三次元異 in vitroでモデリング

サマリー

我々は、確立するための方法論を記述する in vitroで卵巣線維芽細胞と正常卵巣表面または卵巣癌上皮細胞を含む異型3次元モデル。我々は、卵巣癌の開発中に発生する間質上皮の相互作用を研究するために、これらのモデルの使用について説明します。

要約

上皮性卵巣癌（EOCs）は、西洋社会における婦人科悪性腫瘍による死亡の主要な原因となっています。外科的治療と改善プラチナベースの化学療法の進歩にもかかわらず、40年以上^1,2のEOC生存率にほとんど改善がみられた。私の腫瘍は5年生存率> 85％を持って上演しながら、ステージIII / IV疾患の生存率は<40％である。腫瘍は以前より治療可能な^{、3から5まで}の段階で検出された場合、このようにして、EOCの死亡率の高さを大幅に低減することができた。現時点では、早期の疾患発達の分子遺伝学的および生物学的根拠はあまり理解されています。具体的には、少しは、腫瘍の開始時の微小環境の役割についてはほとんど知られていない、しかしEOCs（ 例えば年齢、パリティ）の既知の危険因子には、微小環境がEOCsの初期発生に重要な役割を果たしていることを示唆している。そこで我々は、3次元異機種を開発正常な卵巣の両方と早期卵巣癌の。文化の中で、これらの細胞の寿命を延ばすために、ヒトテロメラーゼホロ酵素の触媒サブユニット酵素（hTERT）のretrovrial形質導入により不死化正常な卵巣のために、我々は、共培養した正常な卵巣表面の上皮（IOSE）と通常の間質線維芽細胞（INOF）細胞。卵巣上皮細胞形質転換、細胞内IOSE CMYC癌遺伝子の過剰発現は、再びINOF細胞と共培養の初期段階をモデル化する。これらの異型のモデルは、上皮細胞の形質転換および浸潤に対する加齢と老化の効果を調査するために使用された。ここでは、これらの3次元モデルの開発に方法論的な手順を説明し、これらの方法論は、正常な卵巣や卵巣癌組織の発達に固有のものではなく、間質と上皮細胞の相互作用が基本である場合、他の組織型を研究するために使用することができる組織の保守及びジの側面sea​​se開発。

プロトコル

図1は、後述のワークフローの概要を示している。

1。正常な卵巣線維芽細胞および hTERTホロ酵素の触媒サブユニットの過剰発現による in vitro での寿命の延長の単離

1. 卵巣組織は知識のある患者の同意及び治験審査委員会（米国機関向け）の承認を得て収集することができる。正常な卵巣組織を両側卵管卵巣摘除術と腹式子宮全摘出術または腹腔鏡下子宮全摘術後に収集することができる。本研究では、組織は、病理医や細胞培養のための生検卵巣間質の一部で調べた。約2〜5 mm ²の組織サンプルはまた、卵巣上皮のサンプリングの機会を減らそうとするために卵巣の中央部から採取した。
2. （不死化正常な卵巣線維芽細胞における細胞培養実験室に新鮮な卵巣組織を輸送余分な抗生物質や抗真菌剤を補充した増殖培地）の。 INOF増殖培地（INOF-GMが）を含む：15％ウシ胎児血清を添加した培地199と1:1の比率で混合MCDB105、2mM L-グルタミン、50μg/ mlのゲンタマイシンおよび250 ng / mlのアムホテリシンBを
3. バイオセーフティキャビネット内部の作業：ゆるく5mlのPBSでサンプルを洗浄することにより、組織に接続されたまま、任意の上皮細胞を取り除きます。吸引し、二回以上繰り返します。
4. クリーン直径10 cm（P100）培養皿に試料を加えたPBSを転送します。第二は、乾いた清潔なP100の培養皿に組織や場所を処理するために、滅菌ピンセットを使用しています。組織0.5cm ^2でピースをカットする滅菌メスを使用。ばらばらに独立したP100の皿とさらにカット<大きさが1mm ²に組織の各ピースを置きます。 20ミリリットルINOF-GM（プラス抗生物質や抗真菌剤）と、37℃、5％CO _2を追加します。位相差顕微鏡を用いて細胞増殖を監視します。細胞を皿のウィットに付着している見ることができますホアヒン（24時間）。
5. 一週間後の再供給、吸引することによって、任意の非付着組織を除去する。その後、週に二回の文化を再供給する。細胞は通常1〜3週間以内に、コロニーを形成することになる。これらのコロニーは継代培養（一度、彼らは500μm程度に達すること）に十分な大きさになったら、トリプシンでコーティングされたクローンディスクを使用してクローンを単離する。
   細胞はカバーガラス上に細胞系のサンプルをメッキと線維芽細胞のマーカー（FSP）、上皮マーカー（パンサイトケラチン）および内皮細胞マーカーのための免疫蛍光染色を行うことで、100パーセント線維芽細胞および他の細胞の汚染物質が含まれていることを確認（フォンWillenbrand第VIII因子）。
6. 通路のプライマリ正常卵巣線維芽細胞（NOF）セルが3 P100料理hTERTのレトロウイルス形質導入に先立って1日にシングルP100の皿から分離します。既製のウイルス上清を共トランスフェクションHEK293T細胞（参照用の標準プロトコルを使用して購入したり、社内で製造することができるターゲット= "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/）。
   レトロウイルス上清をpBABE-湿気のhTERTのベクトル（Addgene）を使用して製造することができる。インキュベーターからNOFsを削除してから、細胞培養培地を吸引除去する。各ディッシュにウイルス上清の3ミリリットルを追加：1皿のhTERT-レトロウイルスを受け取り、2 ^番目の皿は、GFPレトロウイルスを受信して、第三皿はウイルスを受信しません。 INOF-GMが8μg/ mlの最終濃度を得ポリブレンを含有するウイルス上清を重ねる。新鮮な培地で再給細胞は翌日。感染2日後、7日後、ハイグロマイシンB（10 U / ml）を低用量で選択を開始、この用量は20 U / mlまで増加できます。選択は10から14日以内に完了する必要があります。
7. 彼らは500μm付近達するとのhTERTまたはGFPを発現するクローンをリングクローニングによって単離することができる。細胞株は、hTERTおよび主要な細胞株の機能の保持を正常に発現を確認するために追加の特性を必要とする。これには、：（）サザンブロットやPCR ^6,7によっては、PCR-ELISAおよびテロメア長によってテロメラーゼ活性を確認すること、（b）は、重要なマーカー（ 例えば 、上皮細胞を同定するための抗パンサイトケラチン抗体を用いた免疫染色の発現を確認した、とした抗線維芽細胞、線維芽細胞表面タンパク質抗体）プライマリおよび hTERT-不死化した細胞間で類似していること、（c）細胞を確認するには、悪性形質転換のプロパティ（足場非依存性増殖アッセイを使用して）表示されないこと、（d）は、in vitroの寿命での確認拡張子がで観察。 のhTERTを発現する細胞ではなく、GFP のhTERT発現不死化正常な卵巣線維芽細胞は（INOFs）複製老化をバイパスする必要がありますが、neoplastically変換できません。さらにINOF細胞は線維芽細胞表面タンパク質が、そのようなサイトケラチン（ 図2）のような上皮ではないマーカーの発現を維持する必要があります。

2。ティッシュCulturのコーティング非接着細胞培養用ポリHEMAを持つeディッシュ

1. ポリHEMA溶液を調製し、滅菌した瓶に1.5グラムポリHEMA、そして場所からの重量を量る。 95ミリリットル分子生物学グレードの無水エタノールと5 mlの細胞培養グレード蒸留水を追加します。ポリHEMAのヒドロゲルは、溶液の水分含有量に溶解し、エタノールが準備を殺菌します。
2. 完全に溶解するまで65℃水浴°CでポリHEMAソリューションを配置します。これは8時間ほどかかる場合があります。ポリHEMA溶液を長期間にわたって保存することはできませんので、常に新鮮な準備されるべきであることに注意してください。
   トラブルシューティング：ポリHEMAのソリューションは、65℃長いインキュベーション時間を必要とする℃に定期的に混合するポリHEMAソリューションを反転させる。ガラス瓶の底で観察粘度はポリHEMAが完全に溶解し、65℃でさらに培養されていないことを示し°Cが必要です。
3. ポリHEMA溶液を用いて、層流フード、コート組織培養皿の内部で作業を行う。すべてSIZ組織培養皿、フラスコまたはマルチウェルプレートのeはポリHEMAでコーティングすることができる。それぞれの容器に必要なポリHEMAソリューションの推奨ボリュームが表2に示されている。
4. 細胞培養ディッシュは、層流フードの内側に乾燥することができます。これは2〜3日かかる場合があります。ロッキングプラットフォーム上で緩やかに振盪し、より大きなサイズの皿またはフラスコの均一なコーティングを確実にするために使用することができます。ポリHEMAソリューションが乾く場合は速すぎて表面が滑らかでないかもしれません。これを回避するために、乾燥工程全体が点灯したままの皿/フラスコの蓋を確認してください。
5. ポリHEMAの2回目のコートを適用し、上記のように乾燥することができます。
   トラブルシューティング：ポリHEMAコーティングの穴はプレートがあまりにも素早く乾燥する場合は特に、発生する可能性があります。ダブルコーティングはポリHEMAとのプレートは使用前にカバーされているコーティングの隙間やクラックをカバーするのに役立ちます。プレートはそれぞれポリHEMAコートが乾燥するために通常2-3日かかり、それらは細胞培養に必要となる前に、少なくとも週に準備する必要があります。
6. ポリHEMAでコーティングされたプレートは使用するまで室温で保存することができます。

注：1×PBSに溶解し、殺菌するためにオートクレーブ滅菌1％アガロース溶液は、また、短期的な3次元培養用の非接着面（1週間未満）を作成するためにコート細胞培養ディッシュに使用することができます。マルチウェルプレートのアガロースコーティングは、多くの細胞株にウェルあたり単一スフェロイドの形成を促進する凹面を作成します。アガロースコーティングはしばしば長い培養​​期間後に崩壊するとしてしかし、もっと長い3D文化ポリHEMAコーティングすることをお勧めします。

3。 3D文化の三次元（3D）異スフェロイドと再給餌の生成

1. 3D異スフェロイドを確立するために十分な細胞を調製し、in vitroで INOFと上皮細胞培養を復旧して、展開します。のための"大量培養"間質を与えるために、我々は一般的に種子P100の皿あたり^{2-4×10 6} INOFsと0.5×10 ⁶上皮細胞：上皮RA4:1の酸化チタン。 INOF細胞は必要に応じて、線維芽細胞は（ 例えば老化の誘導に先立って三次元培養に前処理することができるゲンタマイシンまたはアムホテリシンBなしINOF増殖培地（INOF-GM）で栽培され、細胞は過酸化水素の致死線量で治療することができます）。
2. 5ミリリットルを5分間（PBS）をリン酸緩衝生理食塩水を用いたドライポリHEMAのプレートを洗浄してください。 PBSを吸引除去し、15ml INOF-GMと交換してください。
3. 一方、3〜5分間、5分間、450×gで遠心分離により培養培地及び細胞をペレット化等量のトリプシンを中和した後、培養皿からそれらを分離するために正常な卵巣線維芽細胞を不死化トリプシン処理。
4. 上清を捨てる。ピペッティングまたは優しくボルテックスでよく混ぜ、5ミリリットルINOF-GMの細胞ペレットを再懸濁することにより、単一細胞懸濁液を作成します。 10μlの細胞懸濁液と10μlのトリパンブルーを混合し、血球計数器を用いて列挙することにより、細胞濃度を決定します。トリパンブルー排除が使えるようになる生きた細胞を識別するD。
5. すでにポリHEMAコートプレートに分注し培地に^{4×10 6} INOFセルを追加します。 37℃新鮮INOF-GMおよびインキュベーションの適切なボリュームを使用して20ミリリットルの文化·メディア·ボリューム℃、5％CO _2を占めています。細胞は、24時間以内に多細胞スフェロイドに集計を開始します。スフェロイド形成は、位相差顕微鏡によって監視することができる。
   大量培養条件下で回転楕円体の数値の正確なカウントが難しいですが、私たちは^{、4×10 6}間質細胞を播種しているとき、我々は50から100スフェロイドを得ていると推定している。回転楕円体のサイズは、通常80から250ミクロンの範囲である。
6. 層流フード内に置かれたピペットの角度でプレートを休んで2〜3日毎にスフェロイド培養を再給。スフェロイドが安定する。これは20分ほどかかる場合があります。わずか約4ミリリットルが皿に残るまで慎重に、5 mlのピ​​ペットで疲れ果てたメディアを取り除きます。スフェロイドを吸引しないように注意してください。 16ミリリットル新鮮INOと再給F-GMとインキュベーターに戻ります。
7. 7日目に、次のように異文化を作成するために、線維芽細胞スフェロイドに上皮細胞を追加します。セクション3.4から3.5で説明されるようにトリプシン処理により卵巣上皮細胞（表現型は正常または形質転換）の懸濁液を調製する。血球計数器を用いて細胞濃度を決定します。上皮増殖培地から引き継がれているからどんな成長因子を防ぐために、一度INOF-GMで洗ってください。
   私たちの研究室では、正常な卵巣表面上皮細胞（OSEC）行は腹式子宮全摘出術または両側卵管卵巣摘除術と腹腔鏡下子宮全摘術により除去卵巣からムドコンセント、患者の同意を得て収集した。卵巣上皮を集めるために無菌cytobrushでブラッシングした。初代細胞を樹立し、上記のアプローチを使用したhTERTで形質導入した。 2DでOSEC文化の詳細は、3DとOSECの不死化は10と11の参考文献に記載されています。
8. 異SPHを形成するために、eroids、単独で線維芽細胞スフェロイドの最初の再給紙文化。その後、上皮細胞、線維芽細胞の4:1比で^{1×10 6個の}上皮細胞と線維芽細胞スフェロイド培養を接種する。 INOF-GMにおける異文化スフェロイドを。
9. さらに14日間の2〜3日毎に異文化を再給。

4。イメージングと分子解析のための処理

1. 多くの異なる技術が異スフェロイドを分析するために使用することができます。イメージングのために、それがスフェロイドを25mlのピペットを用いて培養皿から収穫されることをお勧めします。ゆっくりピペッティングする回転楕円体のアーキテクチャを中断するせん断力の可能性を最小限に抑えることができます。スフェロイドは、その後、10分間、100×gで遠心分離することにより優しく、PBSで洗浄し、ペレット化することができ、より高い遠心力は、回転楕円体を損傷することがあります。あるいは、培養物を50mlファルコンチューブに移し、沈殿させ、そして成長培地はその後削除することができます。
   1. 免疫組織のために化学、中立でフィックススフェロイドは室温で30分間緩衝ホルマリン。ペレットはスフェロイドと70％エタノールでホルマリンを交換してください。ヒトの組織に使用される標準プロトコルを使用してパラフィンにプロセス。パラフィン包埋切片スフェロイドは、ヘマトキシリンおよびエオシンまたは標準の免疫組織化学（ 図3）を使用して特定の分子マーカーのいずれかで染色することができます。
   2. 代わりに、PBSで洗浄しスフェロイドは、（PBS中で調製した）を4％パラホルムアルデヒドで固定凍結切片と免疫蛍光染色のために凍結最適切削温度10月媒体とスナップに埋め込むことができます。
2. 分子解析のために、球状体をペレット化し、収穫され、DNA、RNAまたはタンパク質抽出のために細胞を溶解する前に、PBSで2回洗浄することができる。
3. フローサイトメトリーによる解析では、球状体を37℃でPBSおよびトリプシンまたはaccutase消化による解離で洗浄することができますこれを行うには、水没ファルコンチューブはスフェロイドiを含むトリプシン処理を容易にするために、NA水浴。単一細胞懸濁液にスフェロイドの解離を完了する1ミリリットルピペットチップで上下ソリューションをピペッティングすることにより促進させることができる。細胞をトリプシン処理オーバーしないように注意してください。

培地の等量との反応を中和し、40から70μmの細胞ストレーナーを通して懸濁液を通過させることによって、細胞塊を除去します。ペレット細胞は、PBSで洗浄列挙し、FACS緩衝液中の細胞数を任意の数に懸濁します。製造業者の指示に従って、細胞を染色。

5。代表的な結果

このアプローチは、広範囲の用途に使用され、正常な卵巣生物学の研究だけでなく、卵巣癌の発生の研究のためにすることができます。市販の細胞外マトリックスゲルを用いて作成された3D文化に対するこのアプローチの主な利点は、正常な卵巣線維芽細胞は、uを作る細胞外マトリックスを生成することであるスフェロイドのコアをP。我々の経験では、正常な卵巣線維芽細胞によって産生さマトリックス材料は不均一であるとより密接に市販のマトリックスゲルより卵巣の細胞外マトリックスに似ている。私たちのラボでは部分的に閉経後の卵巣で、早期卵巣癌を模倣するために、通常と老化卵巣線維芽細胞と定義されている遺伝的な要素（ 例えばCMYC過剰発現）と共培養し、これらの細胞を用いてin vitro で形質転換された上皮細胞を利用してきた。我々のデータは、通常の微小環境が腫瘍の進行^を抑制^する一方^、8老化微小環境は、部分的に変換上皮細胞（ 図3）の腫瘍の特徴（ 例えば、増殖）を促進することを示唆している。私たちの研究室や他の人も正常卵巣上皮細胞^9、卵管上皮細胞、腫瘍進行の段階的なモデルをモデル化するために同様のアプローチを使用していた^11月13日 。我々は、細胞がスフェロイド培養に移​​行された場合、細胞を単層として培養すると検出できない正常細胞と悪性細胞の組織学的特徴が復元されることを観察した。例えば、明細胞卵巣癌の組織学的特徴は、明細胞卵巣癌細胞株の3次元培養（ 図4）ではなく、同じ細胞の単層培養で検出することができる。また、3次元培養された細胞は、より密接に、従来の2D単層培養^9-11に培養された同じ細胞に比べて、一次組織に見られる組織特異的タンパク質の発現を反映しています。モデリング正常および悪性の卵巣組織にこれらのアプローチはまた、ジと関連付けすることができる新規候補卵巣癌の腫瘍抑制遺伝子や癌遺伝子および他の分子バイオマーカーの発見と機能解析のための貴重なツールを表すsease開発^10,14。

図1。 3D異を培養するためのプロトコルの概略図。組織培養フラスコが二度1％ポリHEMA溶液を塗布し、乾燥させる。ポリHEMAコーティングされたプラスチックは、使用直前に1×PBSで洗浄する。不死化正常な卵巣線維芽細胞^{（4×10 6}細胞）を20mlの増殖培地をフラスコに播種する。 7日間にわたって監視スフェロイド形成と成長。この時点で、線維芽細胞スフェロイド培養を^{1×10 6個の}上皮細胞を接種されており、多細胞スフェロイドが下流アプリケーション（分子解析、イメージングなど）に収穫され、処理される前に、2種類の細胞を14日間共培養されています。

図2。 hTERTの免疫蛍光染色</ em>は両方のプライマリ正常卵巣線維芽細胞（PR NOFs）正常卵巣線維芽細胞を不死化し、正常な卵巣線維芽細胞（INOFs）急行線維芽細胞特異的タンパク質（FSP）、（CK-7）サイトケラチン-7を発現しないと急行ビメンチン（VIM）を不死。興味のあるマーカーが緑で表示され、DNAはDAPIで染色し、青で表示され、細胞質はEvanの青色と赤色で示さで対比されています。

図3。共培養ストローマ細胞や上皮細胞の免疫組織化学。左パネル、正常な卵巣線維芽細胞スフェロイドの単作、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。正常な卵巣線維芽細胞はspindled-形態と豊富な細胞外マトリックスと細胞からなる3Dフォームスフェロイドで単独培養した。右のパネル：正常卵巣線維芽細胞は老化を誘導するために過酸化水素に暴露された。部分的に変換卵巣上皮細胞（IOSE ^CMYC細胞の増殖を促進。 CMYC過剰発現せずに親のIOSE細胞は、PSNやSENの線維芽細胞と共培養し、増殖の有意差を示さなかった。これらのデータは示唆している私たちのin vitroで共培養モデルにおいて 、卵巣間質における老化のプロセスは、OCS ¹¹の開発を促進することがあります。 * P≤0.05、両側t検定ペア。

図4。 （）明細胞卵巣癌が特徴明細胞構造を表示する3次元培養細胞の組織学的特徴は、一次組織を反映しています。明細胞EOCのラインが同じ細胞が3Dスフェロイドとして栽培されているときにプラスチックが、類似した構造が検出された（上に成長されている場合、これらが欠けているB）。 14日間スフ​​ェロイドとして栽培正常卵巣上皮細胞の（C）は、走査型電子顕微鏡写真。表面の微絨毛（矢印）は表示されます。 （D）は漿液性卵巣癌細胞株のスフェロイド、文化インチ腫瘍組織または3Dスフェロイドを埋め込まれた切片のパラフィン（A、B）ヘマトキシリン​​·エオシン染色（C）走査型電子顕微鏡、（D）は、位相差顕微鏡。スフェロイドは（破線の円）は、球状であることができますまたは画像の左側に見られる構造の場合のように、形が不ぞろい。

皿/プレートサイズ	ポリHEMAの体積（二回適用される）	文化メディアファイナルボリューム
6ウェルプレート	3ミリリットル	5〜7ミリリットル
12ウェルプレート	1.5ミリリットル	2ミリリットル
24ウェルプレート	500μlの	1.5ミリリットル
48ウェルプレート	250μlの	500μlの
96ウェルプレート	50μlの	200μlの
P100培養皿	4〜5ミリリットル	20ミリリットル
P60培養皿	2〜3ミリリットル	5〜7ミリリットル
F25フラスコ	2〜3ミリリットル	7ミリリットル
F75フラスコ	4〜5ミリリットル	20〜30ミリリットル
F175フラスコ	15ミリリットル	30〜50ミリリットル

表2ポリHEMAコーティングと3D培養用のボリュームをお勧めします。

ディスカッション

早期上皮性卵巣癌の生物学（EOC）は、あまり理解されていない。おそらく、長年にわたってこの分野の主要な障害の1つは、組織特異的疾患の起源とEOC開発における微小環境の役割の重要性の理解の欠如であった。過去数年間、EOCがおそらく異なるサブタイプの異なる細胞起源を持つ複数の異なるhistophathologicalサブタイプを持つ異質な疾患であることが明らかになってきています。たとえば、現在のデータは、高品位漿液EOCsは卵管分泌上皮細胞と卵巣表面上皮細胞の両方に由来することが示唆され、少なくとも内膜および明細胞EOCsの割合は、卵巣子宮内膜症（子宮内膜）から発生すると考えられている、と粘液EOCsは卵巣傍のまたはparatubal移行型上皮^15,16から発生する可能性がある。しかし、唯一のin vitroおよび<そこに限定されていたem>はこれらhistotypesのいずれかの疾患進行のin vivoモデルインチ腫瘍間質-上皮の相互作用と発展卵巣癌に関連付けられた微小環境を研究するために、EOC の in vitro異型モデリングにおける

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬	サプライヤー	カタログ番号
細胞培養に適したポリHEMA、	シグマアルドリッチ	P3932
分子生物学グレードのエタノール	シグマアルドリッチ	E7023
細胞培養用の滅菌水	VWR	12001-356
MCDB105	シグマアルドリッチ	M6395
培地199	シグマアルドリッチ	M2154
ハイクローンウシ胎児血清	サーモサイエンティフィック	SH30088.03
ゲンタマイシン	シグマアルドリッチ	G1397
アムホテリシンB	シグマアルドリッチ	A2942
pBABE-湿気のhTERTの	Addgene	1773
PBS	VWR	12001-766
0.25％トリプシン-EDTA	インビトロジェン	25200-072
セルストレーナー（40または70μm）を	VWR	21008-949 21008-952
抗線維芽細胞表面タンパク質抗体、クローン1B10	シグマ	F4771
抗パンサイトケラチン抗体（C11）	サンタクルス	SC-8018
ポリブレン（ヘキサジメトリンブロマイド）	シグマ	107689
TeloTAGGGテロメラーゼPCR ELISA PLUS	ロッシュ	12013789001
テロメア長AssayをTeloTAGGG	ロッシュ	12209136001