組合せの合成と高分子膜とナノ粒子のライブラリからのハイスループットタンパクリリース

サマリー

この方法では、生分解性ポリ無水物膜およびナノ粒子のライブラリのコンビナトリアル合成し、これらのライブラリーからのタンパク質放出のハイスループット検出について説明します。

要約

無水物は、優れた生体適合性および薬物送達機能を備えた生体材料の一種である。彼らは従来のワンサンプルを1つずつ合成技術で広く研究されてきたが、より最近のハイスループットアプローチがポリアンヒドリド¹の大きなライブラリーの合成および試験を可能に開発されました。これにより、より効率的な最適化と薬剤およびワクチン送達用途のためのこれらの生体材料の設計プロセスを容易にするでしょう。この作品の方法は、生分解性ポリ無水物膜およびナノ粒子のライブラリーのコンビナトリアル合成し、これらのライブラリーからのタンパク質放出のハイスループット検出について説明します。このロボット操作方法（ 図1）では、リニアアクチュエータ、シリンジポンプは、ユーザーエラーを排除し、ハンズフリーで自動化されたプロトコルを使用可能には、LabVIEW、によって制御されます。さらに、この方法は、赤、ミクロスケールのポリマーライブラリーの迅速な製造を可能に多変量ポリマー系の創出をもたらしながら、バッチサイズをucing。ポリマー合成にこのコンビナトリアルアプローチは、それが従来の1ポリマーを合成するのにかかる時間に相当する量で、15の異なるポリマーまで​​の合成を促進します。また、コンビナトリアル高分子ライブラリ（ナノ粒子）の非溶媒にまたは真空乾燥（フィルム用）による溶媒や降水量のフィルムやポリマーライブラリが解散した場合においてナノ粒子を含む空白またはタンパク質にロードされた幾何学的形状に加工することができます。以前に¹記載の高分子ライブラリに蛍光標識タンパク質をロードする際、タンパク質の放出動態を蛍光ベースの検出方法（ 図2および図3）を用いた高スループットで評価することができる。この組み合わせのプラットフォームは、従来の方法で検証されています^2、ポリ無水物膜およびナノ粒子のライブラリはと特徴づけられているインビトロ細胞毒性、サイトカイン産生、表面マーカーの発現、接着、増殖、分化に ;、ライブラリはタンパク質放出動態、安定性および抗原性のためにスクリーニングされており、 生体内で生体内分布と粘膜付着^{1〜11インチ}ここに開発されたコンビナトリアル手法は、順番に、生体材料の性能を最適化するために、in vitroおよび in vivo でスクリーニングすることができるタンパク質にロードされたナノ粒子及びフィルム·ライブラリーのハイスループットポリマー合成および製造を可能にします。

プロトコル

1。コンビナトリアルライブラリー合成ポリマーは、（高分子化学に変化させる） -ロボットのセットアップについては図1を参照してください。

1. （濃度= 25 mg / ml）を、適当な溶媒中で、各モノマーを溶解し、10ccのガスタイトシリンジにそれぞれロードします。
2. 各注射器の最後に溶媒耐性ルアーロックキャピラリーチューブを取り付けます。
3. シリンジポンプ（新時代プログラマブルシリンジポンプ）に注射器を所定の位置にロックします。
4. 開始位置にリニアアクチュエータ（Zaber）を設定します。
5. リングスタンドのクランプを使用して、モノマーの堆積の開始バイアル/ウェルに両方のキャピラリーチューブの端を置きます。
6. そのよく所望の共重合体の組成に応じてそれぞれにポンプ各モノマーの可変ボリュームをLabVIEWプログラムを開始します。これは、目的のボリュームを分配するためにバイアル/ウェルとし、各ポンプにキャピラリーチューブを下げるためにZ軸アクチュエータを指示することにより、プログラムの中で達成されます。ねーXTは、プログラムは次のバイアル/ウェルの位置に移動するために、そのホームポジションとX軸とYアクチュエータに戻り、Zアクチュエータに指示します。各ウェルは、モノマーの所望の体積がそれに振り込まれるまで、これが行われている。
7. モノマーの堆積後、マルチウェルまたはマルチバイアルモノマーライブラリは、予備加熱真空オーブンに転送され、縮重合反応の持続時間のために真空下でインキュベートした。 CPHの場合：SAの合成反応は、180℃で実施する1.5時間のためのC、0.3トルが、これらの反応条件が異なるポリマーシステム間で異なります。

2。コンビナトリアルブランクおよびタンパク質-ロードされたポリマーナノ粒子及びフィルムライブラリーの作製-ロボットのセットアップについては図1を参照してください。

1. 最初のプログラマブルシリンジポンプ、シリンジ、溶媒（空白のライブラリ）で満たされているか、またはタンパク質を用いた溶媒は、第二注射器で注射しながら（タンパク質 - ロードされたライブラリ）に分散ポンプが空のままになっている。隣接したサンプルホルダー内のナノ粒子製造用のチューブ（非溶媒を別の溶媒の比率は1から100です）、非溶媒で満たされている。映画製作のための空のマルチウェルプレートは、隣接する試料ホルダーにチューブの代わりに利用されています。
2. LabVIEWプログラムを使用し、溶媒は、ライブラリのすべてのポリマーバイアル/ウェルに堆積（濃度= 20 mg / ml）を、1〜5分間インキュベートする。オプションの超音波処理ステップ（40 Hzで30秒）が完了したポリマー溶解を確実に導入することができる。
3. 次に、個別のLabVIEWプログラムを開始することによって、サンプルが空の注射器内に引き込まれており、隣接する試料ホルダーに非溶媒（ナノ粒子）または空の井戸（フィルム）のそれに対応する管に堆積した。
4. このプロセスは、個別のポリマーライブラリの各組成物について行われている。
5. ナノ粒子またはフィルム·ライブラリーは、次に溶媒と非溶媒除去（ナノ天秤座のために真空チャンバ内に配置されているRYも）真空ろ過を使用して回復できます。

3。ハイスループットなタンパク質の放出動態

1. 、ポリマーライブラリーからハイスループットタンパク質の放出動態を調査するための96（2ミリリットル/ウェル）ディープかなって、ポリプロピレン板が変更されているように、上部隣接する列の井戸の壁の1/3（例：AとB、 CとD、EとF、G及びH）をウェルに隣接して削除されます。タンパク質にロードされたフィルムはで作製またはナノ粒子は、高スループットの放出動態の研究を実行するために、このプレートに移さなければなりません。タンパク質にロードされたナノ粒子またはフィルムサンプルは唯一の隣接する列（A、C、E、およびG EX）の1つのウェルに配置する必要があります。詳細については、 図4を参照してください。
2. 96深いかなっリリースプレートにナノ粒子の移転後、粒子を沈降させています。 PBS緩衝液（0.1mMの液、pH7.4）を徐々に（列A、C、EとG）の各サンプルウェルに添加し、その後、それぞれの隣接ウェルに（列A、B、D、F、およびH）の井戸がいっぱいになると、バッファが隣接している井戸の間を流れる解放されるまで。ナノ粒子の場合、このプロセスでは、粒子がサンプルウェルの底部（列A、C、EとG）のままとよく隣接リリースに移す（列A、B、D、Fのないことを確認するために余分な注意を払って行う必要がある、およびH）。いくつかのケースでは、遠心分離（カラムA、C、EとG）サンプルウェルの底部にナノ粒子のサンプルを定位させることが求​​められる。
3. 次に、リリースプレートは蓋で密閉し、実験期間中に撹拌しながら所望の温度（ すなわち 37℃）に配置されます。
4. 増分の時点（ すなわち 0.04、1、2、3、5、7、9、12、15、19、24、30日）にリリースさ蛍光標識タンパク質の量は、9400台風フラット蛍光スキャナーを用いて定量化されている（ GEヘルスケア）。リリースプレートは、スキャナの表面上に配置され、適切な励起レーザーや発光filteを使用してスキャンRS、およびリリースウェル（列A、B、D、FおよびH）でリリースされたタンパク質の蛍光強度（イメージクワント）定量化される。これは、既知の濃度のタンパク質標準は蛍光消光のためのタンパク質量とアカウンティングを計算するためのウェルプレートに含まれていることが示唆された。

4。代表的な結果

ポリマーライブラリの製作時には、キャラクタリゼーションはこのコンビナトリアル手法^1,7,8,11を検証するために^、1 H NMR、GPC、およびFTIRを用いて行われています。 10,000〜20,000の分子量の範囲は、g / molで、多分散指数の範囲は1.5から3.0で、化学組成は、正確かつ無水物の合成^12月15日 、従来の方法との合意であることが示されている。同様に、ナノ粒子のライブラリのSEM画像は、従来から製造されたナノ粒子のその²と同様の表面形態、サイズ、サイズ分布を示した。タンパク質リリースkineti無水物ナノ粒子またはフィルムからのCSは、以前説明したように修正された¹ウェルプレート中で行われる。結果は、タンパク質のローディングおよび高分子化学（ 図2及び図^{3）1,12,14,16}依存バーストの有無にかかわらず近似ゼロ次の放出を明らかにした。

図1コンビナトリアル高分子膜とナノ粒子の製造装置。

図2 CPHからアルブミンテキサスレッドウシ血清（TRBSA）のハイスループットリリース：SAのポリマーナノ粒子のライブラリ。 CPH-リッチポリマーの化学的性質は最も遅いを離すのに対し、SA-リッチポリマーの化学的性質は、最も急速にTRBSAカプセル化解除してください。エラーバーは標準偏差を表すると、n = 4である。ピーターセンらの許可を得て転載。ら ^1。著作権2010 American Chemical Societyの。

図3 CPTEGからアルブミンテキサスレッドウシ血清のハイスループットリリース（TRBSA）：CPHポリマーフィルムライブラリ。 CPH-リッチポリマーの化学的性質は最も遅いを離す一方CPTEG富む高分子化学は、最も急速にTRBSAカプセル化解除してください。エラーバーは標準偏差、n = 3の場合を表しています。

図4： "の前に"隣接する二つの井戸を示す画像と96ディープかなっポリプロピレン板で"の後に"修正。右側の "後"修正画像も、カプセル化された蛍光分子を有するポリマーフィルム（左の井戸の底）を添加することを示して緩衝溶液中に2ウェル間で放出される。放出された蛍光分子は、その後よく右側で検出される。

ディスカッション

必要な合成条件と合成されるポリマーのガラス転移温度_（Tg s）の知識は、ライブラリの製作のために不可欠です。 _T gはsが室温以下である場合には、ナノ粒子の製造工程は、ポリマー_の Tg以下に制御された温度環境で実施する必要があるかもしれません。さらに、注意が高温や溶剤に接触するすべての機器がそれらの条件を処理するために適合しなければならないことを保証するために取られるべきである。このプロトコルのパラメータのいくつかは、合成または粒子/フィルムのために異なるポリマーシステムに対応するために（ すなわち 、温度、真空、インキュベーション時間、溶媒、非溶媒、ポリマー濃度、非溶剤の溶剤比率等）を調整することができる製造。いくつかのケースでは、ナノ粒子は（真空乾燥して溶媒を除去するのに十分な）長い期間のために溶媒中で安定していないので、2つの代替溶剤レム楕円形の方法を用いることができる。 1）粒子がゆっくりと、遠心分離し上清を、溶媒をデ​​カントし、残りの粒子は、乾燥または2）粒子を真空濾過によって分離することができ、その後、乾燥させることができる。ブランクまたは...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
名前	会社	カタログ番号
電動XYZステージ：3倍、T-LSM050A、軸当たり50ミリメートル旅行	Zaberテクノロジーズ	T-XYZ-LSM050A-KT04
NE-1000シングルシリンジポンプ	新時代のヒートポンプシステム	NE-1000
パイレックス* Vista *のリムレス再利用可能なガラス培養管	コー​​ニング	07-250-125
ガラスキュベット	科学的な戦略	G102
LabVIEWの	ナショナルインスツルメンツ	776671から35
SGEのガスタイトシリンジ、ルアーLocの	シグマアルドリッチ	509507
U96ディープウェルプレート1.3ミリリットルと2.0ミリリットル	サーモサイエンティフィック：ヌンク	278743
まあキャップマット	サーモサイエンティフィック：ヌンク	276000
台風9400	GEヘルスケア	63-0055-79
ワットマングレード50円90ミリメートル	ワットマン	1450-090