アイス結合タンパク質の調査用のLabVIEWオペ新規ナノリッター浸透圧計

サマリー

また、不凍タンパク質として知られている氷結合タンパク質（IBPS）は、氷の成長を阻害し、組織の凍結保存に使用するための有望な添加剤です。 IBPSを調査するために使用する主なツールは、ナノリットル浸透圧計です。我々は、光学顕微鏡に取り付けられた家に設計された冷却ステージを開発し、特注のLabVIEWのルーチンを使用して制御する。ナノリットル浸透圧計は、超高感度の方法で試料温度を操作ここで説明する。

要約

不凍タンパク質、氷構造化タンパク質、熱ヒステリシスタンパク質、および氷再結晶抑制タンパク質を含む氷結合タンパク質（IBP）は、寒冷適応生物に見られ、氷結晶と相互作用することでこれらの生物を凍結傷害から保護しています。IBPは、魚類¹、植物^{2, 3}、節足動物^{4, 5}、真菌⁶、および細菌⁷を含む多様な生物に見出されます。IBPは氷結晶の表面に吸着し、IBPの吸着部位において水分子が氷格子に組み込まれるのを防ぎます。吸着したIBPの間で結晶表面に成長する氷は高い曲率を持ち、これにより氷結晶が成長する温度が低下します。この現象はギブス・トムソン効果と呼ばれます。この温度低下により、融点と非平衡凝固点との間にギャップ（熱ヒステリシス、TH）が生じ、その範囲内では氷の成長が停止します^8-10（図1を参照）。IBP研究で用いられる主要なツールの1つにナノリットル浸透圧計があり、これによりIBP溶液のTH活性の測定が可能になります。Clifton社製（Clifton Technical Physics, Hartford, NY,）やOtago社製（Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand）などのナノリットル浸透圧計は、ナノリットル体積の液滴の凝固点降下を測定することで溶液の浸透圧を測定するように設計されています。これらの装置は涙¹¹などの生物学的サンプルの浸透圧測定に使用されており、IBP研究においても有用であることが分かりました。しかし、これらのナノリットル浸透圧計の手動制御は、実験的な可能性を制限していました。温度変化率は確実に制御できず、Clifton社製装置の温度範囲は4,000 mOsmol（約-7.5 °C）に限定されており、また時間関数としての温度記録機能もこれらの装置には備わっていませんでした。

LabVIEWプラットフォーム（National Instruments社）を用いて、カスタムメイドのコンピュータ制御ナノリットル浸透圧計システムを設計しました。既報^{9, 10}のコールドステージには、水が循環するメタルブロックが含まれており、これがヒートシンクとして機能します（図2参照）。このブロックには、LabVIEWモジュール経由で制御可能な市販の温度コントローラを用いて駆動する熱電冷却器が取り付けられています（図3参照）。詳細は以下に述べます。本システムの主な利点は、その高感度な温度制御にあります（図4参照）。自動温度制御により、固定された温度ランプと、詳細な実験データを含むビデオ顕微鏡出力を同期させることが可能です。

TH活性の時間依存性を調べるため、南極細菌Marinomonas primoryensis由来の58 kDaの高活性IBP（MpIBP）¹²を用いて検証を行いました。このタンパク質には、Peter Daviesらのグループ（クイーンズ大学）¹⁰によって開発されたコンストラクトを用いて、強化緑色蛍光タンパク質（eGFP）がタグ付けされています。温度変化のプロファイルがTH活性に影響を与えることを明らかにしました。これらの実験において温度プロファイルを厳密に制御したことで、THの測定精度が大幅に向上しました。さらに、ナノリットル浸透圧計を用いることで、IBPによる再結晶抑制能の試験が可能となりました^{5, 13}。一般に、再結晶とは小さな結晶が消失し、大きな結晶がより大きく成長する現象のことです。IBPは低濃度であっても効率的に再結晶を抑制します^{14, 15}。我々は、LabVIEW制御の浸透圧計を用い、画像のリアルタイムビデオ解析とサンプル室からの温度フィードバックを同時に行うことで、氷の再結晶を定量的に追跡し、氷の分率を一定に維持させました¹³。リアルタイム計算により、実験手順中の制御オプションがさらに拡充されました。また、温度制御可能なマイクロ流体デバイスを設置するための倒立顕微鏡用ステージを開発しました。これについては別途報告します¹⁶。

コールドステージシステム

冷却ステージアセンブリ（Figure 2）は、銅プレートを冷却する一連の熱電冷却素子で構成されています。熱電冷却素子の下にある密閉コンパートメントに冷水を流すことで、ステージから除熱します。銅プレート中央にある直径4 mmの穴が観察窓として機能します。また、サーミスタを適合させるために、面内に直径1 mmの穴を穿孔しました。いくつかの穴（直径500 μm）が開いた特製の銅ディスク（直径7 mm）を銅プレート上に配置し、観察窓に合わせて調整しました。空気は35 ml/secの流量で送り込まれ、Drierite（W.A. Hammond）を用いて乾燥させました。この乾燥空気は、冷却ステージにおいて乾燥環境を確保するために使用されました。ステージは9ピン接続コネクタを介して温度コントローラー（Model 3040または3150, Newport Corporation, Irvine, California, US）に接続されました。温度コントローラーはケーブルを介してコンピュータのGPIB-PCIカード（National instruments, Austin, Texas, USA）に接続されました。

プロトコル

0。予備手続き

1. ガラスが溶液注入用キャピラリー。キャピラリープラー（ナリシゲ、東京、日本）を用いて、ガラスキャピラリーマイクロチューブから微小開口（ブランド社、ヴェルトハイム、ドイツ）を鋭いピペットを準備します。開口部の大きさは、きれいな水で細かい泡立ちを取得するために毛細血管を介して空気を通過させることによって検証する必要があります。毛細血管が閉じているなら、1つはその縁を壊すことによって、それを開くことができます。これは、管壁を含む水に対して軽く押したり傷ついたりすることによって達成することができる。開口部はほぼ遮断されますが、サブミリメートルの気泡の形成を可能にするために十分に開放されていることをキャピラリーなどを準備します。
2. 銅ディスクのクリーニングは。再蒸留水で洗浄した後、0.1％マイクロ-90石鹸（コール-パーマー、ヴァーノンヒルズ、イリノイ州、米国）で10分間銅ディスクを超音波洗浄します。イソプロパノール（技術）ソリューションにディスクを導入し、10分間超音波処理し、再び。フィン同盟国、ろ過された空気を使用してディスクを乾かしてください。このクリーニングステージは実験間IBP汚染を避けるために重要です。
3. ダブルレイヤーカバーガラスアセンブリ。カバーガラスアセンブリは、カバーガラスの表面に水分を凝縮させずに試料の観察を可能にするために調製した。これは、ホットグルーガンで接着したカバーガラスの間に2 DRIERITE（ワシントン州ハモンドDRIERITE、クセニア、オハイオ州、米国）粒子（直径2mm）を置くことによって達成された。この構成では、サンプルを低温に冷却し、観察窓の上に乾燥した空気を爆破する必要があると削除されたときに視界を遮る可能性が結露を防止。

1。冷却ステージセットアップ

1. 4ミリメートル、内径タイゴンチューブ（サンゴバン社、パリ、フランス）への冷却段階の水流入口と出口を接続し、水ポンプへの水の流入口チューブを接続します。
2. 冷却ステージトンの入口に4ミリメートル内径タイゴンチューブを接続乾燥した空気をお届け​​O。空気はインラインDRIERITEカラムを用いて乾燥した。
3. 空気や水ポンプを操作してください。冷却素子はヒートシンクなしで実行されるべきではないことに注意してください。
4. 温度調節器、カメラ、およびLabVIEWのルーチンをオンにします。

2。試料調製

1. ディスクを介して掘削さ500μmの孔を有する直径7mmの銅ディスクの裏側に浸油B（Cargille研究所、シーダーグローブ、ニュージャージー州、米国）の3-4液滴を配置します。
2. 下向きにイマージョンオイル側と冷却ステージ上の銅ディスクを置きます。
3. 2ミリリットルガラスシリンジ（Poulten·グラーフ、ヴェルトハイム、ドイツ）にもう一方の端に接続さ0.7ミリメートル、内径タイゴンチューブにキャピラリーチューブ（鈍端）を接続します。
4. 事前の毛細管を使用した場合と、（予備手順を参照）開口部が適切なサイズであることを保証するために毛細血管の小さな開口部をチェックします。
5. ゆっくりGLAを挿入ガラスキャピラリーが0.1を含むまでssは準備のIBPタンパク質試料管へのキャピラリ（20 mM CaCl ₂およびpH8の25mMトリス-HCl、2.4μMのMpが IBP-GFP、準備の詳細については参考文献^10を参照）、ガラスシリンジを引くタンパク質溶液の液。
6. LabVIEWソフトウェアを経由してビデオの録画を開始します。
7. 冷却ステージ上の銅ディスクの穴の1つにガラスキャピラリー（タンパク質溶液を含有する）の鋭いエッジを挿入します。
8. （オリンパス、東京、日本、10倍対物レンズ）顕微鏡で観察しながら、慎重にガラスキャピラリー先端で液浸油の層に浸透し、タンパク質の少量（〜10 NL）を提供するガラスシリンジを（非常に微妙）を押してください200μmの液滴を作成するためのソリューションを提供します。
9. 二重層カバーガラスアセンブリ（予備手順を参照してください）​​と冷却ステージに穴をカバーしています。

3。 THの活性測定

1. プリSS冷房ボタン、-40に温度を℃に設定
2. 当初、溶液滴は明らかであろう。 -35〜-30℃の中で、典型的には、低温度、℃で、液滴の色が変わり、溶液が凍結されたことを示す。サンプルは凍結した直後に大量の氷が溶け始めるまで、ゆっくりと温度を上昇させる。温度が徐々に増加し、サンプルを完全に溶融する可能性があり、温度のオーバーシュートを避けるために必要である。
3. 50倍の対物レンズに切り替えて温度を調整することで氷を溶かし始める。この調整は、対話形式で行われ、最終的なステップは、通常、0.002℃の小さい温度ステップを使用して実行され単結晶が残るまで溶融し続けています。結晶の最終的なサイズは10μm前後となるはずです。融解が消滅したた最高温度は融点であると判断され、後にビデオ分析の段階で正確に決定されます。
4. 結晶の融点以下の摂氏の数百分のに温度を設定し、10分遅れとの温度勾配を開始します。必要に応じて、ランピング速度を調整します。この間、結晶がIBPSにさらされることになる。
5. 10分間の露光時間が終了すると、温度は、LabVIEWルーチンの制御下で自動的に減少します。
6. 温度が下がるなどの結晶形を観察します。ある時点で、氷晶の突然のバーストが観察されることがあります。これが起こる温度は、結晶のバースト温度として注目されている。
7. 正確な融点とバーストの温度を決定するために、ビデオ分析を使用しています。まず、ビデオ分析を使用することにより、正確な融点を見つける。融解が消滅したた最高温度は融点であると判断されたことを思い出してください。スプレッドシートプログラムでこの融点を文書化します。その後、正確な結晶バースト温度を決定し、この値を記録同様に。融点と凝固点の差、または水晶バースト温度は、IBPの溶液の熱ヒステリシス活性である。

4。時間依存のTH活性の測定

1. 氷の単結晶を準備するためにセクション3.1から3.3で説明されたプロトコルに従ってください。
2. 結晶を形成した後、必要に応じてランプの遅延時間を設定して、ランプをオンにします。
3. 温度は自動的に一度ランプ遅延時間が経過した（事業者の要件に応じて）一定の割合で減少します。
4. 結晶のバーストが起こる温度を文書化します。露光時間を（結晶形成と結晶バースト間の時間）を計算します。
5. 様々な遅延時間の実験を繰り返し、TH活性の時間依存性を評価するために露光時間の関数としてのTH活性をプロットします。

結果

THの時間依存性の測定

LabVIEWのオペナノリットル浸透圧計は、正確なTHの活性測定の性能を容易にします。一定温度の低減率は、TH時間依存性の測定を可能にした。ナノリットル浸透圧計では有効になって正確な温度制御は、これらの実験のために重要だった。溶液中IBPSに氷晶の露光時間は、水晶（クリスタルバースト）の周りに氷の急激な成長まで、結晶の形成からの時間（溶融プロセスの終了）として定義されています。我々はIBPSに氷の結晶の露光時間が決定的にTHの活動に影響を与えたことがわかった。 IBPの露出（数秒）の短い期間では 、MP IBP-GFPの溶液（2.4μM）（ 図5）の低THの活動を作り出した。それは4分のIBP露出でプラトーに達するまでのTH活動はIBP露光時間とともに増加した。高いIBPの濃度で、プレートauのは、短い時間に達しました。

図1：氷に吸着IBPSを示す模式図。 ¹⁰の許可を得て採択された。

図2冷却ステージ。 A）は顕微鏡のチューブに接続されています。 B）の上側のリード線なし。 C）の模式図。

図3。LabVIEWインタフェースのスクリーンショット。 塩素拡大図を表示するには、ここをICK。

図4。温度安定性のグラフ。温度コントローラは、温度0.01℃毎15秒を下げるために設定されていました。

図5 IBPSに氷結晶露光時間の関数として mp IBP THの活動。それぞれの時点では、3月6日の実験の平均値である。

ディスカッション

この作品は、特別な温度制御とTH活動の正確な測定を可能にするコンピュータ制御によるナノリットル浸透圧計の動作を示しています。任意の温度に敏感なシステムでは、不要な温度勾配は避けなければならない。ここで提示装置内の温度勾配を避けるために、試験液滴が銅ディスク冷却ステージ（ステップ2.7）の穴の中央に配置しなければならない。さらに、単結晶は、液滴の中心ではなく、エッジ付近である必要があります（ほとんどの場合、これは自発的に起こります）。説明時間依存性は、冷却速度がTHの測定値に影響を与える可能性があることを示しています。したがって、私たちは、結晶が冷却する前に溶液に暴露された時間のレポートと同様に、冷却速度を含め示唆している。我々は、典型的には0.01で温度をランプダウンする前に、10分を待っていた℃はそれぞれ4秒を繰り返します。

LabVIEWで制御された共olingステージは、マイクロ流体デバイスは熱的に操作することができた上で倒立顕微鏡で使用するために適応されました。このシステムは、eGFPの^9、10、16のタグが付いた氷の結晶とIBPSを含む溶液交 ​​換実験の性能を容易にします。 LabVIEWで制御されたシステムは、指定された適応電気回路を経由して3040温度コントローラを接続することにより、クリフトン·ステージに適合させることができる。このようなシステムは、デイビスラボ¹⁷に運営されています。 LabVIEWソフトウェアとクリフトン·ステージのための指定適応電気回路設計のリクエストも承ります。

結論として、我々は温度とリアルタイム解析用のLabVIEWルーチンを介してビデオ·インターフェースとの間で調整温度上昇と減少（0.002℃感度を持つ）、速度の敏感な制御および操作を容易にナノリットル浸透圧計を説明します。このシステムはimportanアール再現レート制御実験を行うことができます氷と一緒にIBPの相互作用の動態を調査するためのトン。このような実験はIBPSの作用機序を取り巻くいくつかの長い議論の問題に対処することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
名前	会社	カタログ番号/モデル	注釈
イマージョンオイルタイプB	Cargille研究所	16484
DRIERITE	ワシントン州ハモンドDRIERITE	043063 2270グラム
マイクロ90洗浄液	コー​​ル - パーマー	EW-18100から11
プーラーをキャピラリ	ナリシゲ	PB-7
ガラス毛細管	ブランドGNBH	7493 21	長い75ミリメートル、直径1.15
温度コントローラ	ニューポート、アーバイン、カリフォルニア州、アメリカ合衆国	モデル3040	モデル3040
光学顕微鏡	オリンポス	モデルBH2
10倍の対物レンズ	オリンポス		Sプラン10、0.3、160/0.17
50倍の対物レンズ	ニコン		CFの計画、50X/0.55 EPI ELWD
CCDカメラ	Provideo	CVC-140
タイゴンチューブ	サンゴバン、パリ、フランス		タイゴン製剤S-50-HLチューブ
ガラス注射器（2ミリリットル）	Poulten·グラーフ、ヴェルトハイム、ドイツ	7 10227
GPIB-PCIカード	ナショナルインスツルメンツでは、米国テキサス州オースティン	778032から01
ビデオフレームGRAbber IMAQ PCI-1407	ナショナルインスツルメンツでは、米国テキサス州オースティン	322156B-01
LabVIEWシステム設計ソフトウェア	ナショナルインスツルメンツでは、米国テキサス州オースティン	バージョン8
DivXの著者ソフトウェア	DIVX LLCは、サンディエゴ、CA、USA