マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

Summary

本稿では、RAW 264.7細胞による無水物ナノ粒子や細菌の内在化を定量化するためにマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを利用する方法について説明します。

Abstract

ナノシステムでは、抗原提示細胞へのタンパク質^、1-5など、効率的に貨物を提供する能力を介してワクチンデリバリーの貴重なツールとして浮上している。抗原提示細胞によるナノ粒子の内在化（NP）がカプセル化された抗原に対する効果的な免疫応答を生成するための重要なステップです。ナノ粒子製剤の影響関数の中でどのように変更を決定するために、我々は内面化ナノ粒子と同様に細菌を検出すると互換性のある高スループット、定量的な実験的なプロトコルを開発しようとした。現在までに、2つの独立した技術、顕微鏡やフローサイトメトリーでは、ナノ粒子の食作用を研究するために使用されるメソッドでした。フローサイトメトリーのハイスループットな性質は堅牢な統計データを生成します。しかし、低解像度のために、それは正確にセル結合したナノ粒子の対内在化、定量化に失敗しました。顕微鏡は、高空間分解能で画像を生成します。However、それは時間がかかり、小さなサンプルサイズの^6-8を伴います。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー（MIFC）の層コアを介して同時にマルチカラースペクトルの蛍光と明視野イメージングを行う顕微鏡やフローサイトメトリーの両方の側面を組み込んだ新しいテクノロジです。この機能は、蛍光シグナル強度と異なる構造と高速で携帯電話の機能間の空間関係の正確な分析を提供します。

ここで、我々は、無水物ナノ粒子またはサルモネラ血清型Typhimuriumのを内面化した細胞集団を特徴づけるためにMIFCを利用する方法について説明します。我々はまた、ナノ粒子懸濁液、細胞標識、のImageStream ^Xシステム上で収集やアイデアのアプリケーションを使用してデータの分析の準備について説明します。また、インターナリpを区別するために使用することができる技術の応用を実証するアクチンを介した貪食の阻害剤としてサイトカラシンDを用いてナノ粒子と細菌のathways。

Protocol

1。 RAW 264.7細胞培養

1. 彼らはセルスクレイパーで軽くこすることでコンフルエントに達する彼らのフラスコから収穫RAW 264.7細胞。 0.5 mLの5×10 ⁵細胞/ウェルの密度で24ウェル細胞培養皿にカウントし、プレート、それらを完全にダルベッコ改変イーグル培地（cDMEM、10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、2mMのグルタミン、および10mM HEPES）、5％CO ₂インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートする。

2。病原性のサルモネラ血清型Typhimuriumの14028変容と文化

1. Sに緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する組換えプラスミドを導入します。エレクトロポレーションによる菌。まず、LBブロスにサルモネラ血清型Typhimuriumの（ATCC 14028）の培養を準備し、通気しながら37℃で一晩インキュベートする。
2. 翌日、遠心の最大速度での細菌のペレットを1mL。細胞をfoを洗う（ - （N-モルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）、20％グリセロール緩衝液1 mm 3）を静かにそれぞれの洗浄^{から9まで}のピペットでペレットを再懸濁することにより冷MOPS /グリセロール溶液1mLとウル回。最終洗浄後、pAKgfp1またはpAKgfplux1プラスミ....

Discussion

研究では、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸（PLGA）または無水物に基づく生分解性ナノ粒子は標的細胞にカプセル化された抗原または薬を届けるために使用することができることが示されている。貪食細胞によるこれらのナノ粒子の取り込みはこのように定量的な作成、その有効性のために重要である。小説ナノ粒子デリバリーシステムを設計する上で重要な内在化の分析は、このメソッドを使用することにより、種々の細胞型によるナノ粒子の差取り込みが容易に分析することができます日付は、従来の顕微鏡とフローサイトメトリーには、粒子の取り込みを定量化するために使用されているが、それぞれを高いスループットと内在化を研究するための代替的なアプローチの解像度の呼び出しでの制限は、この記事では、我々の特徴と食作用の生物学的プロセスは、ターゲット·細菌性病原体と合成ナノ粒子の2種類のどのように異なるかを比較するMIFC分析を実行します。

MIFC phagocytosアッセイは、ナノ粒子に比べサルモネラの取り込みのメカニズムの違いを描くために使用されたされています。これは、阻害剤はそれらのインキュベーショ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
RAW 264.7細胞株	アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）	TIB-71
ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）	Cellgro	10から013-CV
ウシ胎仔血清	アトランタバイオ	S 11150	プレミアムグレード
グルタミン	ギブコ	35050-061
HEPES	ギブコ	15630-080
24ウェルプレート	TPP	92024
細胞培養フラスコ	TPP	90151
セルスクレイパー	TPP	99002	24センチメートル
サルモネラ血清型Typhimuriumの	ATCC	14028
BTX ECM630エレクトロ細胞マニピュレータ	BTXハーバード装置
MOPS	フィッシャー·サイエンティフィック	BP308
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）	Cellgro	21から040-CV
超音波液体プロセッサ	MISONIX	S-4000
サイトカラシンD	Sigma-Aldrich社、	C8273
ホルムアルデヒド	ポリサイエン	04018
洗浄バッファーを	2パーセント熱不活性化FBS、PBS中0.1％アジ化ナトリウム。
洗浄バッファーを/パーマ	BDバイオサイエンス	554714
スナップキャップのマイクロチューブをクリア表示	シグマ	T4816
のAlexa Fluor®ファロイジン660	インビトロジェン	A22285
のImageStream X	Amnisコーパスる	100200	オプション：658nmレーザー、オートサンプラ
アジ化ナトリウム	フィッシャー·サイエンティフィック	S 227I-500