磁気共鳴イメージング、体積CT画像と超音波を用いた乳がんの骨転移のヌードラットモデルにおける血管新生のマルチモーダルイメージング

1。細胞培養

1. 10％FCS（Sigma社、ドイツ）を補充したRPMI-1640培養におけるMDA-MB-231ヒト乳癌細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション）（Invitrogen社製、ドイツ）。すべての標準的な条件下で培養（37℃、加湿雰囲気、5％CO _2）と通路細胞週2-3回は、それら対数増殖に保つために保管してください。以下に説明する動物モデルでは、腫瘍テイク率が90％以上の¹であるように、MDA-MB-231細胞の骨固有sublinesの使用の必要はありません。
2. で2mMのEDTAを使用した後、収穫サブコンフルエントの腫瘍細胞を^{PBS-（2 +}およびMg ^{2 +}のCaなく、リン酸緩衝生理食塩水）と、0.25％トリプシン（Sigma社、Taufkirchen、ドイツ）。カウント·ノイバウアーのチャンバー内のMDA-MB-231細胞とRPMI-1640（1ミリリットルで5×10 ⁵細胞）にそれらを中断します。

2。骨転移のヌードラットモデル

1. すべての実験は、責任政府のアニマによって承認されましたリットル倫理委員会。
2. 6から8週齢でヌードラットを使用して、それらの適切な小動物系（例えばミニバリアシステム）の病原体フリーの条件下で保持します。制御された条件下で動物を飼う（21 + / - 2℃、室温、60％湿度、および12時間明暗リズム）とラットにオートクレーブ処理飼料および水を自由に摂取を提供します 。
3. 動物の手術前に、鎮痛薬を注入（例えば、カルプロフェン4 mg / kgを皮下あり、その単回投与と（約8時間）半減期が短いためには、カルプロフェンは、腫瘍の成長に影響を及ぼすべきではありません）。酸素の混合物（0.5リットル/ min）とイソフルラン（1〜1.5体積％）でラットを麻酔し、ラットが適切に麻酔をかけており、次の手順を開始する前に、定期的に呼吸することを確認してください。
4. 適切な眼の手術用顕微鏡（例えばライカ）の下で麻酔動物を配置し、16倍の倍率で動作します。
5. inguで皮膚と皮下組織を切断して手術を開始します。鋏（はさみBC060rアイリス108ミリメートル）を使用して、2〜3センチメートルの長さでinal地域。大腿動脈（FA）の分岐すべての動脈は浅腹壁動脈（SEA）、下降膝動脈（DGA）、膝窩動脈（PA）と伏在動脈（SA）を含む解剖する必要があります。
6. 一時的にローカルの血流を閉塞するためのDGA、PAやSAにだけでなく、SEAの原点の近位大腿動脈にクリップを入れてください。 （ 図1A）出血せずに、この容器の開口を可能にするために、その遠位部でSEAをライゲーションする。
7. ライゲーションの近はさみ（VannasマイクロSCRの溝STR 85ミリメートル）（ 図1B）を使用して SEAを切って、容器の緩和のために針の後続の挿入を容易にするために、SEAに1％papaverinソリューションを管理（ 図1C）。
8. はさみでSEAの直径の約半分を切り取り、holdiながらSEAの内腔に針（0.3 mm径と42 mmの長さ）を挿入するngの鉗子（ 図1D、E）と容器のカット終了。利用可能な場合、血管壁の穿孔につながる不規則な動きを減らすために外部デバイスに針を固定します。針にシリンジを接続します。遠FAからクリップを削除し、伏在動脈（ 図1F）の上に置きます。
9. ゆっくりと海に0.2ミリリットルのメディアに懸濁し、MDA-MB-231細胞を注入します。クリップのおかげで、MDA-MB-231細胞は、DGAとPAに送られます。針を除去し、動脈クリップを離陸する前に、出血を防ぐために、SEAを連結。外科用クリップを使用して傷を閉じ、吸入麻酔を終了します。
10. ポスト·プロシージャのモニタリングのために、ラットは、通常、重度の骨格合併症を避けるために7-8週腫瘍細胞接種後に安楽死されています。この時間の間に、動物は腫瘍の大きさや痛みの証拠（例えば、行動の逸脱、体重減少、モーターの欠陥）を評価するために毎日監視する必要があります。動物が腫瘍を示している場合腫瘍の成長時の痛みの倫理的に許容限度又は証拠を超えるサイズは、彼らは安楽死する必要があります。
11. 免疫不全（ヌード）ラットは、ヒトMDA-MB-231乳癌細胞のxenogenous移植のために使用された。ヌードラットの方が成長する腫瘍を可視化するために選ばれていませんでした。

3。磁気共鳴イメージング（MRI）

1. 腫瘍細胞接種後、イメージングを開始する前に、腫瘍増殖の約25-30日を許可します。 MRイメージングのために適切な動物コイルを持つ専用の実験的なスキャナや人間のMRシステムを使用しています。我々は、人間のMRシステム（シンフォニー、シーメンス、ドイツ）、83ミリメートルと120ミリメートル（ 図2A）の使用可能な長さの内径を持つ円筒共振器のボリュームとして設計された高周波励起および検出のための自作コイルを使用していました。
2. 酸素と上記のようにイソフルランでラットを麻酔。尾静脈にカテーテルを置き、タップを使用して、尾でそれを修正する E。造影剤（; Magnevist、バイエル·シエーリング··、ドイツ約0.5 mlの例えば0.1ミリモル/ kgのGd-DTPA）を含む注射器を接続します。
3. 吸入麻酔を維持するためのMRシステムにラットを配置します。骨転移を見つけるために形態のMRシーケンスで始まる（例えば、T2強調：ターボスピンエコーシーケンス、TR 3240ミリ秒、TE 81ミリ秒、マトリクス152×256、FOV 90×53.4ミリメートル^2、スライス厚1.5ミリメートル、3平均、スキャン時間3時40分）。
4. 最大径が骨転移のスライスを決定し、DCE-MRIのシーケンスを開始します（例えば飽和回復ターボフラッシュシーケンス、TR 373ミリ秒、TE 1.86ミリ、マトリクス192×144、FOV 130×97.5ミリメートル^2、スライス厚5 mmの測定値512、平均1、スキャン時間の午前6時55分の分）。約30秒後、10秒の期間に造影剤を注入し始める。 MRI検査を実行するために、上記の手順については、合計時間は動物当たりおよそ15-20分である。

1. ヒトまたは実験的なスキャナのいずれか、適切なCTシステムを選択します。ここでは、体積計算断層撮影（;ボリュームCT、シーメンス、ドイツ図2B）を装備し、フラットパネルのプロトタイプを使用していました。
2. 酸素と上記のようにイソフルランでラットを麻酔。尾静脈にカテーテルを配置し、テープを使用して尾でそれを修正してください。造影剤（; Imeron 400、ブラッコ、ドイツ約0.5 mlのkg当たり例えば、1 gのヨウ素）を含む注射器を接続します。
3. 吸入麻酔下でスキャナにラットを配置します。 VCTには、次のスキャンパラメータを使用します。管電圧80 kVの、管電流50mA、スキャン時間51秒、回転数10秒、第120あたりのフレーム数、マトリックス512×512、スライス厚さ0.2ミリメートル。フラットパネルシステムの第二の回転中に造影剤を注入します。 VCT検査を実行するために、上記の手順については、合計時間は、アニム当たり約5-10分です。アル。
4. 変更されたFDK（フェルトカムプデービス-クレス）コーンビーム再構成アルゴリズム（カーネルH80a、アフラ、ドイツ）を使用して画像を再構築します。

5。超音波（米国）

1. 実験的および臨床米国のシステムはこの目的のために用意されています。我々は、15L8線形トランスデューサー（;シーメンスACUSON、カリフォルニア州マウンテンビュー図2C）と臨床システムACUSONセコイア512超音波システムを使用していました。
2. 酸素と上記のようにイソフルランでラットを麻酔。尾静脈にカテーテルを配置し、テープを使用して尾でそれを修正してください。マイクロバブル造影剤（; SonoVue、ブラッコ、イタリアなど約0.5 mlの1.6ミリリットル/ kg）を含んだ注射器を接続します。三脚を使用して、それぞれの後肢に、米国のトランスデューサーを修正し、トランスデューサーと後肢の間に米国のゲルを適用します。
3. 骨転移の最大直径を決定し、tのトランスデューサーを修正する;：Bモードイメージング（0.51メカニカルインデックス17 MHzの伝送周波数）を実行する彼の位置。組織灌流の詳細については、Bモード画像上にドップラー信号を追加します。皮質骨を混乱させるだけの病変は、米国の波にアクセス可能であることを心に留めておいて下さい。
4. ダイナミック造影米国（DCE-US）がケイデンスコントラストパルスシーケンス（CPS）モード（7 MHzで、機械的なインデックス：送信周波数0.18）で、米国のデバイスを設定するために、マイクロバブルを注入し、90秒の長さのシネループを記録します。米国の検査を実行するために、上記の手順については、合計時間は、動物ごとに約10-15分です。

6。イメージングデータの後処理

1. 軟部腫瘍（MRI、米国）、骨転移の骨破壊（VCT）を特徴づけるとDICOMビューア（例えば、OsiriXのDICOMで病変の位置、病変サイズとボリュームを決定するためにMRI、VCTと米国からの形態情報を使用ビューア）。
2. 骨転移（血管造影）で血管の分岐パターンを取得するには、VCTデータを使用することができます。投稿引き算のテクニック（例えば、OsiriXは、DICOMビューア）の有無にかかわらず動脈相の情報を使用して、2Dまたは3D画像を構築します。
3. DCE-MRI、DCE-VCTとDCE-USから血管のパラメータを定量化するためには、モダリティのために特定のソフトウェアツールを使用します。 DCE-MRIについては、ダイナラボと骨転移で（血液量に関連付けられている）と交換速度定数k _EP（血流と血管の透過性に関連付けられている）（Mevis研究、ブレーメン、ドイツ）に基づいて血管のパラメータの振幅を決定する2つの-糖度^8,9のコンパートメントモデル。評価のための代替薬物動態モデルが入手可能であり、Toftsモデル^10を 、例えば。
4. DCE-VCTデータを定量化するために、曲線（AUC）またはダイナラボ（Mevis研究、ブレーメン、ドイツ）とのピークの強化（PE）の下でそのような領域などのパラメータを計算するデータの記述分析を実行します。
5. 定量分析ソフトウェアを使用してリアルタイムDCE-USからの情報を定量化する（例えばQontras実装ボーラス注射モデルに従ってシネ·ループを分析することによって、T、ブラッコ、イタリア）。骨転移を介して関心領域（ROI）を配置し、色分けされたマップは、例えば地域の血液量、局所血流と充填時からカーブや定量的なパラメータの下でそのような領域として説明する要因のいずれかを決定します。

7。代表的な結果

SEAへのMDA-MB-231細胞（ 図1）の動脈内注入後、サイト固有の骨転移では、ヌードラットのそれぞれの後肢に開発しています。大腿骨に限局して溶骨性病変は、脛骨と腓骨は約25-30日ポスト噴射を開始MRI、VCT、米国（ 図2）非侵襲的イメージングと数週間のために、フォローアップすることができます。ネイティブおよび造影技法を含む、MRI、VCTと米国を組み合わせる場合は、補完的な情報は、軟組織から構成されている骨転移で評価することができる腫瘍（腫瘍細胞と間質）とそれぞれの溶骨性病変（骨破壊）。技術の間にそれぞれのデータの比較については、3つのすべての画像診断法は、同じラットに連続して使用することができます。 MRIは当初骨髄空洞に閉じ込められ、その後、開発の過程で皮質骨を超えている骨転移の軟組織の形態を表示します。そのような地域の血液量、血流と血管透過性などの機能のパラメータは、（ 図3）DCE-MRIおよび定量から得ることができます。骨の構造、転移の特定の溶骨性変化は、VCTにより、高分解能で評価されています。 MRI所見と相補的な、溶骨性病変は腫瘍の成長を髄内に隣接して配置されています。 VCT血管造影検査では骨転移の変更されたmacrovesselアーキテクチャを明らかにし、DCE-VCTは、微小循環のそれぞれの側面（ 図4）が表示されます 。 metastatiの皮質骨の局所的破壊に起因するcの病変は、米国がB-モードおよびドップラー技術の使用により軟部腫瘍の形態学的および機能的特徴を評価するために適用されます。マイクロバブルのアプリケーションによって、DCE-USは、骨転移における血管新生のリアルタイムイメージング（ 図5）が可能になります。

図1：手術用顕微鏡を介して撮像し、腫瘍細胞接種のために準備ヌードラットの後肢。浅腹壁動脈（SEA）、下降膝動脈（DGA）、膝動脈（PA）と伏在動脈（SA）を含む大腿動脈の、分岐パターン（FA）。動脈クリップSA、PAと近FAなどSEAのライゲーションに置かれ、B、SEAは、ライゲーションの近位カットされた、C、パパベリンの添加後にSEAの筋弛緩、D、に取り込まれたSEAの切開（鉗子）、E、SEAに針を挿入し、SEAのF、執着針（外部FIクリップのおかげで、DGAとPAにSEAを介してデバイス）とMDA-MB-231腫瘍細胞の注入をxating。

図2は 、人間のMRシステム（シンフォニー、シーメンス、ドイツ）、スキャナに置か高周波励起および検出のための自作コイル; B、体積計算断層撮影装置（ボリュームCT、シーメンス、ドイツ）を装備し、フラットパネル、C、臨床超音波システムACUSON Sequioa 512（シーメンスACUSON、マウンテンビュー、CA）。

図3軸MRのセクションを参照してください。左側のパネルで、T2w MRI、中央のパネルは、振幅A（DCE-MRI）、右側のパネルには、為替レートの定数k _{EP（DCE-MRI）。}矢印は、骨転移を指す。赤（高い値）から青（低い値）にDCE-MRIデータ範囲のカラーマップ。

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図4。溶骨性骨転移（左パネル）と血管造影（中央パネル）などのパラメータのピーク強化（右パネル）から軸方向にDCE-VCTセクションの3D VCTの再建。赤（高い値）から青（低い値）にDCE-VCTデータ範囲のカラーマップ。

骨転移のB-モード（形態、左パネル）、ドップラー（血流、中央のパネル）とCEUS（右側のパネルに、血管新生のリアルタイムイメージングからマイクロバブルの注入後にピークエンハンスメント）から図5米国の画像。

補足の映画は、1。 補足ムービーを見るにはここをクリックして 。

利害の衝突が宣言されません。