マクロファージは、多くの組織の恒常性と病理学の中心的な役割を果たしています。ここで紹介するプロトコルは、マクロファージを枯渇させるための方法について説明します、骨髄穿刺液から偏マクロファージを導出し、養子マウスにマクロファージを転送する。これらの技術は偏光マクロファージは、健康と疾患に果たす役割を決定することができます。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
マクロファージは自然免疫応答を開始し、後天性免疫応答を誘導、伝染性の課題やけがに対する自然免疫応答において重要なプレーヤーである。マクロファージ機能障害は、適切な免疫応答をマウントすることができないにつながることができ、そのように、炎症性腸疾患を含む多くの病気のプロセスに関与されています。マクロファージは、次の2つのカテゴリに大別されている偏光の表現型を表示します。古典的活性化マクロファージは、IFNγまたはLPS刺激によって活性化され、解像度で交互に活性化マクロファージのに対し、IL-4あるいはIL-13によって活性化され、掃気破片や組織リモデリングに参加し、関与している細菌のチャレンジへの応答に重要な役割を果たす炎症の段階。 in vivoでの炎症反応時には、マクロファージが免疫細胞の浸潤の複雑な混合物の中で発見されており、悪化またはresolvinで参加することができますgの炎症。全体の動物モデルにおけるin situでのマクロファージの役割を定義するためには、複雑な環境からマクロファージを枯渇の影響を検討する必要がある。 in situでマクロファージ表現型の役割についての質問をし、表現型が定義された偏光マクロファージは骨髄穿刺液から、ex vivoで誘導することができるとマクロファージの事前の枯渇であるかどうかにかかわらず、マウスに戻って追加しました。プロトコルでクロドロネート含有リポソームここで紹介するのに対し、PBS注入されたコントロールは、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発マウスにおける大腸炎の間に大腸マクロファージを枯渇させるために使用された。さらに、偏光マクロファージはex vivoで誘導され、静脈内注射によりマウスに転送されます。このアプローチには注意点がクロドロネート含有リポソームは枯渇によって観測された効果はマクロファージ特異的、再Oであることを確認するため、樹状細胞やマクロファージの両方を含むすべてのプロの食を枯渇させることです。マクロファージの移入によってfの表現型が必要です。マウスの全身のマクロファージの枯渇は、優れた補完的なアプローチであるCD11bを-DTR背景に戻し交配マウスによって達成することができる。クロドロネート含有リポソーム媒介枯渇の利点は、戻し交配マウスに必要な時間と費用を必要とせず、それは関係なく、マウス（C57BL / 6、BALB / c、または混合背景の背景のマウスで使用することができることです。 。）
プロトコル
1。クロドロネート含有リポソームを用いたオゾンマクロファージ
- リポソームは、4℃で保存されている注射前に2時間、彼らは室温（18℃）に順応できるように冷蔵庫からクロドロネート含有リポソーム、PBS-含有リポソーム、または滅菌PBS（インジェクションコントロール）を削除します。
- 1mlのシリンジに200μlをロードする前に均一な分布を確実にするためにリポソーム8-10倍を含むチューブを反転します。注射器の上部に26ゲージの針を取り付けます。
- 左手、首筋だけで頭と手足を固定するのに十分な皮膚を持って耳を下にマウスを使用します。
- 内部器官は腹部の右下の象限に位置しています注射部位から離れて移動するので、頭が地面に向かってわずかになるようにマウスを傾けてください。
- 手のひらの間に注射器を転がし、6回注入に均等に前のリポソーム溶液を配布し、それを反転させる。
- 30から40度の角度で、マウスの腹部の右下側に針を挿入します。リポソーム溶液またはPBS200μlを注入します。
- 誘発炎症モデルの中に、DSS誘発性大腸炎のように、新しい浸潤マクロファージを枯渇させるためのプロトコルの間に常駐マクロファージと2日毎の枯渇を確保するための実験的炎症の発症に先立って4日間のマウスを注入します。
- 実験の最後に、計画された実験的解析とともに、興味のあるサイトからの組織を除去し、免疫組織化学的染色によりマクロファージ枯渇を確認するために、パラホルムアルデヒドで固定します。
2。骨髄穿刺液からの偏マクロファージの誘導
- 生後8〜12週間の間にマウスからの骨髄は、骨髄由来マクロファージの最高収率を提供しています。マウスを安楽死させると、その後ろに置き、可能な限り、その手足を伸ばし、その足を突き止める。
- ホー滅菌での作業dは、できるだけ多くの筋肉のように離れて切断、大腿骨と脛骨を削除します。
- 10％FCSをIMDMを使用して骨からフラッシュ骨髄は26ゲージの針を備えた5mlの注射器にロードされます。
- 希薄骨髄は10％FCS、75 cm 2の組織培養フラスコ内の場所のセル、および37℃、5％4時間CO 2をIMDM 40 mlに吸引する。このステップでは、造血前駆細胞から接着性の間葉系細胞や成熟したマクロファージを削除します。
- 1200 rpmで5分間に50 mlのコニカルFalconチューブと遠心分離機に非接着性の前駆細胞を含む転送培養上清。
- 5ミリリットルIMDM、10％FCSに再懸濁し、細胞ペレットを酢酸中で20に細胞懸濁液1を希釈することにより有核細胞をカウントします。この手順では、赤血球、残りの核を含むすべての細胞は血球計算板でカウントすることができ溶解する。
- 0.5×10 6細胞/完全培地のmlで再懸濁し、IMDM、10％FCS、150μMモノチオグリセロール（MTG）、およびMCSF、GM-CSF、またはIL-3のいずれかの10 ng / mlの。 GM-CSFまたはIL-3由来のマクロファージを交互にアクティブ化されるのに対し、MCSF由来のマクロファージは、古典的なマクロファージを活性化される。
- 非接着細胞をスピンダウンし、フラスコに戻し、4日目に培地を交換し、7日、廃棄、非付着細胞では。
- さらに、IFNγ（10 ng / ml）を、またはIL-4（10 ng / mlの）はそれぞれ、古典的活性化あるいは活性化表現型にスキューマクロファージに7日目にMCSF由来細胞を含むフラスコに添加することができます。さらに3日間細胞をインキュベートします。
- 10日目に、メディアを取り出し、細胞解離バッファー（GIBCO-BRL）を用いて組織培養フラスコから細胞を持ち上げます。場所5室温で5分間細胞（18℃）でのバッファのmlとし、手のひらのかかとをしっかり数回フラスコの側面を強打。細胞がフラスコの下を調べることにより、フラスコからリフトオフされていることを確認し顕微鏡。ピペットで15 mlコニカルファルコンチューブに細胞を再懸濁し、IMDM、10％FBS、追加の10mlでフラスコを洗います。プール、300×gで5分間、細胞をスピンダウンする。
- 滅菌PBS pH7.4の10 7細胞/ mlの濃度で血球と再懸濁しを使用して生細胞をカウントします。マクロファージは、マウスに注入するための準備が整いました。
- リザーブ1.0×マクロファージ表現型を評価するための10 6マクロファージ。リポ多糖を分泌する一酸化窒素の高濃度とIL-10のIL-12p70と低レベルで刺激した古典的活性化マクロファージは、代わりに活性化マクロファージと比較されます。あるいは、活性化マクロファージは、恒常的にYM1とウエスタンブロット法によって検出することができアルギナーゼI（argiは）を表現します。
3。マウスへのマクロファージをTranferring
- 10 7細胞/ mlの濃度で滅菌したPBSに再懸濁し、マクロファージ。これにすることができ安全かつ快適に尾静脈によってマウスに注入することができるボリュームです。100μlの総体積で10 6マクロファージのtravenous注入。
- 尾静脈を拡張するために5〜10分間加温パッドや熱ラップを使用して、暖かいマウス。温熱療法の兆候がすべての回でマウスを監視することができます。
- 尾静脈へのアクセスを許可抑制デバイスにマウスを転送します。
- 尾を90°回転させ静脈が上向きになるように。静脈は尾の両側の下、横方向で実行のいずれか静脈を使用することができます。
- アルコール綿棒で注射部位をきれいにし、徐々に26または28ゲージの針を1 mlのシリンジを用いて100μL（10 6マクロファージ）を注入します。上向きベベル側と静脈にほぼ平行にわずかに角度で針を挿入します。
- 針が正しく挿入されている場合には抵抗を感じてはいけませんと静脈注射後に明らかになるはずです。針が含まれていない場合静脈、尾が膨らみます。この問題が発生した場合は、針を除去し、再び最後の試行またはその他の静脈に近接してみてください。テールはタフで、針が尾静脈注射時にすぐに鈍くなるように新しい針は、それぞれの注入を使用する必要があります。
- 注射後、針を除去出血が止まるまで注射部位に穏やかな圧力を適用し、その出血が停止していることを確認するために追加の5分間マウスを監視することができます。
- 実験手順の間に偏光マクロファージの連続的な配信を保証するために4日ごとにマクロファージの注入を繰り返します。
- 実験の最後に、実験的解析とともに、興味のあるサイトからの組織を除去し、免疫組織化学的染色によりマクロファージ偏光の効果的な配信を確認するために、パラホルムアルデヒドまたはホルマリンで固定します。
4。代表的な結果
常駐macropの数と表現型任意の組織でhagesは、検証される組織に依存しており、感染や炎症時に変更されます。同様に、組織からマクロファージを枯渇させるクロドロネート含有リポソームの能力は、管理および標的組織への効果的な配信の経路に依存します。 F4/80の減少クロドロネート含有リポソームの結果+マクロファージマーカーの免疫組織化学的染色、F4/80（ 図1A）によって明らかDSS誘発性大腸炎の間にマウスの結腸におけるマクロファージの腹腔内注射。組織染色は、組織切片中のマクロファージ数および表現型の量的違いを決定するために使用することができます。 図1Bは、マウスを注射されたとき、マクロファージの55％の平均が、マウスのコロンで検出されない枯渇に比べクロドロネート含有リポソームで枯渇していることを示していますインジェクションコントロールとしてPBS単独。各値は、F4/80とargiは染色数えることによって決定されます実験条件に盲二人の人物によって行われているカウントとマウスあたり3つのセクションの3ポイントで6匹のマウスからシリアル組織切片のED陽性細胞、。これらの結果はクロドロネートリポソームの腹腔内注射は、マウスの大腸マクロファージを枯渇させることを示している。
（GM-CSFまたはIL-3由来またはMCSF由来と古典的活性化（MCSF由来またはMCSF由来とIFNγで処理する）か、あるいは活性化される別の成長因子の利回りマクロファージの存在下で骨髄からマクロファージの誘導IL-4）で処理した。 8週齢のマウスから2大腿骨と2脛骨から骨髄をフラッシュすると、通常はマウスあたり6×10 7個の有核細胞と収量8×10 6 MCSF由来マクロファージ、10×10 6、GM-CSF由来のマクロファージ、または12を生成する× 10 6、IL-3由来のマクロファージ。図2Aは、マクロファージの亜硝酸塩とIL-12p70/IL-10比SUPのを示していますernatantsは24時間リポ多糖で処理され、図2Bは MCSFから0.5×10 6マクロファージの典型的なウェスタンブロット分析を示す+ / -は。IL-4誘導条件は、argiは、代わりに活性化マクロファージのマーカーに対する抗体とYM1をプローブとして、またはGAPDHとコントロールをロードする。これらのデータは、骨髄由来マクロファージを誘導中に、偏光の表現型に偏りが発生する場合がありますことを実証している。
ex vivoで派生した偏光マクロファージの組織への効果的な転送は、管理および組織へのアクセスの経路に依存しています。 DSS誘発性大腸炎の間に、マクロファージが静脈内炎症部位 に移動し、代わりに活性化マクロファージは、疾患の重症度を軽減する注入した。 図3Aは、マクロファージや偏光を注入したマウス由来の組織切片でカウントargiは+（あるいは活性化）マクロファージの数の合計数を示しています。骨髄由来マクロファージ。 DSS誘発性大腸炎の間に大腸に偏マクロファージの移動の影響は、疾患活動性指数、体重減少、直腸出血、減少して便の硬さ（ 図3B）に基づいて、添加剤のスコアで示されています。これらの結果は、ex vivoで、派生ことを示している、養子転送マクロファージがコロンと衝撃誘発炎症へのトラフィックをすることができます。 M2マクロファージが有意に疾患活動性指数を減らす一方、M1マクロファージは、炎症に影響を与えません。
図1。クロドロネート含有リポソームは、実質的にin vivoでのマウスのコロンでF4/80 +およびF480 + argiは+細胞を枯渇させる。混合C57BL / 6×129Sv背景の上に野生型マウスのF2世代前DSS処理をPBS（対照）またはクロドロネート含有リポソーム（クロドロネート）4日とIP 7日間の5％DSSを与えられ、注入したと0日、2、4、6のDSS治療中。 （A）コロンは、削除され固定され、セクションは、成熟したマクロファージ（F4/80）とM2マクロファージマーカー、argiはのための免疫組織化学によって染色された。 F4/80 +とargiは+マクロファージ（B）の定量。積極的に染色した細胞は、3つのセクション/マウスから6匹のマウス/群から6つのフィールドでは40倍の倍率での実験条件に盲検2個人によってカウントした。 * P <0.01。
図2。MCSF由来のマクロファージは、古典的活性化表現型を発現し、IL-4で処置したMCSF由来のマクロファージは、代わりに活性化マクロファージの表現型を表現しています。 （）古典的活性化表現型と一致して、MCSF由来のマクロファージは、リポ多糖に応答して、一酸化窒素の高いレベルを生成し、その下流の代謝物、亜硝酸塩を検出したグリースアッセイによって測定することができる。彼らはALSELISAにより測定することができ、より高いIL-12p70/IL-10比を生成O。 * n = 3のためのP <0.01。 （B）あるいは活性化表現型と一致して、MCSF由来のマクロファージは、免疫ブロット法ウェスタンによって検出することができ、IL-4構成的に明示YM1とargiは、処理した。データは、同様の結果3つの独立した実験の代表的なものである。
図3静脈内注入し、ex vivoで由来の代わりにコロンにマクロファージのトラフィックを活性化し、腸の炎症を軽減します。混合C57BL / 6×129Sv背景の上に野生型マウスのF2世代は、6日間の彼らの飲料水の5％DSSを与えられた。 M1とM2マクロファージはDSS処理中に0日目と4日に静脈注射した。 （A）コロンは、削除され固定され、セクションは、成熟したマクロファージ（F4/80）とM2マクロファージマーカー（argiは）の免疫組織化学によって染色したしました。コントロールPBSを注射したマウスのためにマクロファージの定量（C）、M1マクロファージ（+ M1）とM2マクロファージ（+ M2）を注射したマウスに注射したマウスは、3つのセクション/マウスからの6つのフィールドでは40倍の倍率で積極的に染色された細胞を数えることによって行った。 6匹/群から。カウントは、実験条件に盲二人の個人によって行われた。 （B）疾患の活動が監視され、治療期間中、毎日記録し、体重減少、直腸出血に基づく添加物のスコアであり、便の硬さを減少した。 * P nの<0.05 2つの独立した実験で= 6マウス。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
マクロファージは、免疫システムにおいて重要な役割を果たしている貪食細胞である。彼らは、自然免疫応答を開始し、後天性免疫応答を誘導する責任があります。一般的に、古典的活性化マクロファージは、IFNγまたはLPSによって活性化され、病原体を排除し、炎症反応1をマウントするための責任がありますされています。逆に、代わりに活性化マクロファージはIL-4あるいはIL-13によって活性化と炎症1の解決時に掃気破片や組織リモデリングに重要な役割を果たしている。腸内で特殊なマクロファージはそれらの殺菌活性を保持しますが、炎症誘発性応答2をマウントしないでください。有益な植物や食物抗原に対するこの許容値は、不適切な可能性の病理学的免疫応答3を開始せずに違反上皮バリアをその物質のクリアランスが可能になります。異常な結腸のマクロファージ機能に貢献することができ炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、大腸癌3月5日を含む病理学的状態に。挑戦することができ、健康や疾患におけるそれらの役割を定義するので、マクロファージの表...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
この作品は、消化器/カナダヘルスリサーチ/ Crohn病協会とカナダ新奨励賞の大腸炎財団のカナダの協会によってサポートされているLMSへのクローン病とカナダの大腸炎財団から "研究の援助のグラントによってサポートされていました。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | |
| クロドロネート含有リポソーム | Clodronateliposomes.org | ||
| PBS-含有リポソーム | Clodronateliposomes.org | ||
| 滅菌したPBS pH7.4の | インビトロジェン | 14190 | |
| IMDM | インビトロジェン | 12440 | |
| ウシ胎児血清（FCS） | インビトロジェン | 12483 | |
| 酢酸 | BDH Aristar | BDH3092-500MLP | |
| モノチオグリセロール（MTG） | シグマ | 96から275 | |
| RecombinantマウスMCSF | Stemcellテクノロジーズ | 02951 | |
| 組換えマウスGM-CSF | Stemcellテクノロジーズ | 02935 | |
| 組換えマウスIL-3 | Stemcellテクノロジーズ | 02903 | |
| 組換えマウスIFNγ | Stemcellテクノロジーズ | 02746 | |
| 組換えマウスIL-4 | Stemcellテクノロジーズ | 02714 | |
| 細胞解離バッファー | インビトロジェン | 13150-016 | |
| ラットanti-F4/80抗体 | ABD Serotec | MCA497GA | |
| マウス抗argiは抗体 | BD伝達研究所 | 610708 |
表1は、このプロトコルで使用される特定の試薬 が含まれています。
参考文献
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
- Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14(2009).
- Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
- Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
- van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
- Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
- Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
- Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
- Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
- van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
- Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
- Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
- Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
