本稿では、RAW 264.7細胞による無水物ナノ粒子や細菌の内在化を定量化するためにマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを利用する方法について説明します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
ナノシステムでは、抗原提示細胞へのタンパク質、1-5など、効率的に貨物を提供する能力を介してワクチンデリバリーの貴重なツールとして浮上している。抗原提示細胞によるナノ粒子の内在化（NP）がカプセル化された抗原に対する効果的な免疫応答を生成するための重要なステップです。ナノ粒子製剤の影響関数の中でどのように変更を決定するために、我々は内面化ナノ粒子と同様に細菌を検出すると互換性のある高スループット、定量的な実験的なプロトコルを開発しようとした。現在までに、2つの独立した技術、顕微鏡やフローサイトメトリーでは、ナノ粒子の食作用を研究するために使用されるメソッドでした。フローサイトメトリーのハイスループットな性質は堅牢な統計データを生成します。しかし、低解像度のために、それは正確にセル結合したナノ粒子の対内在化、定量化に失敗しました。顕微鏡は、高空間分解能で画像を生成します。However、それは時間がかかり、小さなサンプルサイズの6-8を伴います。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー（MIFC）の層コアを介して同時にマルチカラースペクトルの蛍光と明視野イメージングを行う顕微鏡やフローサイトメトリーの両方の側面を組み込んだ新しいテクノロジです。この機能は、蛍光シグナル強度と異なる構造と高速で携帯電話の機能間の空間関係の正確な分析を提供します。
ここで、我々は、無水物ナノ粒子またはサルモネラ血清型Typhimuriumのを内面化した細胞集団を特徴づけるためにMIFCを利用する方法について説明します。我々はまた、ナノ粒子懸濁液、細胞標識、のImageStream Xシステム上で収集やアイデアのアプリケーションを使用してデータの分析の準備について説明します。また、インターナリpを区別するために使用することができる技術の応用を実証するアクチンを介した貪食の阻害剤としてサイトカラシンDを用いてナノ粒子と細菌のathways。
プロトコル
1。 RAW 264.7細胞培養
- 彼らはセルスクレイパーで軽くこすることでコンフルエントに達する彼らのフラスコから収穫RAW 264.7細胞。 0.5 mLの5×10 5細胞/ウェルの密度で24ウェル細胞培養皿にカウントし、プレート、それらを完全にダルベッコ改変イーグル培地（cDMEM、10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、2mMのグルタミン、および10mM HEPES）、5％CO 2インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートする。
2。病原性のサルモネラ血清型Typhimuriumの14028変容と文化
- Sに緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する組換えプラスミドを導入します。エレクトロポレーションによる菌。まず、LBブロスにサルモネラ血清型Typhimuriumの（ATCC 14028）の培養を準備し、通気しながら37℃で一晩インキュベートする。
- 翌日、遠心の最大速度での細菌のペレットを1mL。細胞をfoを洗う（ - （N-モルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）、20％グリセロール緩衝液1 mm 3）を静かにそれぞれの洗浄から9までのピペットでペレットを再懸濁することにより冷MOPS /グリセロール溶液1mLとウル回。最終洗浄後、pAKgfp1またはpAKgfplux1プラスミ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
研究では、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸（PLGA）または無水物に基づく生分解性ナノ粒子は標的細胞にカプセル化された抗原または薬を届けるために使用することができることが示されている。貪食細胞によるこれらのナノ粒子の取り込みはこのように定量的な作成、その有効性のために重要である。小説ナノ粒子デリバリーシステムを設計する上で重要な内在化の分析は、このメソッドを使用することにより、種々の細胞型によるナノ粒子の差取り込みが容易に分析することができます日付は、従来の顕微鏡とフローサイトメトリーには、粒子の取り込みを定量化するために使用されているが、それぞれを高いスループットと内在化を研究するための代替的なアプローチの解像度の呼び出しでの制限は、この記事では、我々の特徴と食作用の生物学的プロセスは、ターゲット·細菌性病原体と合成ナノ粒子の2種類のどのように異なるかを比較するMIFC分析を実行します。
MIFC phagocytosアッセイは、ナノ粒子に比べサルモネラの取り込みのメカニズムの違いを描くために使用されたされています。これは、阻害剤はそれらのインキュベーショ.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
Sherree L.の友人は、のImageStream Xシステムを製造してAmnis株式会社で採用されています。
謝辞
著者は金融のためにONR-MURI賞（NN00014-06-1から1176）、米国陸軍医学研究および資材コマンド（グラント番号W81XWH-09-1から0386までとW81XWH-10-1-0806）に感謝したいサポートされています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| RAW 264.7細胞株 | アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC） | TIB-71 | |
| ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） | Cellgro | 10から013-CV | |
| ウシ胎仔血清 | アトランタバイオ | S 11150 | プレミアムグレード |
| グルタミン | ギブコ | 35050-061 | |
| HEPES | ギブコ | 15630-080 | |
| 24ウェルプレート | TPP | 92024 | |
| 細胞培養フラスコ | TPP | 90151 | |
| セルスクレイパー | TPP | 99002 | 24センチメートル |
| サルモネラ血清型Typhimuriumの | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630エレクトロ細胞マニピュレータ | BTXハーバード装置 | ||
| MOPS | フィッシャー·サイエンティフィック | BP308 | |
| リン酸緩衝生理食塩水（PBS） | Cellgro | 21から040-CV | |
| 超音波液体プロセッサ | MISONIX | S-4000 | |
| サイトカラシンD | Sigma-Aldrich社、 | C8273 | |
| ホルムアルデヒド | ポリサイエン | 04018 | |
| 洗浄バッファーを | 2パーセント熱不活性化FBS、PBS中0.1％アジ化ナトリウム。 | ||
| 洗浄バッファーを/パーマ | BDバイオサイエンス | 554714 | |
| スナップキャップのマイクロチューブをクリア表示 | シグマ | T4816 | |
| のAlexa Fluor®ファロイジン660 | インビトロジェン | A22285 | |
| のImageStream X | Amnisコーパスる | 100200 | オプション：658nmレーザー、オートサンプラ |
| アジ化ナトリウム | フィッシャー·サイエンティフィック | S 227I-500 |
参考文献
- Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642(2011).
- Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jac....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
