ドーパミンは、はっきりとドーパミンニューロンの細胞体と樹状突起を含む脳核、で規制されています。ここでは黒質（SN）とげっ歯類では腹側被蓋野（VTA）の中脳核のドーパミン調節では、結果を最大化するために解剖し、サンプル処理のアプローチを説明し、その結果、結論と洞察力。
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この記事について
サマリー
要約
ドーパミンは中枢神経系で精力的に研究神経伝達物質である。確かに、その自発運動への関与と報酬に関連する動作は、ドーパミン調節に関連する分子の不備にお問い合わせの五十年を促進しています。線条体および側坐核、黒質線条体とmesoaccumbens経路のターミナルフィールド領域におけるその調節の分子基盤に応じて脳フォーカスのドーパミン調節のこれらの問い合わせが多数。さらに、このような研究が唯一のウェットティッシュの重量に正規化とドーパミン組織含有量の分析に集中している。そのようなチロシンヒドロキシラーゼ（TH）タンパク質、THのリン酸化、ドーパミントランスポーター（DAT）、および小胞モノアミン輸送体2（VMAT2）タンパク質として、ドーパミン調節するタンパク質の研究は、しばしば同一のサンプルにおけるドーパミン組織含有量の分析が含まれていません。ドーパミン組織のコンテンツとその調節タンパク質（ポスト-TRAを含む両方を分析する能力nslational変更）TH、DATのタンパク質レベルと機能とドーパミンの関係を解釈する固有の力を与える、またはVMAT2だけでなく、サンプルの経済を拡張するだけでなく。この低コストに変換し、さらには研究者の選択の事実上すべてのパラダイムにおけるドーパミンの分子制御への洞察を生成します。
我々は中脳での分析の焦点を合わせる。 SNとVTAは、通常、ドーパミン調節のほとんどの研究では無視されていますが、これらの核は簡単に実践して解剖されています。包括的なドーパミン組織のコンテンツとTHの読み出し、DAT、またはVMAT2を行うことができる。そこに行動上のSNとVTAのドーパミン機能の影響に関する文献を急成長し、そこに1から5外因性物質または疾患過程のimpingementsされています。さらに、成長因子などの化合物は、SNまたはVTAで比較的大きい程度に、ドーパミンやドーパミン調節蛋白質に大きな影響を持っている我々は、これらの2つの核とそれぞれの原子核（図1）の特定のin vivoでのドーパミン調節の分子機構を明らかにプロファイルを生成し、解剖組織サンプル処理を分離するために解剖の手法を説明します。
プロトコル
1。解剖
- 濡れた氷のベッドの上で、齧歯類の脳マトリックス（冠状断面が離れて1 mmの分離）、5カミソリ、及び＃11メスを含むペトリ皿を冷やす。別の容器に、場所はドライアイスに2ミリリットルサイズのマイクロチューブにラベルを付けました。
- 調査官は、安楽死の方法を選択します。我々は、イソフルランでは非常に簡単な麻酔を行って再現性の高い結果を持っている、理想的には、気化器を使用する必要があります。ただし、利用できません、我々はプラットフォームを含む大規模なバッテリーのjarを使用しています。承認された換気フードに位置する電槽を使用すると、プラットフォーム下イソフルラン飽和ガーゼパッドを配置し、イソフルランは、バッテリのjarを飽和できるように3-5分待ちます。内側にラットを配置し、できるだけ早くラットが意識を失ったとして斬首のために削除します。急速に脳（理想的には2分未満）で、冷たい水ですすぎを削除し、冷やした齧歯類の脳の行列ですぐに配置します。
- 位置1分後行列に脳をING、冷却脳に冷たいカミソリの刃を挿入し、線条体および側坐核は中脳の核に加えて、分析のために望まれている場合は、視交叉の吻側2ミリメートルの周りに始まる。個々のブレードを簡単に除去を容易にするように、後続の各カミソリの刃の位置をずらすこと、橋の途中に到着するまで各1mmのセクションに冷たいカミソリの刃を挿入して続行します。
- カミソリを抜くときは、海馬の先頭を探します。それは完全に脳を包んしたとき、 ....
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ディスカッション
図1に概説され、上記詳述した方法は、ドーパミンの複数の読み出しおよびラットまたはマウスから得られたSNまたはVTAの1つのサンプルから、その調節タンパク質TH、DAT、およびVMAT2を生成する必要があります。再び、このプロトコルを実施する利点は、研究者はドーパミンが実質的にすべての実験的なパラダイムの下でin vivoでの規制と、そうすることで、いずれかに必要な動物数を減らすことによって、重要な実験的なリソースを節約する方法の運用をマッチさせた読み出しを得ることができるということです実験。
それは研究者が氷冷HPLCバッファ内の解剖（4°C）、組織の記憶（少なくとも-70°C）、組織の超音波処理（貯蔵温度から除去した後、ただちに超音波）に課せられた温度条件を観察し、ことが絶対不可欠である後続のペレットの形成と処理。ペレットを超音波処理し、SDS溶液で煮沸した後、サンプルはフュルトであり続けることができるERは、室温で処理されます。アーカイブされたHPLCのストレージは、サンプルを分析し、タンパク質分析用のサンプルバッファー調製したサンプルは-80℃と
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開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
この作品、として2,10を挙げて 、のための資金は、老化研究、エドワード·P.スタイルズ信託基金とノースウエストルイジアナ州の医学研究財団のためのアメリカ連合からMFサルバトーレの研究助成賞を受賞することによって、部分的には、提供されていましたとBSプルエットにアイクMuslow博士号を取得する前のフェローシップ、LSUの健康科学センターシュリーブポートから。
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材料
HPLCシステム：
基本的なシステムは島津LC10-ADvp HPLCポンプ、ウォーターズWISP 717自動サンプルインジェクター、250 X 4.4ミリメートル、5ミクロンSpherosorb ODS-1 C18逆相カラム（Waters）、バイオ分析システム（BAS）TL12デュアルガラスで構成されています炭素電極、2 BAS LC4B電気化学検出器、およびウォーターズは、2のデータ収集およびデータの統合システムに力を与える。
列は30から45°C（BAS LC22Aカラムヒーター）に維持されています。移動相は0.1 Mリン酸ナトリウム液（pH3.0）、0.1mMのEDTA、0.2から0.4 mMの1 - オクタンスルホン酸（イーストマンコダック - ）、および0.35％0.45ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリル（v / v）である。流量は1.2 ml /分である。移動相の4リットルのバッチは、pH、オクタンスルホン酸およびカラム温度を調整することにより、分離のために最適化されています。移動相はリサイクルされており、継続的に溶存酸素を除去するためにヘリウムガスでパージされています。移動相のリサイクル合理的な期間のために良好な分解能を維持するためにほとんど不可欠である。移動相の貯蔵寿命は、各実行の最初の2から7分を無駄にそらすために、フロースイッチ（積分器によって制御される）を使用することによって維持されています。
電極はAg/AgC1参照電極に対して約0.78と0.95Vの電位で維持されています。より高い電位での電極は、トリプトファン（およびNMDA内部標準）を決定するために排他的に使用されます。 0.78 Vの電位はトリプトファン以外のモノアミン及びその化合物の検出のための雑音比に優れた信号を提供します。クロマトグラムをエンパワーワークステーションのハードドライブに保存され、その後、処理され、データは代謝産物の量およびグループのデータのコンパイルを計算するためのExcelスプレッドシートに直接転送されます。
ポンプ：島津LC-10AD
細胞：BASクロスフロー。 0.780および0.9で作用電極グラッシーカーボン50 Vの可能性。
検出器：BAS LC-4Bは、デュアルチャネルモードで動作する。
データACQ。システム：ウォーターズはPro 2をエンパワー。
インジェクター：ウォーターズWISP 717
カラム：ウォーターズSpherosorb ODS-1、5μm粒子、4.4ミリメートルX 250ミリメートル。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | |
| ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） | - JTベーカー | 4095から02 | |
| Trizmaベース | シグマ | T1503-1KG | |
| Trizma HClを | シグマ | T3253-1KG | |
| グリセロール | シグマ | G8773-500 mLの | |
| PVP-40 | シグマ | PVP40-1KG | |
| DPBS | ギブコ | 21600-069 | |
| Tween20を | シグマ | P1379-500 mLの | |
| グリシン | シグマ | G8898-1KG | |
| ポンソーS | フルカ | 81460 | |
| ブロモフェノールブルー | シグマ | B8026-5G | |
| ジチオスレイトール | シグマ | D-9163 | |
| タンパク質標準2mgのBSA | シグマ | P5619-25VL | |
| ピアスBCAタンパク質アッセイ試薬 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 23223 | |
| プレシジョンプラスプロテインスタンダード | バイオラッド社 | 161-0373 | |
| [125] - 蛋白質、特定のアクティビティ | パーキンエルマー |
表2特定の試薬 が含まれています。
| 試薬 | 式 |
|---|---|
| 10％SDS | 10グラムSDS、100 mLのDI H 2 0 |
| 1％SDS液（pH〜8.2） |
|
| 銅II硫酸溶液 |
|
| 3Xサンプルバッファー |
|
| 1Xサンプルバッファー | DI H 2 0を使用して1Xサンプルバッファーに3Xサンプルバッファーを希釈する |
| 10Xランニング緩衝液（4 Lになります） |
|
| 10X転送バッファ（4 Lになります） |
|
| ポンソー |
|
| 0.2パーセントのHCl溶液 | DI H 2 O 500mlを5.2 mLの塩酸 |
| PVP-T20はSolnをブロックします。 （4 Lになります） |
|
| 10Xブロット緩衝液（4 Lになります） |
|
チロシン水酸化酵素の基準：この研究室で使用されるキャリブレーションTH蛋白質およびリンの基準は、最終的にドクター·ジョン干し草の山11の研究室に由来する以前にキャリブレーションTH規格に対してTHタンパク質含有量とリン化学量論を分析したPC12細胞抽出物から誘導される。
参考文献
- Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat. Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C.
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再版と許可
