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方法論記事

胎児のマウスモデルにおける生物活性剤の気管内投与のための新しい手術アプローチ

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DOI：

10.3791/4219

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2012年10月31日

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1Molecular Virology and Gene Therapy, KU Leuven, 2Department of Woman and Child, KU Leuven, 3Neurobiology and Gene Therapy, KU Leuven, 4Division of Nuclear Medicine, KU Leuven, 5Biomedical NMR Unit/ MoSAIC, KU Leuven

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

我々は、マウスの胎児への生物活性剤の気管内投与のための新規な外科的アプローチを開発しました。配達ルートは、一般的に使用される羊膜内の注射よりも胎児のマウス肺を標的にするより効率的です。この手順では、マウスモデルで説明されていない最新情報を持っています。

要約

細胞、遺伝子または薬理学的薬剤の胎児期の肺送達は、遺伝的および後天性疾患の様々な新たな治療戦略のための基礎を提供することができます。配信遺伝子の長期発現のための要件と先天性または遺伝性異常とは別に、短期的な遺伝子発現または薬理学的介入は、治療効果を達成するの​​に十分である、いくつかの非継承周産期の状態は、このための潜在的な将来の適応と考えられているアプローチの一種。短期的な出生前治療の適用のための候補疾患は、新生児呼吸窮迫症候群の1,2または新生児肺3の高酸素けがの原因となることがサーファクタントプロテインBの一過性新生児の欠乏である可能性があります。永久的な治療の訂正のための候補疾患は嚢胞性線維症（CF）4、界面活性剤の不備5、α1-アンチトリプシン欠損症6の遺伝的変異体である。 <Pクラス= "jove_content"は>一般的には、出生前の遺伝子治療の重要な利点は、このように個々に取り返しのつかない損傷を防止すること、患者の臨床症状の前に、あるいは、開発の早い段階で治療的介入を開始する機能です。胎児へのより効率的な遺伝子や幹細胞の伝達を可能にでき成体の臓器に比べて、さらに、胎児の器官は、細胞増殖の増加率を持っています。さらに、 子宮内遺伝子送達で個体の免疫系が完全に成熟していないときに行われます。したがって、正しいバージョンと非機能的か、または存在しないタンパク質の異種細胞または補充の移植は最近、携帯電話や遺伝子治療7の両方でケースであることが証明された細胞、ベクトルまたは導入遺伝子産物に対する免疫感作を起こすべきではありません。

そこで本研究では、マウスを直接メートルの胎児気管をターゲットにする可能性を検討odel。この手順では、このようなウサギ、羊8、さらには臨床の現場9のような大きな動物モデルで使用されていますが、マウスモデルで前に実行されない日があります。例えば、CFなどの遺伝性疾患の胎児の遺伝子治療の可能性を検討する際に、マウスモデルでは、異なるためトランスジェニックマウス系統の広い空、十分に文書化された胚及び胎児の開発の最初のproof-of-conceptとしてあまり厳しく非常に便利です倫理的な規制、短い妊娠期間と大産仔数。

別のアクセスルートはイントラ羊水注入10-12、卵黄嚢の血管15,16または臍帯静脈17に（超音波ガイド下）肺内注射13,14及び静脈内投与を含む、げっ歯類の胎児の肺を標的に記載されている。我々の新規手術は直接できますマウス胎児気管に最適な薬剤を注入するために研究者を可能にする既存の技術18より気道へのより効率的な配信のため。

プロトコル

1。理想の妊娠ステージを取得するためにマウスの交配

タイムメイト妊娠NMRIマウスので、彼らは手術時（合計妊娠E19.5）妊娠18日目（E18）であること。手術前と後に、それらは通常の室温、水と固形飼料への無料アクセスを通常の昼光でフィルタトップケージに収容されています。

2。胎児の気管内（IT）の注入（図1）

  1. 最初の1.5 L /分でO 2の混合物中のイソフルラン1.5％の全身麻酔に妊娠のNMRIマウスを提出してください。イソフルランのレベルは、マウスの年齢とひずみに依存するが、一般的には、イソフルラン麻酔状態で動物を置くレベルでなければなりません。そして中に体温を維持するために（37℃）加熱パッド上妊娠マウスを置く手術。
  2. 全体の外科的処置は、2外科医によって実行されます。一外科医は妊娠マウス及び番目の後続の露出の郭清を行います気管内注入のためのe胎児。第二外科医は胎児の気管内注入自体が実行されます。外科手術は、滅菌機器や無菌技術を使用して実行されます。
  3. ポビドンヨウ化腹部を消毒し、妊娠子宮を露出させるために中央値開腹術を行います。一度子宮角を体外に出すと妊娠嚢の数を数えます。ホーンごとに胎児がオン操作され、後続のステップで胎児の頭部の具象化のための最適な位置に基づいて選択されます。最も適した胎児が子宮壁を通して可視化で選択されています。胎児の頭の鼻は、胎児の頭部を露出させて、（その後のステップ2.5で説明したように）後方にそれを修正した後で気管内に注入します外科医に向かって指している必要があります。
  4. 最初の約1子宮壁を通して直径センチ、胎児膜（羊水MEMBRANの6から0ポリプロピレン（PROLENE） 巾着縫合を渡す後で胎児の頭の上を介して公開される領域で電子と頭頂卵黄嚢）。この縫合は肩以降の子宮の内側に固定胎児を保持します。次に、鋭いはさみを使用して約0.8cmの巾着内側子宮に切開を行います。
  5. 優しく子宮切開を通して胎児の頭と首を絞る。首周りに優しくタイト巾着縫合糸を引き、2マイクロモスキート鉗子で所定の位置に固定します。 胎児の頭が上あごの周りの口の中に置かれた2つの鉗子で5から0ポリグラクチン910（VICRYL）縫合により過伸展に保持されます 。
  6. 立体ズーム顕微鏡下（×倍率） 胎児の気管は鋭く、鈍的切開を用いて垂直頸部切開をすることによって可視化される 。頸部の切開は約5mmの長さである。下層組織がさらに気管に到達する鈍的切開を用いて切開するとして、それは、表面的な切開です。
  7. は直視下立体ズーム顕微鏡を通して、30 Gの鋭い針で50μlのハミルトンガラスシリンジを用いて気管内に物質（ 例えば蛍光ビーズまたはウイルスベクター）の30μlの全容量を注入します 。針を除去した後、注入された液体の流出は最小限の正しい注射を確実にします。切開は注入後に閉鎖されていません。
  8. 子宮内にヘッドを交換するには、鼻の上に穏やかな圧力を適用します。首は頭から続いて、子宮に戻った。鼻が最後に入ります。次に、巾着を締めて、子宮切開を閉じます。その後羊水防ぐために羊膜腔に生理溶液約0.5ミリリットルの合計を注入します。これを行うには、巾着内側切開の中に針を挿入します。次に、生理食塩水が注入された後に、縫合針の周りを閉じます。最後のステップでは、完全に電話を閉じ、続いて針を撤回文字列をURSE。
  9. 2つの別々の層で5から0 VICRYL実行して縫合糸で母体腹壁（腹膜と、内側と外側の筋層）、皮膚を閉じます 。その後、術後の痛みを軽減するため、0.2％キシロカインと切開に潜入。術後鎮痛のために - それは、ブプレノルフィン（0.1 mg / kg皮下またはIP 0.05）の使用を推奨します。どちらも予防tocolyticsも抗生物質が使用されています。マウスは、加温パッド上に保持された（37℃）が完全に回復するまで（約1時間）。

3。胎児の羊膜内の（IA）のインジェクション

  1. 2.1を参照してください
  2. ポビドンヨウ化腹部を消毒し、妊娠子宮を露出させるために中央値開腹術を行います。一度子宮角を体外に出すと妊娠嚢の数を数えます。
  3. それを実行するために時間がかかりませんように、IA注入はすべて胎児に行うことができます。さらに、胎児の位置がcritiないcalは気管内注入に比べて。子宮壁が半透明であるように、このような頭部、四肢と尾と胎盤の位置などの胎児の構造がきれいに見えます。
  4. （2.7）上記と同じ針とシリンジを用いて、胎児の口の近くで物質30μlを注入します 。これは、胎児の頭部と前肢の間に、または下肢と尾の間のいずれか最も簡単に行うことができます。注射だけなく胎児の構造は、注入時の先端に接触していないことを確認するための針の位置を慎重に検討した後に行われる。
  5. 子宮が腹部に再配置し、腹壁と皮膚は、上述したように（2.9） クローズされます。

4。注入された胎児のアセスメントとクロス育成

  1. 胎児の介入（E19.5時）以降に承認された安楽死の方法36時間を使ってダムを殺す。追加せずに頸椎脱臼麻酔（ペントバルビタール、 例えばイソフルラン）を含む安楽死の他のすべてのフォームを使用すると、すべての回で回避したいと胎児を、麻酔したり、強制終了されますように麻酔は、最善の方法であろう。 帝王切開で手術を受けた胎児を提供します。直営胎児は、その位置によって子宮内で識別されます。羊膜嚢は双角子宮の卵巣終わりから始まる番号が付けられます。
  2. （1）ハート、（2）ピンクの肌の色（対チアノーゼ）、（3）自発運動の有無：配達の後で、次の基準が胎児の生存能力を評価するために使用されています。 1日齢の仔を含む養母のごみで、これらの基準を満たす唯一の子犬を置きます。経験によって、私たちは弱い心拍、チアノーゼ、皮膚の色および/または最小限の自発的な動きと子犬がしばしば養母のごみから、あるいは母親の共食いによる拒絶のために生きていけないことを知っている。
  3. 分娩後のOITまたはIA注入（ 例えば、赤の蛍光分子）を介してFA可視染料は、それはそれの後に肺の中に直接注入することにより胸部の（（注入赤fluospheresからピンク色）この色素の存在によって正確な注入を確保することができる注射、またはIA注射後の肺への吸入）または腹腔内（経口摂取）による。これは、生まれたばかりのマウスは肺や胃の in vivo評価において可能にする半透明であるという事実に起因する可能性があります。
  4. 皮下テールベース上中国インクで正しく注入された子犬をマークします 。養母のごみは4.2で述べた要件を満たすすべての子犬を、置きます。
  5. 最大の受け入れや手術を受けた仔の生存を確保するため、養母のリターの合計（いずれも彼女自身の1日齢の仔だけでなく、クロス培っ仔）で10以上の仔を残す。手術を受けた子犬を置く前に任意の非おなじみの臭いをマスクするために彼女の糞と尿の両方を含む養母のリターのS、養母から寝具材料の中でそれらをカバーし、。
  6. 静かな環境の中でケージを置いて、少なくとも12時間（一晩）のためにゴミを乱すことがありません。
  7. 次の日、養母の子犬と手術を受けた仔（中国語インクや他の子犬より小さい平均でマークされている）を区別することは、すべての子犬をカウントすることにより、育成の生存率を慎重に評価している。母親による拒絶を回避するために、低体温症を避けるために、これらの仔の操作時間を最小限に抑えます。子犬が（による新生仔の半透明の自然に見えている）彼らの胃の中にミルクを持っていない場合、一般的に、予後はこれらの動物の生存のためにさらに非常に貧弱である。

5。代表的な結果

実験の全体的なスキームはFigurに描かれているE 2。

気管内注入のための最適な使用量の決定

ITの注入のための最適な使用量を決定するために、我々は経験的に10、20〜30μlの（N = 3/volume）までの範囲の異なるボリュームを選択しました。容易に検出するために、私たちは赤い蛍光分子（fluospheres、Molecular Probes社、ライデン、オランダ）の大きさ100nmを注入することを選んだ。 E18古い胎児のIT注入後、肺は℃、6μmの凍結切片を作製した4℃で一晩、4％パラホルムアルデヒドで固定し、24時間後に収穫した。核とアクチンフィラメントはヘキスト33258（Sigma-Aldrich社、Bornem、ベルギー）とAlexa Fluor 488ファロイジン（Invitrogen社、Merelbeke、ベルギー）は、それぞれ室温で20分間で染色した。共焦点画像は、カールツァイスによってLaserSharp2000.6ソフトウェアとバイオラッドラディアンス2100共焦点顕微鏡を用いて行った。相対蛍光（青色蛍光表すfluospheresと核staininに赤の比率それぞれgの）ImageJのオンラインソフトウェア（図3）を用いて定量した。胎児手術の時に、逆流が注入流体の過剰を示す、唯一の30μlの注射後に検出されたが、相対蛍光（分散分析を測定することによって定量化として、30μlのは、肺実質における蛍光シグナルの最大量を与えた、スチューデントのt検定を使用して、各ペアごとの比較は、* p <0.05、*** p <0.001）であった。

胃腸管に肺組織および生体内分布におけるfluospheresの定量的評価

次に、我々は、IT対アイオワ注射後に胎児のマウス肺を標的とすることの効率を比較したかったのです。これを行うには、fluospheres30μlのITまたはE18妊娠NMRIマウス（各群n = 5）でのIA注射のどちらか後に胎児のマウス肺に届けられました。 ITの注射は、IAに比べて胎児の肺へfluospheresの有意に高いデリバリーをもたらし。ルート（1.43±0.56及び0.05±0.02相対蛍光（それぞれヘキストへfluospheresの比率、分散分析、スチューデントのt検定、*** P <0.001）（図4 AC）。未処理対照の胎児は、蛍光の正常化のために使用された背景は信号。胃腸管は、ITおよびIA注射した動物（図4 d）の両方に陽性であった。なし赤色蛍光が扱わ胎児から他の組織内または負の対照動物（データは示さず）において観察されなかった。

胎児肺におけるrAAV2/6.2媒介遺伝子送達後に気管内および羊水注入の比較

蛍光分子を注入することにより、両方の配信方法を比較した後、我々は、ITおよびIA注入はrAAVベクターを使用した後にウイルス形質導入とその後の遺伝子発現の効率性を評価したかったのです。 rAAV2/6.2エンコーディングホタルルシフェラーゼ（fLuc）（3×10 10 GC /胎児）ニワトリβ-アクチン（CBA）プロモーターの制御下にE18で胎児のNMRIマウスにおけるIT（n = 8）またはIA（N = 6）を注入した。帝王切開後·育成、生き残った仔は非侵襲的な生物発光イメージング（BLI）によるフォローアップと生後1週（図5）でfLuc活動（光子/秒、P / S）をモニターした。 ITグループの総光子束は、IA群と陰性対照に比べて有意に高かった（分散分析、スチューデントのt検定を使用して、各ペアごとの比較は、* p <0.05）。 IA群における平均BLIの信号は、陰性対照群に比べて有意に高くはなかった。

正解と不胎児の気管内注入との違い

正しいとincorrectI.Tの区別。注射はいくつかのレベルで評価することができる。手術の時点で、胎児の気管内への注入時に、全く抵抗は気付かなくなるのはいつかneedleは、気管内に配置されている。気管空間に注入した場合しかし、より高い耐性が注目される。胎児は半透明であるとして第二に、帝王切開で、それは肺、その後可視染料（ 例えば中国のインク、蛍光分子）の存在を見ることが可能です。正しい注射を評価するための最後のオプションは、光学イメージング、より具体的には生物発光イメージングによるものである。 BLIのは、非侵襲的にレポーター遺伝子のホタルルシフェラーゼ遺伝子発現をフォローアップすることではなく、空間分解能と解剖学的情報が限られているエレガントなシステムです。磁気共鳴画像法（MRI）は、高解像度、詳細な解剖学的情報を含む断層画像を提供しています。したがって、私たちはより深い解剖学的構造（内臓）の可視化と表面のBLI信号を合成オーバーレイ画像を取得するためにMRIとBLIの組み合わせを検討した。私たちの目的は、地元の生体情報に 、より詳細な得ることであった間違って注射から正しいと区別できるようにするには、遺伝子発現の化。

組み合わせBL-MR画像は、生後1週間（ 図6）でrAAV2/6.2 CBA-fLucとCBA-LacZnls（3×10各ベクトルは、n = 10のGC /胎児）でそれを注入し、いくつかの動物で得られた。 BLのイメージングは​​、首や胸部領域から発せられる信号を明らかにした。 BLIとMRIの共同登録正しい注入（ 図6）に続く肺領域でのルシフェラーゼ遺伝子発現の場所に位置しますが、誤った注射（ 図6 b）の後に首と腹部インチX-gal染色による組織学的分析は 、in vivoでの共同登録で確認した。

気管内および羊水注入後の生存

  1. 蛍光粒子
    E18古いのNMRI胎児の分娩までの生存は、30μlの100 nmの赤色fluorescenとITとIAを注入トン分子は両群で100％であったし、収穫時に注入された生きている胎児の数として定義された、胎児外科手術（ 表1）24時間後。
  2. rAAVベクター
    胎児の配信に生存率はそれぞれ85.3パーセントと86.3パーセント、（ 表1）であった、帝王切開36時間後の胎児注射の時点で生きている胎児の数として定義されrAAV2/6.2とITまたはIAを注入した。早期新生児の生存率は、それぞれ53.3％（IT）と74.5パーセント（IA）で、注入された胎児の初期数と育成1日後生存仔の数の相関をとることにより算出した。これらの最終的な生存率を得るために、我々は（1）吸入代わりにケタミン（75 mg / kgのIP）およびメデトミジンの混合物の投与の麻酔としてイソフルラン（1 mg / kgのIP）を使用して手術周術期の手順プロトコルを最適化し手術中に低体温症を防ぐために、（2）加熱パッド、（3）立体ズーム顕微鏡、（4）事業者は、外科手術でより多くの経験豊富な取得。

figure-protocol-1
図1。 E18胎児マウスにおける気管内注入は、この図では、胎児のIT注入のための外科手術の主な手順が示されている。最初のステップでは、1つの子宮角を体外にされています。次のステップでは、巾着縫合を子宮壁とそれ以降の胎児の頭の上を介して公開される領域にわたって胎児膜（羊膜と頭頂卵黄嚢）を介して渡されます。次に、胎児の頭と首は、胎児の頭が顎の間に2つの鉗子で5から0ポリグラクチン910縫合により過伸展に保持されている後に、子宮切開を介して体外にされています。立体ズーム顕微鏡下（×倍率）胎児の気管は縦首incisを行うことによって可視化されるシャープと鈍的切開を用いたイオン。最後のステップでは、物質の30μlの全容積は立体ズーム顕微鏡を通して直視下気管内に注入される。

figure-protocol-2
図2。実験の概要。

figure-protocol-3
図3。赤fluospheresの気管内注入のための最適な体積の求め方。ITの最適な使用量を決定するために注射、10、20または30μL（N = 3/volume）は100 nmがE18の古い胎児に投与し、肺が24時間を収穫したサイズを決定後で。核とアクチンフィラメントがそれぞれヘキスト33258およびAlexa Fluor 488ファロイジンで染色した。相対蛍光（fluosphを表す青色の蛍光を赤色の比率それぞれERESと核染色）はImageJのオンラインソフトウェアを用いて定量した。平均±SD、分散分析、スチューデントのt検定を使用して、各ペアごとの比較は、* p <0.05、*** P <0.001。

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図4。 （a）それか、（b）は E18の妊娠NMRIマウスにおけるIA注入がターゲティングの効率を比較した後、 胃腸管に肺組織および生体内分布におけるfluospheresの定量的評価。赤fluospheres30μlをマウス胎児肺に送達された胎児マウス肺。未処理の対照胎児は蛍光バックグラウンド信号の正規化のために使用された。核とアクチンフィラメントはそれぞれ、ヘキスト33258およびAlexa Fluor 488ファロイジンで染色した。fluospを表す青色蛍光に赤の（c）の相対蛍光（比それぞれ相続人と核染色）はImageJのオンラインソフトウェアを用いて定量した。（d）は 、胃腸管は、ITおよびIA注射した動物の両方に陽性であった。平均±SD、分散分析、スチューデントのt検定、*** P <0.001。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

figure-protocol-5
図5。総光子束の対応定量化とrAAV2/6.2の注射後1週間（3×10 10 GC /胎児CBA-fLuc）で胎児の肺におけるrAAV2/6.2媒介遺伝子送達後に気管内および羊水注入。BLIの信号の比較 。全ての動物は、隣接する動物に光子の散乱を避けるために、黒のパーティションで区切られ、スキャンされた。擬似カラースケールは毎秒光子束を描いている、ステラジアン（P / S / cmの2 / SR）の1平方センチメートル当たり。測定は、関心の4.3 cm 2の矩形領域で得られた。平均±SD、分散分析、スチューデントのt検定を使用して、各ペアごとの比較は、* p <0.05。 Carlon ら 、2010年から適応図。 [分子療法]（DOI：10.1038/mt.2010.153）Macmillan Publishers Ltdのから許可を得て転載しています。、著作権（2010） 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

figure-protocol-6
図6。胎児肺におけるrAAV2/6.2媒介遺伝子送達後に正解と不胎児の気管内注入の区別が。rAAV2/6.2 CBA-fLucとCBA-LacZnls（3×10でITを注入されたBL-MR画像は、いくつかの動物に買収された組み合わせのGC /各vecto用胎児r）は生後1週間で。 BLのイメージングは​​、首や胸部領域から発せられる信号を明らかにした。 BLIの位置ルシフェラーゼ遺伝子の正しい注射（）に続いて肺領域での表現が、 ​​誤った注射（b）の後に首と腹部インチとMRIの共同登録組織学的分析は、in vivoでの共同登録で確認した。スケールバー=100μmである。 Carlon ら 、2010から適合図。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

注入物質 注入法 納品まで生存 bを育成の生存率 早期新生児生存率C
fluospheres IT 100（8月8日） NA NA
アイオワ 100（5/5） NA NA
rAAV2/6.2 IT 85,3（64/75） 62,5 53,3（40/75）
アイオワ 86,3（44/51） 86,4 74,5（38/51）

表1。胎児の気管内および羊水注入後の生存。育成前に胎児手術の後、帝王切開の IE納品まで生存、、彼らはピンクだった場合 、aはb の子犬のみを育てた、移動、正常に呼吸します c早期新生児生存率が発現している注入された仔の初期数の関数として。略語：ITの気管内注入、アイオワイントラ羊水注入、NAは適用されません。

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ディスカッション

重要なステップ

  • 彼らは子犬の豊富な数（平均産仔数14.4±1.8、独自のデータ）を持っているので、我々が利用することを選んだマウス系統はNMRIマウスであり、よく介入を容認し、良い母親の特性を持っています。
  • あなただけそうしないと再配置、胎児の頭ではなく肩を公開するように子宮壁と胎児膜を通して巾着を置くことは重要なステップであるトラウマを引き起こすことなく、ほとんど不可能である。
  • あなたは気管と平行に走っている大きな血管を（頸静脈）を避けるように、後方に伸ばして胎児の頭の最適な位置が正確に気管の上の切開を行うことが不可欠である。
  • 視覚的に誤った注射を避けるために、手術用顕微鏡下に胎児の気管内に針の挿入に従うことが重要です。
  • 外傷を引き起こすことなく、子宮嚢に胎児の頭を交換すると、あなたのように非常に重要です子宮内や出生後の死亡率を増加させるでしょう胎児の頭部を負傷しないようにしたい。
  • これは否定的に胎児の生存に影響を与えると同じように母はなく、初期のCO 2窒息で、唯一の帝王切開の時点で頸椎脱臼により殺される。...

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開示事項

特別な利害関係は宣言されません。

謝辞

MCとAVDPフランダースの科学技術によるイノベーションの促進のための研究所からの助成金（IWT-ブラーンデレン）でサポートされているポスドクです。 JTはUZルーベンから非常勤の臨床研究フェローシップ（KOOR）を保持します。 DVはKUルーベン、DBOF/10/062からの助成金によって支え博士研究員である。 MMDCはConselhoナシオナルデPesquisa電子Desenvolvimento（CNPq）とエラスムス·ムンドゥスからの助成金によって支え博士研究員である。研究助成金は、EC DIMI（LSHB-CT-2005から512146）によっておよびKUルーベンから in vivo分子イメージング研究グループ（IMIR） によって In、IWT-ブラーンデレンによって賄われていた。我々はrAAVベクター生産用プラスミドAAV6.2包装の彼らの親切なギフト用ジェームズM.ウィルソンによって設立UPennベクトルコアを承認したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名称 会社 カタログ番号 コメント（オプション）
NMRIマウス Janvier、ルGenestセント島、フランス
イソフルレン Isoba、インターベット/シェリング·プラウアニマルヘルス、ミルトンケインズ、イギリス
プロレン6から0 エチコン、グルートベイガールデン、ベルギー
ビクリル5から0 エチコン、グルートベイガールデン、ベルギー
50μlのハミルトンガラスシリンジ、モデル1710.5 TLLX SYR ハミルトン、リノ、ネバダ州、アメリカ合衆国 5495から20
30G鋭い針ハミルトン、リノ、ネバダ州、アメリカ合衆国 7762から03
2パーセントキシロカインアストラゼネカ、ズーテルメール、オランダ

参考文献

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