全体マウス器官の多光子顕微鏡は、光学的にイメージを作成する前に臓器をクリアすることにより可能ですが、そうでない場合、すべてのプロトコルは、蛍光タンパク質の蛍光信号を保持します。エタノールベースの脱水およびベンジルアルコールを用いて光学クリア方法を使用する場合：安息香酸ベンジルのクリアは、YFPを発現全体のマウスの脳の高解像度多画像を示す。
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この記事について
サマリー
要約
全体マウス器官の固有蛍光と第二高調波発生（SHG）の多光子顕微鏡は、光学イメージング前器官をクリアすることによって実現されています。1,2しかし、このようなGFPとYFPなどの蛍光タンパク質を含む器官、メタノールを使用した光クリアプロトコルのベンジルアルコールを使用して脱水およびクリアライト3から保護されていないながら、安息香酸ベンジル（Babbの）は、蛍光シグナルを保持しません。ここで紹介するプロトコルは、神経細胞で発現YFPの蛍光シグナルを保持したまま、マウスの脳で臓器全体の光のクリアを実行するためにした斬新な方法です。臓器が蛍光タンパク質へのダメージを軽減し、多光子イメージングのための彼らの蛍光シグナルを維持するために発見されているエタノール傾斜シリーズを用いて脱水であること、このような光学決済プロトコルを変更すること。4エタノールベースの脱水と光学清算の最適化された方法を使用するとBabbのでクリア遮光しながら、我々は、組織表面の下に2ミリメートル以上のマウスの脳のニューロンにおける黄色蛍光タンパク質（YFP）式の高解像度多画像を示す。
プロトコル
1。動物灌流5と全体のマウス脳のクリア
- 手続きの全体の長さは、脱水工程ごとに使用される時間の長さによって異なりますが、合計で全体のプロセスは2日間で実施することができる。
- YFPマウスを計量してから、深くケタミン/キシラジン（100 mg / kgを10 mg / kg）の腹腔内注射で麻酔。
- 手術に進む前に、深い麻酔の外科プレーンを確認します。動物にそれがしっかりとつま先やテールピンチに反応するかどうかを確認するために5分毎にチェックマークを付けます。動物が反応する場合、ケタミン/キシラジンの補足用量（元用量の1/3）が必要です。
- 一度深く麻酔し、マウスが手術のためにその胸を露出して、仰臥位（背recumbancy）になるように、ラボのテープを使用して手術台に各肢を接着することで、マウスを抑制する。手術台は、通常、金属やプラスチック製のメッシュで作られており、シンクにまたは口を閉ざしてパンの上に置かれるように血液や固定廃棄物は、容易に収集することができる。
- 開始するには、xyphoidプロセス下切開を行います。はさみとピンセットを使用して、胸郭のベースに沿ってカットし、カットがなされると同時に皮膚を引き戻す。心臓が露出したままに止血剤を用いて胸腔から離れて保持されている組織のフラップを作成するために、マウスの胸骨の両側（リブを介して）に沿って2つのカットを行います。
- 心臓の左心室に23グラムの針を挿....
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ディスカッション
標準的な有機色素は、有機溶媒の範囲と互換性があり、したがって、プロトコルをクリアするために特定の課題を提起していませんが、蛍光タンパク質は、溶媒中に変更されることが多いの耐性が低下します。本研究の4つの目標は、重大な限界を克服することであったXFPを蛍光が消失または著しく低下していた以前の光学クリアプロトコル。ここで提示されている画像はYFPの蛍光が維持されていることを実証する。ここに記載された光学清算技術が組織表面下に2ミリメートルまでの全マウス脳におけるYFP標識ニューロンの高分解能イメージングを可能にします。エタノールの脱水を使用して、以前に示したように、また、緑と赤の蛍光タンパク質の信号を保持します。ここに示されている4つの画像は、この光決済技術はそのような明文の蛍光タンパク質、その海馬や大脳皮質など全臓器領域を研究するために適用することができる方法を示しています。高い多光子顕微鏡の分解能の能力も臓器領域内の関心のある特定のセルまたは領域の明確な拡大を可能にします。タンパク質の蛍光を維持するためのキーポイントは固定し、すべてのソリューションは脱水エタノールではなくメタノールを使用すると.......
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開示事項
動物実験では、エール大学の機関アニマルケア＆使用委員会によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。
謝辞
我々は、ビデオ編集の彼の支援のためにヤコブソリスに感謝したいと思います。
この作品は、MJのレーベンへのNSFキャリア賞、DBI-0953902によって部分的に資金を供給された。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名称 | 会社 | カタログ番号 | 注釈 |
| リン酸緩衝生理食塩水 | シグマアルドリッチ社 | D8537 | 500ミリリットル、pHは7.2 |
| パラホルムアルデヒド | 電子顕微鏡学 | 15710 | 10×10ミリリットル、16％パラホルムアルデヒド |
| エチルアルコール | バイオ分析アメリカン | AB00515-00500 | 500ミリリットル、200プルーフ |
| エチルアルコール | Pharmco·プロダクツ | 111000190 | 1ガロン、190プルーフ |
| ベンジルアルコール | シグマアルドリッチ社 | 402834 | 500ミリリットル、99 +％ |
| 安息香酸ベンジル | シグマアルドリッチ社 | B6630-IL | 500ミリリットル、≥99％ |
| 5X/0.5 NA対物 | ニコン | 5Xアリゾナプラン小麦粉 | 15 WD |
参考文献
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017(2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence....
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再版と許可
