骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

Summary

骨髄移植は、骨髄由来細胞の遺伝子型を変更する方法を提供します。目的の遺伝子が骨髄由来細胞と非骨髄由来細胞の両方で発現されている場合は、骨髄移植では、非骨髄由来細胞の遺伝子型を変更することなく、異なる遺伝子型に骨髄由来細胞を変更することができます。

Abstract

大腸炎の開発における遺伝子の役割を理解するために、我々は、野生型マウスと大腸炎に目的遺伝子欠損ノックアウトマウスの応答を比較した。目的遺伝子は、骨髄由来の細胞とホストの非骨髄由来細胞の両方で発現される場合、ただし、それは、骨髄由来の細胞と非骨髄に目的の遺伝子の役割を区別することが可能である骨髄移植技術によって誘導された細胞。マウスの骨髄由来細胞の遺伝子型を変更するには、レシピエントマウスのオリジナルの骨髄を照射して破壊され、その後、別の遺伝子型の新しいドナー骨髄に取って代わられた。野生型マウスのドナー骨髄をノックアウトマウスに移植したとき、我々は骨髄由来の細胞における野生型遺伝子の発現とノックアウトマウスを生成することができます。あるいは、時のノックアウトマウスドナー骨髄は目的遺伝子を発現せず、野生型レシピエントマウスは、野生型マウスに移植した骨髄由来の細胞を作製した。しかし、骨髄移植は100％完全ではありません。そこで、レシピエントマウスと骨髄移植の成功におけるドナー骨髄由来の細胞の割合を追跡するために、ドナーとレシピエント細胞のマーカーとして分化（CD）の分子のクラスタ（CD45.1とCD45.2）を利用。 CD45.2遺伝子型を持つCD45.1遺伝子型とノックアウトマウスと野生型マウスを用いた。レシピエントマウスの照射後、異なる遺伝子型のドナー骨髄細胞をレシピエントマウスに注入した。新しい骨髄がその免疫を引き継ぐために再生したときに、マウスは大腸炎を誘導する化学剤（デキストラン硫酸ナトリウム、DSSの5％）でチャレンジした。ここで我々はまた、マウスでは大腸炎を誘導し、骨髄由来の細胞から発現対象の遺伝子の役割を評価するための手法を示した。骨由来の細胞から目的遺伝子は、疾患の発症に重要な役割を（例えば大腸菌などに再生される場合TIS）、骨髄移植によるレシピエントマウスの表現型を大幅に変更することができます。大腸炎の実験の最後に、血液や骨髄中の細胞を骨髄由来がCD45.1とCD45.2に対する抗体と存在の彼らの量的比率を用いて標識したフローサイトメトリーにより、骨髄移植の成功を評価するために使用することができる。成功した骨髄移植はレシピエントマウスの骨髄や血液の両方で受信者の遺伝子型以上のドナー遺伝子型（CD分子マーカーの任期で）の大半を示すべきである。

Protocol

1。前あなたスタート技術的な考慮事項

1. 対応するCD分子とマウスはマウスの主要ベンダーから購入することができますので、我々は実験のためにC57/BL6野生型マウスとノックアウトマウスの両方を使うことをお勧めします。
2. それは、骨髄移植後の野生型マウスとノックアウトマウス由来のドナー細胞を追跡するのは困難であるので、それは野生型マウスを表すためにCD45.1マウスを使用する必要があります。 （CD45.1 C57/SJL WTマウスジャクソン研究所の株式＃002014）。
3. ほとんどのマウスコロニーがCD45.2です。私たちのノックアウトマウスは、CD45.2遺伝子型（：ジャクソン研究所株式＃000664交互CD45.2 WTマウスソース）に属しています。 CD45.1またはCD45.2遺伝子型の決定は、このプロトコルのセクション7で説明したように、骨髄や末梢血のフローサイトメトリーを用いて行うことができる。
4. 照射後のマウスは、免疫力を損なわれている。病原体フリー施設でマウスをおいてください。
5. 照射装置の動作は、特別なセキュリティを必要とするclearanceとトレーニング。訓練および承認プロセスに時間を節約するために、それは照射装置を操作することができる資格を持つ技術者による実験室と協力するのが最善です。
6. 多くの機関は、経験豊富な技術者とフローサイトメトリー実験室を持っています。フローサイトメトリーの動作に問題を最小限に抑えるた....

Results

目的遺伝子は、大腸炎の開発の間に免疫細胞で重要な役割を果たしている場合には、骨髄を​​介して異なる遺伝子型の骨髄を受けたマウスは、移植（KOまたはKOにWTとWTは）DSS大腸炎への応答変化があるはずです。大腸炎の重症度を決定するための最も重要なパラメータの1つは、結腸組織のH＆E染色である。結腸組織構造の変化や炎症の徴候を定量的に、H＆E組織像のスコアリングシステムで評価することができる。 DSS大腸炎モデルのため、H＆E組織像のスコアの基準は、ここ^に2を発見することができます。あるいは、化学物質誘発性大腸炎はまた、ニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）によって誘導することができる。 TNBS腸炎誘導し、H＆E組織学採点基準の方法は前の刊行物³に記載されています。グループ間の組織学的スコアの差はスチューデントの t-検定により分析することができる。

マウスはかなり持っているかもしれ改善または偽骨髄移植（WTまたはKOにKOにWT）を持つマウスと比較した場合、大腸炎を悪化させた。目的遺伝子は、骨髄由来細胞を介して大腸炎にお.......

Discussion

この骨髄移植のアプローチは、大腸炎の免疫学研究、感染症、癌、肥満や他の病気のために適している。この骨髄移植実験は、目的遺伝子が両方の骨髄由来と非骨髄由来細胞と目的遺伝子がいずれの集団からの細胞によって病気を媒介することが疑われるで発現した場合に必要とされる。例えば、抗菌ペプチドカテリシジンは、急性大腸炎を調節することが示されている。しかし、それは、上皮細胞や免疫細胞（マクロファージなど）の両方で表されます。その後、我々はマウスの急性大腸炎を調節する細胞のどの集団を定義するために骨移植を使用していました。大腸炎の重症度が有意に骨髄移植を介した骨髄カテリシジン遺伝子型の変更後に変更されていました。その後、我々は、DSSに対応して変調急性大腸炎に重要な役割を果たしている骨髄由来細胞で発現したカテリシジンを締結することができます。

骨ミリアンペアrrow由来の細胞は、典型的には赤血球、白血球、血小板が含まれています。骨髄移植は、これらの細胞ではなく、他の遺伝子型を変更します。横方向に言えば、この実験は、非骨髄由来の細胞に対する骨髄由来細胞における目的遺伝子の役割を区別することができます。し.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号
細胞染色バッファ	Biolegend	＃420201
10X RBC溶解バッファー	Biolegend	＃420301
FITC標識マウスアイソタイプコントロール	Biolegend	＃400207
PEのマウスアイソタイプコントロール	Biolegend	＃400211
PE抗マウスCD45.2	Biolegend	＃109807
FITC抗マウスCD45.1	Biolegend	＃110705
抗マウスCD16/32ブロッキング	Biolegend	＃101301
40μmのセルストレーナー	Fisherbrand	＃22363547
PBS 1X	MPバイオメディカル	＃1860454
ヘパリン	Fisherbrand	＃BP2425
Sulfatrim（SMZ）	Qualitest	NC9242720（漁師）
ライゾールIC	Andwin科学	NC9745686（漁師）
Vaccutainer	BD	＃8000813
マウス制止	トリーサイエン	＃テレビ-150
照射器	JLシェパード·アンド·アソシエイツ	私は68Aマーク
フローサイトメーター	BD	BD FACSCanto II
フローサイトメーターの試験管	ファルコン	＃352052
デジタルノギス	Fisherbrand	14-648-17
ヘモカルトICT	ベックマン·コールター	G0328QW