリアは食作用を亢進させ、形態的および増殖的な変化を起こし、活性酸素種および活性窒素種、炎症性ケモカインおよびサイトカインを能動的に分泌して、しばしばパラクリンまたはオートクリンループを活性化させます4-6。このようなミクログリアの反応は神経疾患の病態形成に寄与するため、ミクログリアに焦点を当てた研究が求められています。
脳の細胞異質性のため、in vivo実験において高純度で十分な量のミクログリア試料を得ることは技術的に困難です。ミクログリアの神経保護機能および神経毒性機能に関する現在の研究では、研究に十分な収量で、純粋かつ健全なミクログリアを一貫して生成するための日常的な技術的手法が求められています。本テキストおよびビデオでは、さまざまなダウンストリームアプリケーションに向けて、混合グリア培養物から純粋な一次ミクログリアを単離するプロトコルを紹介します。簡潔に述べると、本手法では、新生ラット幼仔の解離脳組織を用いて混合グリア細胞培養物を調製します。混合グリア培養物がコンフルエントに達した後、短時間の振盪によって培養物から一次ミクログリアを機械的に単離します。その後、単離されたミクログリアを高純度で播種し、実験研究に使用します。
本手法の原理およびプロトコルは、既報の文献に記載されています7,8。さらに、初代ミクログリアを単離するための代替手法も十分に記載されています9-12。ホモジナイズした脳組織を密度勾配遠心分離することで、初代ミクログリアを得ることができます12。しかし、この遠心分離は中程度の時間（45分）を要し、細胞への損傷や活性化を招く可能性があるほか、ミクログリアおよびその他の細胞集団が濃縮される原因となります。また、培養中の長時間（16時間）の振盪によって、様々な生物種から初代ミクログリアを単離するプロトコルも利用されています9-11。振盪後、培地の上清を遠心分離してミクログリアを単離します。このより長い2段階の単離方法は、ミクログリアの機能や活性化を乱す可能性があります。当研究室では、主に以下の理由から次のミクログリア単離プロトコルを採用しています。(1) 初代ミクログリアは、不死化したげっ歯類ミクログリア細胞株よりも in vivo の生物学的特性をより忠実に再現できること、(2) 機械的な破壊を最小限に抑えることで、潜在的な細胞機能不全や活性化を最小限に留められること、(3) 混合グリア細胞培養の継代を行うことなく、十分な収量が得られることです。
本プロトコルでは、ミクログリアを単離するために新生児ラットの脳組織を使用している点に注意してください。より高齢のラットを用いてミクログリアを単離した場合、単離したミクログリアの収量、活性化状態、および機能的特性に大きな影響を及ぼす可能性があります。加齢がミクログリアの機能不全、神経炎症の増大、および神経変性疾患に関連しているという証拠があるため、加齢が重要なパラメータとなる神経変性疾患におけるミクログリアの役割をより深く理解するために、これまでの研究では成体ミクログリアを ex vivo で使用してきました。しかし、ex vivo のミクログリアを長期間培養し続けることはできません。したがって、本プロトコルは培養下での初代ミクログリアの寿命を延ばすものですが、これらのミクログリアは成体ミクログリアとは異なる挙動を示すため、in vitro での研究結果を in vivo の環境に適用させる際には慎重に検討する必要があります。
プロトコル
1。新生仔ラットの脳組織の解剖
- チルリーボビッツのL-15培地（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％のペン/連鎖球菌）に4℃暖かい培地（DMEM + 10％FBS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）37℃氷の上でエアコンL-15メディアの4-5 mlの4 60X15ミリメートルのペトリ皿を準備します。 100％エタノールを持つすべての手術器具を滅菌する。
- 70％エタノールでP2新生児ラップ子犬をすすぎます。 （P1-P5歳新生児仔ラットは、このプロトコルで使用することができます。）
- 迅速に滅菌鋭いハサミで子犬ラットを刎ねると、70％エタノールにすぐに頭をドロップします。 5仔ラットの合計繰り返した後食塩水に頭を転送します。
- 氷上で5ミリリットルL-15溶液（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％ペン/連鎖球菌） - 4のペトリ皿に頭と場所から全体の頭脳を削除します。
- 1.4リットルの残りの子犬のために - 手順1.2を繰り返します。
- 脳から髄膜を除去し、DESを転送氷の上でL-15溶液（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％のペン/連鎖球菌）の4-5 mlの新しいペトリ皿に赤外LEDの脳組織（ すなわち 、大脳皮質、小脳、全脳、など）。
2。混合グリア細胞集団の準備
- ハサミや刃で脳組織を損傷することなく、滅菌50 mlコニカルチューブに10 mlのピペットで組織を転送します。
- 4℃で5分間2500 RCFで円錐形の遠心
- 上清を吸引除去する。新鮮なL-15培地（レイボビッツL-15 + 0.1％BSA + 1％のペン/連鎖球菌）の4-5 mlを追加します。
- 滅菌した10 mlのピペットでピペットは、組織の上下に10回。
- 新鮮な50 mlコニカルチューブにセルストレーナー（100μm以下の細孔）を配置します。上下にピペット組織は一度滅菌5mlのピペットを用いて、セルのストレーナーにフラッシュピペットを用いて、コニカルチューブに細胞ストレーナーを通して材料を分配する。
- 新鮮なL-15培地（レイボビッツL-15 + 0.1％BS 4-5 mlのセルストレーナーを洗浄します+ 1％のペン/連鎖球菌）。
- 4℃で5分間で2,500 RCFで緊張した細胞と円錐形の遠心分離
3。混合グリア細胞培養のメッキとメンテナンス
- 処理された各ラット子犬の脳については、各フラスコに培養培地（DMEM + 10％FBS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）の12 mlを加えて1滅菌T-75フラスコを準備します。
- ペレット化した細胞からの上清を吸引除去し、細胞ペレットに培地の5-6 mlを加える。 10 mlのピペットで10回ピペッティングします。
- それぞれのT-75フラスコに細胞懸濁液の等量を転送します。
- 1-3週間の合計で37℃5％CO 2インキュベーター内でフラスコをインキュベートします。
- フラスコは、最初の5日間インキュベートし、5日目に、新鮮な培地12 mlを各フラスコに培地を交換し、インキュベーターに戻す必要があります。その後、3日ごとに、合流を達成するために新鮮な培地を12 mlの各フラスコ内の培地を交換してください。これは何されている必要があり細胞が付着フラスコの底に触れることなく、非常に慎重にね。
4。プライマリミクログリアの分離とめっき
- 混合グリア培養が完全にコンフルエントになったら、インキュベーターからフラスコを削除し、環境大気とのガス交換を防ぐためパラフィルムでフラスコのキャップをカバーしています。
- 37℃で1時間に100 RPS（ラボコンパニオンSI-600、Jeioテック）でフラスコを振る℃に
- フラスコ表面に星状膠細胞層を中断せずに10 mlのピペットを用いてすべてのフラスコから培地を収集します。 50 mlコニカルチューブにメディアを配置します。インキュベーターにフラスコと戻りフラスコに新鮮な培地を追加します。
- 4℃で5分間で2,500 RCFでコニカルチューブを遠心分離
- すべてのコニカルチューブから上清を吸引除去する。細胞ペレットは、高純度のミクログリア細胞である。ミクログリアメッキ培地（DMEM + 10％FES + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）を1mlに再懸濁したペレット。
- を使用して再懸濁した培地で細胞密度を数える血球。
- ミリリットル当たりの密度2×10e5細胞を達成するために、ミクログリアメッキメディアの適切なボリュームを追加します。実験的な解析に適したプレート。
- ミクログリアは一晩にアタッチすることができます。
5。代表的な結果
高純度の主ミクログリア培養の結果、上記のプロトコル。としてマクロファージ/ミクログリア細胞特異的マーカー（Iba1）の免疫組織化学によって決定される、メッキミクログリア培養は> 90％純粋（ 図2）です。さらに、アストロサイト、オリゴデンドロサイトとニューロン細胞特異的マーカーを染色すると、最小限の汚染（ 図2）を示しています。混合グリア細胞培養を確立した後、ミクログリアは4つの連続した回まで振とうすることにより単離することができる。初期ミクログリアの分離は、約2.2×106細胞/ mlまたは10フラスコ当たり約9万個の細胞が得られると予想される収量は、それぞれの連続したSHAとともに減少するKE。この方法により単離されたミクログリアが貪食能力など、一酸化窒素の生産として機能し、神経毒性（ 図3）13 から14を調査するために首尾よく使用されています。
図1混合グリア細胞培養、プライマリミクログリアの分離を準備するためのプロトコルの概要。
ミクログリア（IBA-1、赤）、アストロサイト（GFAP、緑）、ニューロン（NeuN、赤）とオリゴデンドロサイト（CC1、赤）は、特定のマーカーを用いて免疫組織化学的分析によって検証として高純度のミクログリアの図2。分離。 DAPI（青）で培養中の細胞のDNAを染色も表示されます。
図3ミクログリアは、メソッドdescriで分離されたベッドは、貪食アッセイ、機能アッセイと神経毒性の研究に限定を含むではなく、多くのアッセイで使用されています。これらの研究で、我々が制御するために露出したミクログリア（IBA-1陽性、緑）、（）またはLPS（B）が扱われているメディアを発見した、定量することができる蛍光標識ラテックスビーズ（赤）、それらの貪食を増加させる（ C）。さらに、LPS（1ng/ml）治療は、ミクログリア（D）で一酸化窒素の産生を増加させることができます。最後に、トランスウェルインサート区切りまたは直接ミクログリア - ニューロン培養の両方を介して、我々は、乳酸脱水素酵素（LDH）放出（E、F）によって測定されたLPSとともにインキュベートしたミクログリアが神経細胞死を誘導できることを見出した。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
このプロトコルは定期的に研究実験のための純粋で健康的なミクログリアを製造するために利用されていますが、手順の重要な部分の間に技術的な側面を慎重に検討は、単離されたミクログリアの変動を最小限に抑えることができます。まず、タイムリーで働く新生児の仔ラットの脳組織の解剖中に組織への酸素および虚血性損傷を最小限にする必要があります。しかし、髄膜の存在がこれらの培養条件下で、その急速な増殖速度に起因する重要な線維芽細胞の汚染に貢献していきますので、完全に、解剖時に脳から髄膜の被覆を除去するためにも重要です。
混合グリア細胞培養の準備中に組織材料の第二に、穏やかな処理は細胞の損傷、死亡、または過度のミクログリアの活性化を制限することも重要です。培地を追加する場合、注意がアストロ月に損傷を与えないように注意する必要がありますolayer。ミクログリアを分離するためにフラスコを振とうしながらさらに、揺れの周波数を調整するスロッシングやメディアの気泡の形成を防止するために必要があるかもしれません。これらのイベントは、星状膠細胞の混入を増やすか、文化への細胞の損傷を引き起こす可能性があります。実験でこ...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
制服サービス大学の学内プログラムによって資金を供給。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| 60ミリメートルX 15ミリメートルのペトリ皿 | フィッシャーブランド | 0875713A | |
| シャープ解剖はさみ | ファイン科学ツール | 14094から11 | |
| デュモン＃曲線7bの鉗子標準のヒント、11センチメートル | ファイン科学ツール | 11270から20 | |
| デュモン＃5鉗子標準のヒント、ストレート、11センチメートル | ファイン科学ツール | 11251から10 | |
| 50 mlコニカル遠心チューブ | VWR | 89039-656 | |
| 5ミリリットル血清ピペット | グルニエバイオOne | 606180 | |
| 10ミリリットル血清ピペット | グルニエバイオOne | 607180 | |
| 100μmの滅菌ナイロンセルストレーナー | ファルコン | 35から2360 | |
| 75センチメートル2組織培養フラスコ | コーニング | 430641 | |
| ダルベッコの最小必須培地（DMEM） | GIBCO（インビトロジェン社） | 31053-028 | |
| リーボビッツのL-15培地 | GIBCO（インビトロジェン社） | 11415064 | |
| ウシ胎仔血清 | GIBCO（インビトロジェン社） | 16000-036 | |
| 胎児のウマ血清 | フィッシャー | SH3007402 | |
| ペニシリン - ストレプトマイシン | GIBCO（インビトロジェン社） | 15140163 | |
| 100％エタノール | ワーナー·グラハム·カンパニー | 64-17-5 | |
| リン酸塩は、食塩水、10X、pH7.4を緩衝 | 質生物学、株式会社。 | 119-069-131 | 無菌の蒸留水で1X |
| バイオハザードバッグ | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser科学 | 1492 | |
| cellBIND表面を有する6ウェル細胞培養プレート | コーニング | 3335 |
参考文献
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17(2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
タグ
