の光周波数領域イメージング<em&gt;エクスビボ</em&gt;肺切除標本：組織病理相関へのOne to Oneイメージの入手

サマリー

画像への方法 ex vivoで光周波数領域イメージング（OFDI）と肺切除標本と組織学への正確な相関を得るが、肺病理のための特定のOFDIの解釈基準を開発するために不可欠である、記載されている。この方法では、正確な画像の解釈と評価のための組織構造相関に正確な画像を得るために他の組織型とイメージング技術に適用可能である。この手法で確立イメージング基準は、将来における画像評価に応用できるでしょう研究。

要約

肺がんは、がんによる死亡原因の第1位です¹。扁平上皮癌および小細胞癌は通常、伝導気道に関連して発生しますが、腺癌は一般的により末梢に位置します。疾患プロセスの早期における肺悪性腫瘍の検出は、いくつかの制限により困難な場合があります。すなわち、放射線学的解像度、気道粘膜下の組織評価および早期の病理学的変化の特定における気管支鏡の限界、ならびに組織生検におけるサンプルサイズの小ささやサンプリングの不完全さが挙げられます。光周波数領域イメージング（OFDI）などの高解像度イメージングモダリティは、組織微細構造の非破壊的な広範囲3次元ビューを、最大2 mm近い深さまでリアルタイムで提供します（図 1）^2-6。OFDIは、冠動脈アテローム硬化の評価^6,7や、食道の腸上皮化生および異形成の評価^6,8-10など、さまざまなアプリケーションに利用されています。

気管支鏡下OCT/OFDIは、肺気道を評価するための安全なin vivoイメージングツールであることが実証されています^11-23 (アニメーション)。OCTは、動物モデルの肺気道^16,23および肺実質^17,22、ならびにヒトの生体in vivo 気道^14,15において評価されてきました。正常気道のOCTイメージングでは、気道の層構造や肺胞付着部の可視化が実証されており、異形成病変の評価は気管支粘膜における異形成のグレードを区別するのに有用であることが分かっています^11,12,20,21。気管支粘膜のOFDIイメージングは、短い気管支セグメント（0.8 cm）で実証されています¹⁸。さらに、ブタおよびヒトの肺気道in vivo において、複数の気道世代にわたる体積OFDIが報告されています¹⁹。気管支内OCT/OFDIは通常、標準的な気管支鏡アクセスポートと互換性のある細い柔軟なカテーテルを用いて行われます。また、最近ではOCTおよびOFDIの針状プローブが開発されており、気道壁や胸膜表面を超えた肺領域のイメージングに使用できる可能性があります¹⁷。

OCT/OFDIはin vivo肺イメージングにおいて利用可能であり、その実現可能性が示されていますが、OFDIと組織学的な評価を正確に1対1で対応させた研究は行われていません。そのため、さまざまな肺疾患に対する具体的なイメージング基準はまだ開発されていません。in vivoで得られる組織病理学的対照は小さな生検断片のみであり、これらを大規模なOFDIデータセットと相関させることは困難です。さらに、それらは大容量のOFDIとレジストレーションを行うために必要な包括的な組織像を提供しません。その結果、in vivoの設定では肺病変の具体的なイメージング特徴を開発することができません。肺腫瘍やその他の肺疾患に対する具体的な画像解釈基準を導き出すためには、ゴールドスタンダードである組織学に対して、OFDIで見られる特徴を正確に評価するための、精密に一致した1対1のOFDIおよび組織学の相関が不可欠です。一致した1対1の組織学を用いてex vivoで具体的なイメージング基準が開発および検証されれば、その基準をin vivoイメージング研究に適用できる可能性があります。本稿では、ex vivo肺切除標本における高解像度光学イメージングと組織学との精密な1対1相関法を提示します。本論文全体を通して、OFDI画像と組織学を一致させるために使用した手法について説明します。ただし、この手法はOFDIに特有のものではなく、あらゆる光学イメージング技術において組織学的にレジストレーションされた画像を得るために使用できます。私たちは、特注の気管支鏡用2.4 French（直径0.8 mm）カテーテルを用いて、気道中心のOFDIを実施しました。組織サンプルは、OFDIと組織学の両方で視認可能な組織染料でマークされました。イメージングと組織サンプリングの位置を正確に相関させるために、慎重な方向付け手順が用いられました。本稿で概説する手法は、肺病変を評価するための、組織ベースの診断と精密に相関した体積OFDIの初の実証に使用されました²⁴。この簡便で効果的な手法は、他の組織型にも拡張可能であり、正常組織と疾患組織の両方の微細なイメージング特徴を決定するために必要な、イメージングから組織学への精密な相関を提供できると考えられます。

プロトコル

1。結像系

OFDIの技術的な詳細は^、4月6日以前に記載されている。円周OFDIは毎秒および円形断面画像ごとに512と2048軸深さプロファイル間25〜100フレーム間のイメージング速度で行った。本研究で使用したカスタム2.4 FR（0.8ミリメートル径）ヘリカルスキャンカテーテルは標準的な気管支のアクセスポートを介して動作するように設計されていた。カテーテルは気管支壁とシングルユースアウターシース上に光を集中させるインナー光コアで構成されていた。内核は25〜100 Hzと1.25〜5 mm /秒のプルバック速度で翻訳の間の速度で回転させながらカテーテル本体は、撮像中に静止したままであった。システムの軸方向の分解能は組織に6mmであったと7.3ミリメートル^4-6の画像の範囲の深さを提供しました。カテーテルベースOFDI は 、in vivo気管支OFDI（FI で複製するために、この研究を行ったグレ1）。しかし、このプロトコルはまた、ベンチトップ型光学系（ 図3および4）でイメージングに適用してもよい。

2。セットアップイメージングシステム

1. イメージングシステムの電源を入れ
2. 撮像パラメータ（回転速度、プルバック速度、画像取得率等）を設定し、記録します。本研究で使用したOFDIイメージングシステムでは、画像は10から50 fpsで得られた。
3. ロータリージャンクショ​​ンと引戻し装置にカテーテルを接続します。
4. カテーテルを回転させて画質を確認してください。システムのアライメントを調整し、必要に応じてオフセット。

3。組織標本

1. ベンチトップに卓上使い捨て吸収パッドを配置して、パッドの上に肺標本を設定します。
2. 患者から手術をex vivo標本イメージング場合は、すべての切除マージン（、気管支血管、および実質マージン）は、文書化された評価、および/ ​​または病態によって削除されていることを確認するために病理部門に必ず相談してlogist。
3. 門での切除標本を入力し気管支気道を識別します。ボアシリンジを使用して気道内のいずれかの目に見える粘液を取り除きます。必要な場合は、気道内のより深い吸引に産んシリンジにプラスチックチューブの長いセグメントを添付してください。
4. 興味のある病変を識別するために、試験片の外面を触診する。
5. 微細な金属プローブを用いて、恐る恐る興味のある病変近くまで気管支のツリーをナビゲート。
6. 興味のある病変を可視または気道粘膜下に触知されるまで、プローブに沿って気道を開きます。
7. 慎重に綿棒を持つ病変の上に横たわって気道粘膜から血液や粘液を除去します。
8. 気道粘膜上OFDIカテーテルを入れ、病変が気道粘膜の根底であることを確認すると、組織学的相関のために興味のある高品質の撮像領域を識別するために画像を得る。

4。マーキング組織

1. ステップ3.8で前の画像所見に基づいて、気道内の関心領域を選択します。
2. イメージングの目的の行に沿って組織上の2点を選択してください。ポイントは、目的の結果に応じて、気道の長手方向（ 図2）または円周（ 図3）側面のどちらかに平行であってもよい。スペースドットはこれ以上1.5センチメートル以下のものはばらばらになる組織の部分は、処理のための1つの組織型ブロックに収まる可能性があること。組織学ペア：> 1.5cmの組織の長が必要な場合は、複数の長いマッチイメージングを作成するために関心領域を結んで複数1.5センチメートルに組織の長を分割します。
3. 罰金を浸し、色素を（トライアングルバイオサイエンス、ダーラム、ノースカロライナ州）マーキング組織に開いた穴針（ すなわち 25ゲージ7/8 "長）をひっくり返した。
4. 慎重にのみ針穴の中に組織マーキングインクを残して、ガーゼと針の外から余分なインクを拭き取ってください。
5. で気道粘膜への穿刺組織に対して垂直にイメージングのラインに沿ったポイントを選択した。
6. 気道粘膜上の第2の点について、手順3.5から3.3を繰り返します。
7. インクが離れて穿刺部位から粘膜表面上で動作する場合は、慎重に余分なインクを除去するために、綿棒を使用しています。
8. 存在する場合は、綿棒で気道粘膜の表面に粘液や血液を除去する。
9. インクドットを気道内に円周方向に配置されている場合、それはイメージング分野（ 図3a）で組織をフラット化して気道の二つの側面を開いて固定するのに便利です。

5。イメージングティッシュ

1. マークがOFDI上に表示されないよう保証するには、各インクマークとイメージ上OFDIカテーテルを置きます。マークは非常に散乱粒子を覆うと穿刺部位（ 図3b、図4a、図4g内のインクの粒子に対応する迅速な信号の減衰を、根底に持つ組織構造内の焦点混乱のように表示されます。 ）。
2. インクマーク（s）はOFDI、手順、非可視マークのための4.3から4.7に表示されていない場合。インクマークがOFDIと表示されている場合、5.3に進みます。
3. カテーテル光学系は最初のインクマーク（ 図2b）を超えて組織を覆っているような気道粘膜表面上の2つのインクマークにカテーテルを平行に置きます。軽量のオブジェクトを使用してカテーテルの近位端を固定し、先端部を確保することはモーションアーチファクトを軽減することができます。
4. OFDIのプルバックを収集するに進みます。
5. 両方のインクマークがイメージングで確認できるもので、モーションアーチファクト（ 図3、図4）をチェックするために確保するOFDIプルバック画像を見ることができます。マークが表示されていない場合は、5.4の手順5.1を繰り返します。

6。ティッシュの収集と処理

1. イメージングスキャンの開始、0.3 30cm離れ番目から東洋に気道粘膜組織に緑のインクドット（トライアングルバイオサイエンス、ダーラム、ノースカロライナ州）を配置イメージングのプルバック（ 図2c）で最初に登場した電子インクマーク。
2. 2ブラックインクマークやグリーンインクマークを取り囲む組織を除去する。標準組織学処理カセットに適合するように組織を整える。新鮮な組織を切断することが困難である場合、組織は組織学のために組織を除去する前に固定してもよい。
3. 少なくとも48時間、10％ホルマリンで組織学的処理カセットと修正に置き組織。
4. どんな組織学部門を通じて利用組織プロセッサにおけるプロセス組織、。
5. カットのセクションでは、気道表面上の2つのブラックインクのマークに平行になるようなパラフィンで組織を埋め込む。
6. インクマークのいずれかが表示されているか、全体の組織切片は、いずれか早い方、表示されるまで、パラフィンブロックに直面する組織ミクロトームを使用しています。
7. 一度両方の黒インクマークは、表示されている1厚さ5μmのセクションをカットし、ガラススライド上にマウントします。
8. ごとに5μmの厚さの切片をカットしてマウントし続ける黒インクのマークまでは50μm、可視または組織が終了されなくなりました、いずれか早い方。
9. 標準ヘマトキシリン​​染色するとエオシン（H＆E）染色プロトコールとカバーグラススライドに従ってください。

7。画像処理

画像は卓上スキャナ、またはその両方のインクマークは、単一の断面画像で表示されていた他のスキャン技術で取得した場合、画像は直接対応する組織像と相関させることができる。体積データセットはヘリカルスキャンカテーテルで取得された場合、画像が再補間ので単一の2D画像は組織型との相関のための両方のインクマークを二分することになる必要があります。これは、ImageJのか、他の画像処理ソフトを用いて達成することができる。いくつかのインスタンスでは、インクが隣接切片/スライドを検討すべきで、その場合に容易に見えないかもしれません。

結果

黒インクマークが1の間でなければなりません - 1.5センチは離して関心の撮像領域を示すために。緑色のインクマークはオリエント標本（ 図2及び図3a）の最初の黒インクマークの前に、画像スキャンの先頭に配置する必要があります。組織インクマークがOFDIイメージングと組織学（ 図3、図4）の両方で表示されるはずです。通常の豚（ 図3）、ヒト気道（ 図4）では、典型的な気道の階層化が見えるはずです。上皮（E）は、気道の内腔の側面に薄い、適度に信号高密度、均一な層として表示されます。粘膜固有層は、エラスチンとコラーゲン（EL）を含む信号の強い結合組織などの粘膜固有層（LP）の様々なコンポーネントに対応する組織、および信号貧しい唾液型腺組織（G - 貧しい人々を合図するために組織化された信号強烈で構成されています）。 respiを横断する可視信号貧しいダクト（D）が時折ありますratory上皮は気管支内腔に接続することができます。平滑筋は不連続、散在する平滑筋束のように表示されますので、OFDIで特定することはできません。上の表在密弾性とコラーゲン組織が ​​、深い青色の基礎となる平滑筋現れるトリクロームH＆Eとトリクローム染色、気道の階層化されます（ 図3C、3D、3F、3G、4B、4C、4E、4Fの ）可視化することができ、上汚れ赤（SM）。軟骨リング（C）は、豚気道にオーバーラップし、ヒト気道に重ならないように明確に定義された境界を持つ信号貧しい三日月形の構造として表示されます。軟骨のリングを囲む軟骨膜は、信号貧しい軟骨リングを取り囲む信号激しい組織の薄い層として表示されます。で末梢気道人間（ 図4グラムと4H）、歯槽添付ファイル（A）は、信号ボイド肺胞腔を備えた細い信号激しい格子状の肺胞壁のように見える。粘膜固有層内の血管のスペースはV軽度の基礎となるシャドウ·アーティファクト（矢印）を持つ信号のボイド状または環状構造などisible。

図1。豚気道のOFDI。機械換気下豚気道から得られた体内画像で 。近位気道の（a）はODFI断面。末梢気道の（b）のOFDIの断面。近位気道の（c）にODFI縦断面、赤いハイライト領域でのパネルeの高倍率の画像。末梢気道の（d）にOFDI縦断面図、緑色で強調表示領域でのパネルeの高倍率の画像。近位から遠位への気道の（e）のODFI縦断面図（左から右）。カテーテルの直径は0.8mmであり、目盛りは0.5mm刻みを表します。気道壁と歯槽添付ファイルの異なる層がOFDI画像で識別可能であるが、それは正確な解剖学的協力を解釈することは困難で直接登録することなく、組織学OFDI信号のrrelate。 E：上皮、LP：粘膜固有層、SM：粘膜下層、C：軟骨、：歯槽添付。

図2。豚気道のマーキング組織が ​​あり、（a）1.5センチは離して気道の長手方向の側面に平行に配置された管腔の表面上の2つのブラックインクマークで気道を開いた。 （b）の二つの黒いインクの上に置かOFDIカテーテルはOFDIのプルバック内符の両方が含まれるようにマークします。オリエントへの追加緑色インクマーク試料上イメージングスキャンの開始と（c）の気道。

図3。正確なCORを示す豚気道のOFDIと組織学マーキング組織を使用して関係が。（）気道の周側面に平行に配置腔側表面上の2つのブラックインクマークで気道を開いた。ピンはさらに気道（矢印）を開くために使用されます。両方のインクが見えるマークと（b）の豚気道のOFDIは（アスタリスク）と（c）は正確に相関して組織像はH＆Eで染色（アスタリスク：黒インクが気道上皮に見えるマーク）と（d）の相関は、汚れトリクローム。スケールバー：2ミリメートル。 （f）に対応する組織像はH＆Eで染色及び（g）の相関トリクローム染色とOFDI画像の（e）の高倍率を表示します。 E：気道上皮、EL：濃厚コラーゲンと弾性組織、SM：平滑筋、C：軟骨リング（組織学的アーティファクトは軟骨リングの人工的な分離をもたらした）、G：唾液腺組織、D：上皮を入力唾液管。スケールバー：250μmである。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図4。ヒト気道のOFDIと組織学は、マーキング組織を使用して正確な相関性を示している。（a）の両方のインクを用いてヒト近位気道のOFDIは（アスタリスク）は、可視マーク。黒インクで、H＆Eと（b）を正確に相関して組織型ステンドは、気道上皮（アスタリスク）で表示されるマークと、（c）相関三重染色。スケールバー：2ミリメートル。 （d）はOFDI画像の高倍率図、（e）の対応する組織像はH＆Eと（f）はクロームで染色した。スケールバー：250μmである。 E：気道上皮、LP：粘膜固有層、G：唾液腺組織は、C：軟骨リング、PC：軟骨膜。ヒト気道では、典型的なレイヤリングが見えるようになります。疎性結合組織の中では、赤染色平滑筋の束（SM、パネルCおよびF）が散在している、連続的なバンドを形成しないので、OFDI内の個別の層として表示されていないかどちら。 （g）ヒト末梢気道や呼吸上皮（アスタリスク）で表示される黒インクマークの付いた（h）を正確に相関し、H＆E組織学のOFDI。スケールバー：2ミリメートル。歯槽添付ファイル（A）は、信号のvoid歯槽スペースを持つ信号強烈な格子状の肺胞の壁のように見える。粘膜固有層内の血管のスペースは、根本的な軽度のシャドウイング（矢印）を持つ信号の空隙構造のように見える。

ディスカッション

早期の肺悪性腫瘍の評価は非常に症状や放射線学的または気管支早期の腫瘍性変化を可視化することができないことの不足のために挑戦することができます。 OFDIは組織学的分解能、広い面積リアルタイム^2-6の組織微細構造の3次元ビューの近くに用意されています。気管支OFDIは肺気道^11月13日 （ アニメーション ）に長い気道セグメント上で高解像度の体積のデータセットを得るために使用することができる安全な手法として患者で実証されている。しかし、わずかな生検は、肺の病理のための撮像基準の開発のためのOFDIに十分な相関を提供していないin vivo環境での組織病 ​​理学的対応として得られる。正確に肺イメージングで見OFDI機能を評価するためには、組織学的相関に正確に一致する画像を得ることが不可欠である。我々はoに、正確に1つのシンプルで効果的な方法を提示するOFDIと組織学間のNEの相関は、ほぼすべてのex vivoでの組織型にも適用可能であるのex vivo肺切除標本の気道イメージングに適用。撮像条件が一致一対一の組織学とex vivoで確立された後、これらの基準は、次にin vivoイメージングに適用することができます。

関心の撮像領域をマークするために使用される組織色素はOFDIと組織学の両方にはっきりと見える。オリエント組織に簡単なテクニックを使用することによって、インクマークは組織病理の特定可能な撮像特性を決定するためにOFDI機能と組織学的所見の一から一の比較を可能にするイメージングと組織学の両方に相関させることができる。技術は、このように多くの光学イメージングアプリケーションに役立ちながら、安価で実用的です。

生体内環境の中では、このようなレーザーマーキングなどの方法は、組織の方向²⁵に使用されるかもしれません。しかし、t彼気管支生検の小さいサイズはまだ肺の病理のための具体的なイメージング基準を開発するためにin vivo試験で使用する際の制限要因である。 ex vivoでの研究では、in vivoイメージングへの適切な代替として機能するが、いくつかの制限があります。 エクスビボ肺標本は膨張していないとしばしば正常な肺胞構造の外観を変更し、外科的に誘発される無気肺を表示しています。ほとんどの手術肺標本は胸膜表面が検体インフレを妨害、破壊された時に病理凍結切片の評価後に受信されている組織構造の相関に関するマーキングティッシュで外科的に切除された肺組織を膨らませることは技術的に困難である。非病理学的な無気肺は 、in vivo環境の中で見られるアーティファクトでなく、したがって、この制限は 、in vivo肺イメージングにに関係ないでしょう。また、ex vivoでの試験片の血管内の血液の不足がdistinguすることが困難になる可能性が他の信号ボイド構造から血管構造をっぽい。 の in vivo の設定では 、構造上の10月/ OFDIにドップラーOCT / OFDI ^26から28のほか、船舶の識別に役立つだろう。

それらが存在してex vivoでないところモーションアーチファクトは 、in vivo で見られるかもしれない。これは遅い買収率を持つ標準のOCTシステムで潜在的に問題が多いかもしれません。しかし、OFDIシステムの迅速なフレームレートは、現在のところ> 200 fpsの^{29から31。}したがって、それはモーションアーチファクトが大きな問題になることが期待されていません。 生体 OCTおよびOFDIイメージング研究の前には微イメージング機能^14,15,18,19の成功の可視化を実証した。

本研究では、肺の病理学を評価するための組織ベースの診断への正確な相関関係で体積OFDIを実証している。説明する手順は、金standaとして使用されるように正確にマッチした組織像を提供することを意図しているOFDI画像の解釈のためのRD。

一度肺の病理のための具体的なイメージング基準が開発され、一致した一対一の組織学とex vivoで検証されて、基準は、イメージングの金本位アセスメントとして気管支生検の使用と生体イメージング研究の後続にも適用することができる機能が見られる。この手法は、肺切除標本への応用として表示されますが、正常および病理組織両方の微細イメージング機能を決定するために必要な組織構造の相関に正確な画像を提供するために、ほぼすべての組織型に適用することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
組織マーキング染料	トライアングルメディカル	TMD-BK、TMD-G