の受精卵を精製するために S.セレビ、反対の交配型の半数体細胞をフローサイトメトリーベースのプロトコルを使用して接合体形成を可能にするために共インキュベート、赤色または緑色蛍光タンパク質を発現するように操作し、分画した。高濃縮画分は初期の子孫のその後 "-OMIC"研究、リカバリ、および受精卵形態形成の体系的な調査が可能になります。
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この記事について
サマリー
要約
受精卵は、酵母（ 図1）1 を含む多くの生物のライフサイクルにおける半数体と二倍体の状態の間の本質的な中間体である。S. cerevisiaeは異なる交配型（マタ、MATalpha）の半数体細胞の融合の結果を受精卵と相次い著しく非対称な有糸分裂2の結果と同様に多くの20倍体子孫を生成し、対応する安定した二倍体を生じさせる。接合子形成はイベントの複雑なシーケンスによって調整されます：このプロセスでは、可溶性交配因子が受容体を同族に結合し、細胞と細胞の融合細胞周期と絶頂に達するの中断を促進するレセプター媒介性シグナル伝達カスケードをトリガする。受精卵は、前駆細胞または幹細胞機能のモデルと考えられるかもしれません。
多くの受精卵の形成について学習されていないが、受精卵は一般signifの細胞分子質問を調査するために使用されているもののicanceは、ほとんどすべての研究は、受精卵が3月8日ハプロイド細胞の大多数の人口と混在されている交配混合物を利用してきました。接合子形成と接合子の継続生命の生化学の多くの側面は、したがって、未調査のままである。
酵母の接合体の浄化のレポートでは、沈降特性9に基づいてプロトコルを記述しますが、この沈降ベースの手順は私たちの手の中に約90％の純度が得られなかった。また、細胞は高張ソルビトールにさらされているという欠点を有している。そこで我々は、汎用性の高い精製法を開発しました。この目的のために、赤色または緑色蛍光タンパク質を発現するハプロイド細胞のペアは、接合体形成、様々な時期に収穫し、得られた受精卵は、フローサイトメトリーベースのソートプロトコルを用いて精製したを可能にするために共同でインキュベートした。この手法は、純粋さと成熟の便利な視覚的評価を提供します。平均純度画分の約90％である。収穫のタイミングに応じて、成熟度の異なる受精卵を回収することができる。精製されたサンプルは、 "-OMIC"研究のために、初期の子孫の回復のため、この前駆細胞の系統的な調査のための便利な出発点を提供しています。
プロトコル
1。ハプロイド細胞増殖
- Sを育てる標準条件下S288C背景（BY4741）からcerevisiae細胞10。
- 2目立つ蛍光マーカー10のいずれかを表現するために半数を変換します。選択のマーカーは、細胞質に発現可溶性GFP（pEG220、URA3/YIp、BglIIで11で直鎖状）とmCherry（A.ジョンストンからpAJ1661、URA3/CEN、）と融合し、単一のリボソームタンパク質、RPL25です。私たちは、同等の2色の精製プロトコルが半数親細胞によって合成されている他の明るい蛍光タンパク質を利用することができることを期待しています。あるいは、細胞壁は蛍光レクチンで標識することができます。
- 受精卵浄化の前日までに、各細胞タイプ5mlの培養物を接種すると°Cが1.0を超えないA600に到達するために23℃で一晩振とうしながら、それらを栽培しています。 2％グルコース（CSM-グルコース）を含む完全合成培地中のGFP形質転換体（ATY4442）を育てる10ウラシルを欠く合成選択培地中のNd RPL25-mCherry形質転換体（ATY4552）。室温で振盪しながら各細胞型の並列文化を維持している。
2。十字架を実施
- 新鮮な培地に1.0に各サンプルの光学密度（A600）を調整します。 [1光学密度単位〜3×10 7細胞/ ml]
- 10秒間、1長い渦が続く簡潔に二つの文化、渦3倍、等量を混ぜる。
- CSM-グルコースプレートを準備します。プレートはルーチン成長に用いたものと同一であると45分注ぎ、寒天10の固化後に乾燥されています。
- CSM-グルコースプレートの表面の端から1cmの混合物のような多くの20として40 mlの滴を配布します。液滴は、第1の表面に適用されると、経過時間を測定するためにタイマーを起動します。液体が（約30分）吸収された後、プレートをカバーし、カンガルーに邪魔されずにそれらを残すmの温度。
3。収穫の準備
- 23で収穫のサンプル1.75から2.5時間後℃で繰り返して氷の上に板を維持し、CSM-グルコース冷150ミリリットルを用いてプレートから個々の乾燥液滴を洗浄することにより。繰り返して回復を最大化するために同じ培地で滴面積を10〜20回を洗う。氷の上で15mlファルコンチューブに集める。
- 氷上フィッシャーFB120ソニケーター（120Watt、120Volt、周波数20kHz）の間に60％の振幅で10倍のサンプルを超音波で分解するプローブ。
- ほとんどまたは全く凝集物が残っている位相差顕微鏡で確認します。細胞の15から50パーセントは、この時点で受精卵を形成していることが予想される。
- さらなる予防措置（凝集体が安定するように）として、10分間氷上で邪魔されずに垂直位置にあるセルのチューブのままにしておきます。
- ボリュームの最上位90％を回復し、ナイロンメッシュ（BDファルコンポリプロピレン管ストレーナーキャップ（参考352235）を用いて）を介してそれをフィルタリングします。典型的な実験で、10 7個の細胞で1プレートから回収した、この時点では、CSM-グルコースの4 mlに希釈した。
4。フローサイトメトリー
- ソニーiCyt反射モデルフローサイトメーターを使用して、ソート·細胞、（高度に自動化された並列ソート）100ミクロンの先端を持つHAPS1。 GFPの励起は、488nmで青色アルゴンイオン、250ミリワットのレーザーを使用しています。 mCherry励起については、561 nmで100ミリワットのレーザーを使用しています。我々は他のマシンと経験を持っていないが、我々は正しいレーザーが装備されている場合ベクトン·ディッキンソンFACSAria、ベクトン·ディクソンの流入またはベックマン·コールターMoFlo XDPは大丈夫だろうと期待しています。
- 生細胞にゲートにオーダー内を前方対後方散乱プロット上のパラメータをソートベース。 615の放出プロットを確立+ / - 30 nmのバンドパスフィルタ（mCherry）対525 + / - 25 nmのバンドパスフィルタ（GFP）の4つの象限にイベントを分割する、 "赤+緑"、 "赤+緑+"、 "赤グリーン"と"赤緑+ "（ 図S2）。標準fとして非蛍光細胞を使用または "赤 - 緑 - "象限の決定。
- 21.5 psiのシース圧、43400滴/秒の滴周波数、20.5 psiのサンプル圧力でソート細胞。
- 初期の並べ替え（ "リカバリモード"）：CSM-グルコース冷たい250mlのチルドを含むエッペンドルフチューブにサンプルを収集します。冷蔵微量で最高速度（トミーMRX-150、15,000 rpm）で土砂10秒とフロー溶液（フローサイトメトリーシース液（1mMのEDTAを含むPBS）BioSure商品番号1027）を吸引除去する。 CSM-グルコース冷たい500mlに懸濁します。
- 第二分類（ "純度モード"）： "純度モード"オプションを使用して、最初の並べ替えのためにソートを行う。土砂精製された細胞と500ミリリットル-1.0ミリリットルのCSM-グルコースでペレットを再懸濁します。代謝の回復を可能にするために23℃で24ウェルプレートで15分間振とうする。
5。 DeltaVision顕微鏡
- 次のようにアガロースパッドを準備します（超純1.5％アガロースの懸濁液を持参次に沸騰し、CSM-グルコースのアガロース、Invitrogen、カタログ＃15510から07）、渦簡潔に、水平標準スライドガラスの表面にアガロース溶液0.3mlのサンプルを適用し、（なしの二つ目のスライドで一度にそれらをカバー）圧力を加える。
- 10分間冷却した後、優しく滑らかな表面を残すために、アガロース層を乱さないように注意しながら、水平方向にスライドさせて、上部スライドを削除します。 （上部スライドが削除されている場合には、細胞の試料を1から2分以内に適用されるべきである。上部スライドを削除せずに室温で湿潤チャンバー内に保持する場合は、パッドを使用する前日にアップするために保存することができます。）
- 底質試料及び預金アガロースパッド上にペレットを1mlのアリコート（表面に触れることなく）。直ちに平方1号カバースリップでサンプルをカバーしています。片刃黒人で過剰アガロースを切り落とす。注射器から分配ワセリンを有する製剤を封印。
- Deltavision（アプライドPrecisioを使用したイメージ∞/ 0.17/FN26.5）;ビニングなしの100倍油浸対物レンズ（オリンパスUPlanApo 100x/1.40持つn）。
- softWoRx 5.0.0プログラム（使用してz-スタックデコンボリューションhttp://www.api.com/softworx.asp侵襲）、処理を。連続したZ-平面は、一般的に0.2から0.4ミクロンの間隔で収集した。
6。代表的な結果
形質転換されたハプロイド細胞における蛍光強度レベル：半数体における蛍光のレベル図S1に示されている。クロス、落射蛍光検査では、基本的にすべてのGFP形質転換体が緑だったし、すべてmCherry形質転換体は、しばしば暗いが、赤だったということが実証される前に。クロスに使用されるすべての細胞が確かに蛍光灯であることを確実にするために、私達は最も明るい蛍光シグナルと亜集団を使用していました。
収量：FTER初期ソート、赤+緑+サンプル（S2図 ） は、典型的には、8月20日のセルの入力数の％および永続的な細胞間接着などが原因で半数体細胞の過剰な数が含まれています。高濃縮を単一のソートで達成されていないので、部分的に精製されたサンプルは、プローブが再選別で60％の振幅で二回超音波処理しなければなりません。 （1〜2時間の間に、通常、最後の回復にソートし、二つ目はわずか15分を必要とする。）第二ソートを受けた細胞の、赤+緑+のサンプルは、入力セルの百分の23から52までが含まれていた。
位相顕微鏡検査：位相差顕微鏡による検査は、最終的な受精卵の調製物の純度は21製剤（86パーセントから91パーセントまでの範囲）で約90％を平均したことを示した。汚染物質が互いに接触していた半数体の緑色または赤色の半数、またはペアのどちらかであった。 図3は持っている受精卵の割合を集計ノー芽、内側蕾（MED）、側芽（LAT）や頂芽（任期）、同じ色のペアの半数体の数（ "2Same"）、または別の色（ "2Hap"）だけでなく、個々の半数（ HAP）。細胞は1.75時間後に回収したときは、50％以上がunbuddedたと他のサブカテゴリが（内側、外側、または端末蕾と）同じように表されていました。 2.5時間後、4つの各カテゴリ（unbudded、内側、側面または端末芽を含む）中で受精卵のほぼ同数であった。
顕微鏡観察（図4）：
接合体の構造は、精製時に変わらないように見えます。十字架の期間によると、人口は上記で説明したように、unbuddedと出芽受精卵の異なる比率を持っていた。緑と赤の半数体の両方が蛍光シグナル強度にはかなりのばらつきが認められたのでcomparinによって観察されるように他の人が、主に緑だったが、一部の受精卵は、主に赤だったグラム図4の合成画像に単色画像。 GFP（MW 26kDa）が核に入り、核が融合していなくても、核内で見つけることができることにも注意してください。空胞は黒色、非蛍光球として際立っている。
浄化の最終製品は、開発のさまざまな段階で多様な人口をもたらします。受精卵は、核融合を経ていない標識した。タイプBの受精卵はunbuddedされています。タイプCは小さな芽を持っている。型が大きい芽を持っているD、およびEタイプの受精卵は分裂を起こししようとしています。以前の受精卵の多くは依然として非蛍光内側分割線（*）を示し、液胞"継承構造"（私は）12が頻繁に芽に受精卵から延びるように見ることができることにも注意してください。いくつかのケースでは、緑色の信号が赤の信号はそれほど大きい程度に相手に再配布しています。これはポリソームの特徴である（Tartakoff、準備中）転送の遅延を反映している。
ハプロイド細胞を5mlの対数文化のペアから始めて、我々は化学発光検出の手順を使用して、多くのイムノブロットのために十分である約1〜2×10 6個の受精卵を回収。我々は細胞のこの番号からのRNAの約1.5 mgをフェノール - クロロホルム抽出分離プロトコルを使用している。
精製された受精卵は、先行さらなる分析に、冷やしされているので、我々は℃の成長培地中で23℃でインキュベーションすることをお勧めします。
図1。接合体形成の年表。半数と二倍体の間の中間のような受精卵。この図では、古典的な半数体の活性化（shmooing）、それらの融合、および初期芽の形成を示している。蕾はどちらか、（M）は内側横（L）または端末（T）とすることができる。
図2。受精卵精製プロトコールの概略。インキュベーション後グルコースを含む完全培地中の寒天プレートの表面には、細胞混合物を洗浄することにより回収し、純度モード"で第二ソート続いて"リカバリモード"で最初の並べ替えを行った。 "黄色はmCherryとGFP両方の信号が受精卵で表示されていたことを意味します。
図3。精製した画分における受精卵の品種。合混合物は、比較的早期対相対的に、より成熟した受精卵に富む画分を回収するために1.75または2.5時間後に回収した。異なる色で指定された8つの独立した実験は、各時点に対して行った。グラフは、接合体の相対的な数字を示していることヘクタール花芽形成の空間的に異なるパターンをVEの。インキュベーションの短い時間（室温で2.5未満の時間）は、与えられた観測されたすべての芽が初期接合子の発芽のイベントです。
図4。濃縮されたフラクションのDeltaVision検査。典型的なフィールドがDeltavision顕微鏡で調べた。イラストはどちら赤と緑または単一の両方の色を示しています。赤は細胞質GFPにポリソームラベル（Rpl25p-mCherry）と、緑に対応しています。液胞（V）、蕾（b）に示すように、核（n）は、液胞 "継承構造"（i）、および親を分離するために表示されるパーティション（*）：受精卵の高濃縮、および指定された細胞内の特徴に注意してください。比較的早い受精卵のドメイン。それらの変数は全体の色が融合した半数体の相対的な強さを反映している。 2つの親ドメインが保持している場合などではマーカーの異なる色、平衡（細胞質GFP、mCherryタグ付きポリソーム）が不完全であった。進行中の時間経過の研究は前ポリソームに対する可溶性GFPの再配布。ことを示す拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
補足伝説
図S1に。ハプロイド細胞の蛍光左端：mCherryタグ付きポリソームを発現する細胞は緑色の信号を検出するために検討した。矩形窓は陰性細胞を回避するために設定されていました。真ん中のグラフ：細胞質GFPを発現する細胞は陽性のはっきりと明るい主要な人口を示す、分析した。右端：mCherryタグ付きポリソームを発現する細胞を分析した。矩形は（左端上のものと同一）明るい細胞が含まれており、すべてのことができます避けるべきネガ。名称 "R2"が指示された矩形内に回収された細胞の割合を示します。
S2図。第一及び第二のソートでは、細胞分布。これら2色のプロットは、右上の象限（R5）で緑+赤+細胞の割合を示す。この割合は、第二ソートには52％に増加します。横軸：緑信号。縦軸：赤信号。
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ディスカッション
精製された受精卵の可用性は、別の方法として、受精卵が出発生成される可能性がトランスクリプトミクス、プロテオミクス、リピドミクス、並びに受精卵が細胞周期の再入国、細胞壁のリモデリング、出芽と継承の特性を受ける際のメカニズムの調査を含む生化学的研究等を促進しなければならない一方または両方の両親に特性変異を有する菌株による。また、精製された受精卵は、半数体または二倍体細胞の場合と、15％グリセロールを含む培地中で凍結することができ、後で再発新進の側面を監視するために解凍した。
微視的な目的に適した他の蛍光マーカー（ 例えば、タグ付けされたヒストンまたはミトコンドリアタンパク質）を使用して予備実験では受精卵の信頼回復を許可されていませんが、それは同等の精製は、その細胞壁ハプロイド細胞から始まる達成できる可能性がある、または赤に結合されている緑色蛍光団。我々は、sを避けてきましたUCH手続き彼らがさらなるストレスを課し、接合体形成の初期段階に影響を与える可能性があるためです。
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
私たちは、イラスト付きのヘルプは以前の入力とイリヤAylyarovためのフローサイトメトリー、博士誕祭JaiswalさんとDrディウーのヘルプは博士R.マイケルSramkoskiに感謝します。 NIHグラントR01GM089872とメトリー＆ケース総合がんセンター（P30 CA43703）のイメージング顕微鏡の中核施設でサポートされている。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬/機器 | ソース | カタログ番号 | |
| pEG220、URA3/YIpコードする細胞質GFP 11） | E·グロート | ||
| pAJ1661、URA3/CEN、mCherryに融合されたエンコーディングRPL25 | A.ジョンストン | ||
| フィッシャーFB120ソニケーター | フィッシャー·サイエンティフィック | ||
| ストレーナキャップ付きポリプロピレンチューブ | BDファルコン | REF 352235 | |
| 冷蔵フュージ | トミー | MRX-150 | |
| フローサイトメトリーシース液 | Biosure | 1027 | |
| iCyt反射モデルフローサイトメーター | ソニー | ||
| DeltaVisionデコンボリューション顕微鏡 | アプライドPrecision | ||
| 直立落射蛍光顕微鏡 | ライカ | ||
| 超高純度アガロース | インビトロジェン | 15510から07 | |
| CSMのグルコース製剤 注意：寒天プレートの場合は、単に2％寒天（Difco）を含む | 10 |
参考文献
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