細菌の凍結乾燥と細胞の生存への影響のための処方

サマリー

凍結乾燥は、多くの場合、生菌細胞の乾燥製品を得るための簡単​​で便利な方法です。プロセスの問題は、細胞生存ある。ここで我々は細部、凍結乾燥時の細胞の生存が使用製剤の特性によって影響されるか調査する手順を。

要約

セルラ水を可逆的に保管を容易にするために、微生物を不活性化するために除去することができる。除去のそのような方法の一つは、穏やかな脱水方法考えられる凍結乾燥である。乾燥中の細胞生存を促進するために、細胞は、しばしば、予め処方される。製剤は、細胞を埋め込み、凍結乾燥中のセルに課される種々の有害なストレスからそれらを保護マトリックスを形成する。ここでは、凍結乾燥後の細胞の生存率を評価する一般的な方法を提示し、我々は、4つの異なる処方で得られた結果と比較することによってそれを示している：二糖スクロース、ポリマーフィコールPM400由来のスクロースを、各多糖類、ヒドロキシエチルセルロース（HEC細菌の2株、P.上）とヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、 プチダ KT2440とA. chlorophenolicus A6。本研究では、凍結乾燥用製剤を調製する方法と、機械式を調査する方法を示し示差走査熱量測定（DSC）、表面張力の測定は、X線分析、および電子顕微鏡を用いて、生存率にそれらのデータを関連付ける製剤を特徴付けることによって再水和後の細胞生存のイズム。ポリマーは、程度の差は、それぞれの多糖類に似た白糖の単量体構造を得るために選ばれました。この方法の設定を用いて、我々は、ポリマーは、製剤の特定の物理的特性が制御される場合、二糖類¹と効果的に細胞生存をサポートできることを示した。

プロトコル

1。 P.の栽培と収穫プチダ

1. Pのコロニーをトリプシン大豆ブロス100mlの（TSB）を接種することによりシュードモナスのスターター培養を準備プチダ細胞は、トリプシン大豆ブロス（TSA）を補充した培地で培養した。 130 rpmで設定揺れボードに30℃で文化を保つ。
2. 7時間後は、新鮮なTSB-培地に本培養の最終容量のスターター培養と同等の1/10〜アリコートを転送します。 16時間130 rpmで振盪ボードに30℃で細胞を保管してください。
3. 成長の16時間後、細胞を室温で20分間、1,500 xgで細胞培養物を回転させて回収する。上清を除去し、細胞ペレットを増殖培地に等張であるのNaCl溶液中で再懸濁することによって細胞を洗浄。この場合、150mMのNaCl溶液を用いた。 、次いで、細胞を再び遠心分離し、上清を処方培地で細胞を再懸濁する前にデカントステップ3.2を参照してください。

2。他の種の栽培

1. 他の細菌種にプロトコルを適合させるために栽培や収穫手順は、その種の要件に応じて変更されるべきである。収穫及び洗浄工程（複数可）中に細胞を取り扱う際浸透圧ショックを回避するために、溶液のオスモル濃度は、収穫時の増殖培地のことを一致させる必要がある。

結果

製剤組成物、凍結製剤の加熱時にDSCによって記録された熱事象、乾燥試料の構造及び製剤溶液の表面張力の表1に表示されるデータである。スクロース_の Tg 'は-40°C ^2、図3に決定された、20％w / wの下方スクロース濃度を検出するために困難であり得る。 -35の熱イベント°Cは、おそらく氷の溶解²の発症に関連しています。結晶構造HECとHPMC試料でX線によって検出され、また、（図2bおよび2cを参照） を SEMで見られるには、NaClの通常の結晶形と重なる。

図1Aは、グラム陰性P.の生存データを示すプチダおよびグラム陽性A. chlorophenolicusは異なる糖ベースの製剤中に配合。製剤は、細胞の生存を支えるどれだけの傾向ではBOのために同じであることに注意してください番目の細菌種。 <.......

ディスカッション

この研究のための動機は、凍結乾燥中の細胞生存に重要であり得るいくつかの製剤特性を検討した。 図1A、異なる製剤の支持細胞の生存が類似している傾向にどれだけに示すように、真性乾燥耐性は、異なる種の間で変化するものの。それはスクロースおよびフィコールの比較で開始することが有益である。これは、細胞生存を支持するための製剤の重要な要因は、このように乾燥状態でも、細胞のタンパク質および膜の構造を維持し、脱水時に水を交換するための製剤成分の能力であると考えられる。例えばスクロース糖類だけでなく、多糖類、デンプンなどのポリマーが^5,11しないのに対し、このプロパティを示すトレハロース。ポリマーは、二​​糖類と同じ方法で膜脂質と相互作用するには大きすぎると考えられている。成功した凍結乾燥のための重要な別のプロパティ微生物のINGは凍結乾燥の間（ すなわち 。なるアモルファス固体）ガラス化するためのサポートマトリックスの能力である。アモルファス構造が分離された細胞をシールドし、維持するために有益である。興味深いことに、両方の二糖類及びポリマー凍結乾燥あれば容易にガラス化が適切に実行.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M 医薬品グレード)	Ashland		Ashland社より提供
HPMC (Methocel F4M)	Dow		ウプサラ大学薬学部より提供
スクロース	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
トリプチカソイ・ブロス	Merck	105459
トリプチカソイ・アガー	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k 回折計	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss 教育用テンシオメーター	Krüss	N.A.