方法論記事

シャッフルDNAファミリーを経由して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療ベクターのエンジニアリングと進化

DOI：

10.3791/3819

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2012年4月2日

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1Cluster of Excellence CellNetworks, Department of Infectious Diseases, Virology, Heidelberg University, 2Department of Infectious Diseases, Virology, Heidelberg University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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我々は分子DNAファミリーシャフリングを介して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）の遺伝子治療ベクターを設計し、進化するための基本的なテクニックを示しています。さらに、一般的なガイドラインや文化やマウスの標的細胞上の強化されたプロパティを持つ個々のキメラキャプシドの選択と分析のための代表的な例を提供しています。

要約

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アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、有益な特性の1のユニークな組み合わせにより、治療用ヒト遺伝子導入のための最も強力かつ有望な車両の一部を表しています。これらは、基礎となる野生型ウイルスと高力価、高純度、臨床グレードの組換えベクター2の生産のための高度な方法論のapathogenicityが含まれています。他のウイルス以上のAAVシステムの更なる特定の利点は、当然、まだすべて簡単に一般的なプロトコルの1,2を使用してベクトルとして操作することができる本質的な特性で異なる血清型に発生するの富の可用性です。また、私たち自身を含むグループの数は、最近、どちらか、複数の入力の血清型の資産、またはその分離、単一の特性を向上させるを組み合わせて合成ベクトルを作成するためのテンプレートとして、これらの天然のウイルスを使用するための戦略を考案した。これらの目標ARを実現するためにそれぞれの技術電子どちらDNA家族シャフ3、部分的相同性に基づいて再組み立てに続いて様々なAAVキャプシド遺伝子のつまり断片化（通常はほとんどのAAV血清型のために> 80％）、またはペプチドディスプレイには通常7つのアミノ酸の4,5、 すなわち挿入ペプチドは、理想的に所望の細胞型への再ターゲティングを媒介ウイルスキャプシドの露出したループ。最大の成功のために、両方の方法は、約100万の異なるカプシド変異体のライブラリを生成するためにプロトコルがアップスケーリングされることにより、高スループットな方法で適用されます。各クローンは、その後多数の親ウイルスのユニークな組み合わせ（DNAシャフリングア​​プローチ）から構成されるか、同じウイルスのバックボーン（ペプチドディスプレイアプローチ）内の独特のペプチドが含まれています。その後の最後のステップでは、ほとんど、または選択プロセスの理想的なすべての要件を満たす個々のカプシドを濃縮するために、標的細胞上のそのようなライブラリの選択を繰り返します。後者は、好ましくは、櫛抗AAV抗体と反応するすべてのキャプシドのインスタンスを除去するための負の選択とそのような興味のある特定の細胞型の成長としてINES正圧、、、。この組み合わせは選択を生き残った合成キャプシドは、おそらく任意の天然AAV分離で発見されなかったであろう方法で、特定のアプリケーションのニーズと一致している可能性が高くなります。ここでは、DNAのファミリー2つの技術の理論と実験のより困難なようにメソッドをシャッフルに焦点を当てています。我々は、記述し、実証するシャッフルAAVライブラリの生成と選択（ 図1）の重要なすべての手順を実行し、次に1つのニーズは、分子AAVの進化を成功させるために注意すべきことのプロトコルの落とし穴や重要な側面について説明します。

プロトコル

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1。 AAVキャプシド遺伝子をコードするプラスミドセットの準備

  1. その後のDNAシャッフリングのための様々なAAVキャプシド（ キャップ ）の遺伝子の十分な量の日常的な準備を容易にするために、最初に共通のプラスミドバックボーンにこれらの遺伝子をサブクローニング。 nested PCR法およびクローニングのためのプライマー結合部位（ 図2）として後で使用するために> 20のヌクレオチドの同一のフランキング配列を含めることが重要です。
  2. （AAV5のための例示的なプライマーは、表を参照）、適切なプライマーを用いて、PCRは通常、選択肢のcap遺伝子の隣にAAV2 rep遺伝子を含む一般に入手可能なAAVプラスミドから目的のcap遺伝子を増幅する。 PCR産物は標準的なクローニングのために使用されるため、製品の精製〜1μgのは、すでに十分であり、任意の従来のPCRプロトコルが故に使用することができます。
  3. 精製PCR産物（ 例えば 、アガロースゲル精製または標準的なPCR精製キットを使用）とダイジェスト受信者、その認識部位キャップ増幅 （1.1）のためだけでなく、プラスミドの受信に使用するプライマーに存在する制限酵素でプラスミド。彼らはほとんどのAAVのには存在しないように私たちの研究室では、 パックマン私と ASC I....

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ディスカッション

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ここでは、DNAシャフリングを介して家族や細胞や動物の進化に不可欠な実験の手順およびAAVキャプシドエンジニアリングのためのガイドラインを概説しています。本質的には、これらのプロトコルは、2008年3我々は最初のAAVのフィールド内で報告手順の標準化バージョンです。他の人の研究のフォローアップの突風は、多くの変更、 例えば 、10から13を報告しているが、我々の現在のバージョンでは、アップスケーリングし、あらゆるニーズへの適応への従順ながら再現性のある結果をもたらす基本的な戦略を表しています。

全体の手順を標準化するために我々の努力にもかかわらず、いくつかの手順は、まだ試行錯誤ベースのアプローチを必要とします。これは特に、DNase Iで、このようなインキュベーション時間などの反応条件は、（ 図の例を参照してください。3）に非常に敏感であるという事実に起因するcap遺伝子の断片に適用されます。我々は、範囲の開始断片.......

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開示事項

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すべての著者は、開示することは何もないことを宣言します。

謝辞

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作者は感謝してハイデルベルク大学で優秀CellNetworksのクラスタで同様にチカとハインツシャラー（CHS）の基礎によって彼らのラボは、チームメンバーとの仕事の優れたサポートを認める。我々はDNAファミリーシャフリングを介して分子のAAVの進化は、三年前に我々の最初の出版以来、非常にアクティブなフィールドになるので、仕事に関連する出版物のすべての著者に謝罪しました感謝は、スペースの制約からここでは引用できませんでした。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前 会社 カタログ番号
DNアーゼI インビトロジェン 18068-015
ポリエチレンイミン（PEI） Sigma-Aldrich社 408727
制限酵素 NEB さまざまな
T4 DNAリガーゼ NEB M0202T
ゲル抽出キットキアゲン 28704
备考IIポリメラーゼキット Finnzymes（NEB） F-540S
HotStarハイファイポリメラーゼキットキアゲン 202602
DMSO Finnzymes（NEB） F-540S（キットの一部）
EDTA（25mM）のインビトロジェン 18068-015（キットの一部）
トリスロート 4855.2
アンピシリンナトリウム塩ロート K029.2
のdNTP（10mMの、100μl）をインビトロジェン 18427013
イオジキサノール（OptiPrep） 軸シールド 1114739
Phenolred メルク 107241
プラスミドメガ準備キットキアゲン 12181
超遠心 Beckman-Coulter社オプティマL90K
クイックシールの遠心チューブ Beckman-Coulter社 342414
エレクトロ·ユニットバイオ·ラッド GenePulserXcell
サーマルサイクラーエッペンドルフ Vapo保護
加熱ブロック BIOER MB-102
蛍光顕微鏡オリンポス IX81
FACSアナライザ Beckman-Coulter社 Cytomics FC500 MLP
MegaX DH10B T1R細胞インビトロジェン C640003
ベンゾナーゼメルク 101695
アデノウイルス-5 ATCC VR-5
プラスミドpBluescript II KS（+） ストラタジーン 212207
cap5F（太字の黄色、cap5特異的配列のパック私のサイト）：
GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC 		IDTDNA カスタムプライマー
cap5R（緑、太字でcap5特異的配列のASC Iサイト）：
GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC 		IDTDNA カスタムプライマー

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
  2. Grimm, D.

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タグ

AAV PCR

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