単一の卵重亜硫酸塩の突然変異誘発

サマリー

亜硫酸塩の突然変異誘発は、DNAメチル化を解析するためのゴールドスタンダードです。私たちの変更されたプロトコルは、単一細胞レベルでのDNAメチル化解析を可能にし、特に個々の卵のために設計されました。また、開裂段階の胚に使用することができます。

要約

エピジェネティクスは、すべてがこのように遺伝子のアクセシビリティを変更し、遺伝子の転写^1を調整するための主要なメカニズムであることをクロマチンに遺伝性で可逆的改変を包含する。 DNAメチル化は、抑圧的なマークとして主に作用するエピジェネティックな修飾である。 CpGジヌクレオチドのシトシン上のメチル基の共有結合的付加により、それは、クロマチンを凝縮と遺伝子^2をサイレンシングに関与するプロセスを開始するために追加の抑圧的なタンパク質やヒストン修飾を募集することができます。それは発達のプログラミング、細胞分化、レトロエレメントの弾圧、X染色体不活性化とゲノムインプリンティングに重要な役割を果たしているDNAのメチル化は正常な発達に不可欠である。

DNAメチル化解析のための最も強力な方法の一つは、亜硫酸水素塩の突然変異誘発である。亜硫酸水素ナトリウムは、ウラシルにシトシンをdeaminates DNAの変異原である。 PCR増幅とseque以下 ncingは、これらの変換イベントはチミンとして検出されます。メチル化シトシンは脱アミノ化から保護するため、個々のヌクレオチドレベル³でDNAメチル化の同定を可能にする、シトシンのままにされています。亜硫酸塩の突然変異誘発アッセイの開発は、当初より高感度と⁷再現性のあるものに向かって^4-6を報告されたものから発展してきた。一つの重要な進歩は、それによって過酷な重亜硫酸塩処理⁸からDNAを保護し、アガロースビーズにDNAの少量を埋め込 ​​むされました。卵母細胞および胚盤胞段階の胚⁹のプール上で実行するために、この対応のメチル化解析。これまでで最も洗練された亜硫酸塩の突然変異誘発のプロトコルは、個々の胚盤胞段階の胚は¹⁰です。胚盤胞は、平均64個のセル（ゲノムDNAの120から720 pgを含む）を持っているのでしかし、この方法は、個々の卵母細胞または切断ステージ胚におけるメチル化研究のための効果的ではありません。 テント">卵母細胞^11を含む分DNA量の埋め込 ​​みをアガロースから手がかりをとると、ここでは卵母細胞を直接検索し、卵母細胞から透明帯を除去した後、直ちにアガロース溶解ソリューションビーズに埋め込 ​​まれているさせる方法を提示します。これは私たちに可能単一の卵重亜硫酸突然変異誘発の2つの主要な課題を回避する：多数のプロトコルステップの間に低下し、その後の損失からのDNAの微量を保護する重要なことは、データが単一の卵母細胞から得られたとして、プール内のPCRバイアスの問題が排除されるさらに。複数のメチル化パターンを持つ任意のサンプルはこのプロトコルは、単一細胞レベルでのDNAメチル化の成功と再現性の解析のための改良方法を提供する。分析¹²から除外されることがあり、理想的に適していますので、不注意な卵丘細胞の混入は、この方法で検出可能である個々の卵母細胞と同様に開裂段階の胚のために。

プロトコル

1日目

そのようなGIBCO水などの滅菌蒸留水で卵母細胞の収集日に新鮮な以下のソリューションを準備します。 DNAの混入の可能性を減らすために、頻繁に手袋を変更し、フィルターチップを使用しています。オープン離れて角度チューブを保持し、使用しないときは、すべてのチューブをおさらい。我々は解決策は、n +1として行われることをお勧めします。

3パーセントLMPアガロース

30 mgの低融点（LMP）アガロース
まで1ミリリットルGIBCO H ₂ Oに
@ 70°Cを溶解

溶菌液

8μlの溶解バッファー
1μlのプロテ​​イナーゼK
1μlの10％IGEPAL
使用直前まで氷上に静置

2時01分アガロース：Lysis Solutionを （個々の卵母細胞あたり10μlの量が3卵母細胞のためのものです）

20μlの3パーセントLMPアガロース
10μlのLysis Solutionを
ミックス@ 70°C

ディスカッション

この単一の卵母細胞アッセイは重要であり、特別なケアを必要とする数多くの手順が含まれています。最初は卵母細胞の洗浄です。それは、できるだけ多くの卵丘細胞のように削除するヒアルロニダーゼ処理後に廃棄し新鮮な培地に各卵母細胞を複数回洗浄することが特に重要である。また、透明帯を除去するため、酸性タイロード液に卵を転送するときは、周囲の媒体が卵丘細胞の明確であることを確認してください。卵母細胞は、透明帯除去後に非常に粘着性であり、任意の周囲の卵丘細胞は容易に卵母細胞に付着したになることができます。それは帯無卵母細胞に固定されている卵丘細胞を除去することは非常に困難である。このプロトコルは、後の時点で卵丘細胞の汚染を検出することができますが、それは可能性が破棄された卵母細胞の完全なプロトコルを受けるように、建設的、また経済的ではありません。

2番目に重要なステップでは、卵母細胞の埋め込みです。アガロース及びLysで卵母細胞を埋め込むときは、その低融点（LMP）アガロースなり硬化：70℃以下℃の温度でわずかに注意することが重要な解決策をですこのように、我々は最少培地でスライドガラス上の個々の卵.......

材料

特定の試薬 ​​や機器のテーブルです。

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
卵母細胞コレクション
ヒアルロニダーゼ	シグマ	H4272
酸性タイロード	シグマ	T1788
プロテイナーゼK	シグマ	P5568
10％IGEPAL	Bioshop	NON999.500
溶菌液
トリス（pH7.5）	Bioshop	TRS001.5
LiClを	シグマ	L9650	＆n個のBSPは、
EDTA pH8.0で	シグマ	E5134
LIDS	Bioshop	LDS701.10
DTT	インビトロジェン	P2325
SDS溶解バッファー
TE pH7.5の	Bioshop（トリス） シグマ（EDTA）	TRS001.5 E5134
10％SDS	Bioshop	SDS001.500
Bisulfite変換
水酸化ナトリウム	シグマ	S8045
亜硫酸ナトリウム（亜硫酸水素ナトリウム）	シグマ	243973	;
ハイドロキノン	シグマ	H9003
低融点（LMP）アガロース	シグマ	A9414
鉱油	シグマ	M8410
M2中	シグマ	M7167
GIBCO蒸留水	インビトロジェン	15230-196
オートクレーブ滅菌蒸留（DD）水
PCR
IllustraホットスタートミックスRTG	GEヘルスケア	28-9006-54
240 ng / mlの酵母tRNA	インビトロジェン	15401-011
5倍グリーンGoTaq反応バッファー	プロメガ	M7911
内側と外側のネストされたプライマー	シグマ
ライゲーション
プロメガのpGEM-T Easyベクター	フィッシャー·サイエンティフィック	A1360
TAクローニング
有能な大腸菌細胞	Zymoリサーチ（株）	T3009
機器
解剖顕微鏡
70°Cと90°Cヒートブロック
37°Cと50°C Waterbaths（42°Cの変換用）
ロッカー
PCRマシン