と呼ばれる手法 C omprehensive M icroarray P olymerプロファイリング（CoMPP）について説明する。この方法は、生物学的な文脈の広い範囲で発生したグリカンのスクリーニングを可能にする小型のマイクロアレイ分析プラットフォームで定義された糖鎖エピトープに対するモノクローナル抗体の特異性を兼ね備えています。
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この記事について
サマリー
要約
植物の細胞壁は、植物の生理と発展に重要な役割を果たしており、人間社会のために原材料を提供異種糖鎖の複雑なマトリックス（ 例えば、木材、紙、繊維、バイオ燃料産業）1,2です。しかし、これらの成分の生合成と機能を理解することは困難なままである。
細胞壁糖鎖は、化学とその構築ブロック、グリコシル残基の複雑さに起因するコンフォメーションが多様である。これらのフォームの複数の位置に結合およびリング構造が異なり、異性体またはアノマー配置されているだけでなく、無糖残基の配列で置換されている。グリカンの組成物は、単一細胞壁3の異なる細胞および/ または組織型あるいはサブドメインに変化する。さらに、それらの組成物はまた、開発1時、または環境手がかり4に対応して変更されます。
EXで2000遺伝子の目的税は、植物の細胞壁は、異種の糖鎖の複雑なマトリックスシロイヌナズナ 5で細胞壁糖鎖の生合成と修飾に関与することが予測された多数持っています。しかし、生合成遺伝子の比較的少ないが、機能的に4,5特徴付けられてきた。遺伝子はしばしば差別的細胞型6の間に、多くの場合、低レベルで発現しているので、逆遺伝学的ア プローチが困難である。また、変異体の研究は、多くの場合、適切な細胞壁機能は7に維持されていることを確認するために、遺伝子の冗長性または代償機構によって妨げられている。したがって、新たなアプローチが急速に糖鎖構造の多様な範囲を特徴づけるために理解と細胞壁の生合成と修飾に機能ゲノミクスアプローチを容易にするために必要とされる。
モノクローナル抗体（mAb）8,9は、植物の糖鎖構造と分布を決定するための重要なツールとして浮上している。これらは、dist認識ペクチン、キシログルカン、キシラン、マンナン、グルカンやアラビノガラクタンを含む植物細胞壁糖鎖の主要なクラス内に存在INCTエピトープ。最近、それらの使用は植物や組織の種類を同時に9,10,11の広い範囲で糖鎖の相対量を決定するために、大規模なスクリーニング実験にも拡張されました。
ここでは、複数のサンプル（100秒）が減少した試薬及びサンプル量で小型化されたマイクロアレイプラットフォームを用いてスクリーニングすることができる包括的なマイクロアレイポリマープロファイリング（CoMPP）（ 図1および2）10,11と呼ばれるマイクロアレイベースグリカンスクリーニング法を提案する。マイクロアレイ上のスポット信号は正式に糖鎖エピトープの発生に関する半定量的データを与えるために定量することができる。このアプローチは、複雑な生物システム12の糖鎖変化を追跡し、細胞壁組成のグローバルな概観を提供することに適している場合は特に事前知識Ofはこれができません。
プロトコル
1。組織収集＆準備
- 関心のある各組織には、少なくとも三重に植物組織100 mgの生体重（10 mgの乾燥重量の最小値）を収集します。次の手順では、植物組織からの細胞壁物質の調製を記載している。貯蔵組織の場合には、非指名澱粉を酵素的に前述の13のような細胞壁ポリマーの抽出を続行する前に削除されます。
- 24チューブアダプタセットと3 mmのタングステンカーバイドビーズ（30ヘルツ、2×30秒）で、キアゲンTissueLyserをIIを用いて液体窒素で微粉末にサンプルをホモジナイズする。唯一のいくつかのサンプルが処理されている場合、あるいは、乳鉢と乳棒を使用しています。
- 10ミリリットルプラスチックのコニカルチューブにホモジネートを転送します。
- 室温で10ミリリットル80パーセントv / vエタノールでホモジネートを洗浄し、2分間激しくボルテックスすることによって細胞壁材料を準備します。
- 3500 xgでサンプルを遠心分離し、上清を捨てる。上澄みが透明になるまで70％エタノールが特にクロロフィルを含む組織のために、または少なくとも3回洗いを繰り返します。
- 100％アセトンで最終洗浄を行い、一晩空気乾燥する際には、アルコール性残留物（AIR）を含有するペレットを残す。
- ふるい0.4ミリメートル2メッシュを使用したAIRサンプルは罰金、均質な粉末を達成し、いつかホモジネートに残るほど、貧弱グラウンド粒子を除去する。
- マイクロチューブ、サンプルの混合を助けるために3ミリメートルのガラスビーズを含んだそれぞれに10mgのAIRサンプルを計量する。
2。細胞壁糖鎖の抽出
- ペクチン、およびペクチンに関連付けられたポリマーは、各試料に50μMのCDTA液（pH7.5）500μlを加えてサンプルから抽出されます。
- 簡潔にボルテックスチューブは溶媒が試料物質と接触していることを確認してから、8 Hzで3時間TissueLyserを用いて混合します。
- 慎重に、12,000 xgでサンプルを遠心R4℃で上清と店を残したまま削除
- 13000×gで残っている溶剤、ボルテックス、遠心を薄めて除去するために脱イオン水1ml中のペレットを洗浄します。ペレットを乱さずに、この手順を繰り返して、次のステップに進む前に、チューブから液体をすべて削除します。
- CDTA抽出のために2.4 - 架橋結合型糖鎖を順次ステップ2.1で説明したのと同じ手順を使用して、0.1％（w / v）の水素化ホウ素ナトリウムと4M NaOHを500μlの残りの細胞壁ペレットから抽出されます。 NaBH 4をそれによって多糖類の剥離を防止するベースアルコールに多糖類の還元末端にアルデヒド基（またはケト基）を低減するために追加されます。
- 遠心分離後、上清を再び除去され、4℃で保存し、ペレットは、次の抽出に進む前に、脱イオン水で2回洗浄した。
- オプションの手順として、セルロースなどの残留性ポリマーは、500μlのcadoxen（31％v / vの1,2 - diamiで抽出する2.4 - 手順2.1で説明したのと同じ手順を使用して、0.78 MのCDOとnoethane）。代わりに、残りのペレットで絶対セルロース含有量は、酢酸/硝酸アッセイ（説明を参照してください）を使用して決定することができます。
3。印刷マイクロアレイ
- 任意の粒子状物質を除去するためにxgの13000で抽出された細胞壁ポリマーを含有する上清を遠心分離します。
- ウェルポリプロピレン384サンプルは、組織の種類と抽出の種類に応じて配置され、あらかじめデザインされたカスタムレイアウトを使用したマイクロタイタープレートに各サンプル50μlをロードします。
- 脱イオン水で0,5、および25×シリアル希釈系列の細胞壁ポリマー試料を希釈します。
- そのようなピンの高さなどのパラメータは、収集および滞留時間、および洗浄工程は、マイクロアレイを制御するソフトウェアで設定されます。
- 印刷室の湿度は、サンプルの蒸発を防ぐために60％に制御されます。
- 印刷ジョブがLabNEXTソフト制を使用して開始されreとマイクロアレイのレイアウトに対応したプログラム。
- ロボットは機械で平板に取り付けられた20×20cmのニトロセルロース膜上にサンプルプレートから溶液をプリントする毛管チャネルピンを使用しています。アレイ上の各スポットは、溶液15 NLが含まれており、三重に印刷されています。
- 印刷ジョブが完了した後、同一のマイクロアレイは、個々の配列への膜とカットで隣同士に印刷されます。
- 各実験において、配列は多かれ少なかれサンプル、希釈または複製に対応するために修正することができます。
4。糖鎖マイクロアレイのプロービング
- 印刷後、非特異的結合を低減するために2時間、室温で生理食塩水（MPBS）をリン酸緩衝に溶解し5％w / vの脱脂粉乳で個々のマイクロアレイをブロック。
- MPBSで2時間の細胞壁糖鎖エピトープに特異的なモノクローナル抗体を用いたプローブのマイクロアレイ。モノクローナルantibの過半数細胞壁糖鎖に対するodiesは、次の3つの会社から市販されており、Biosupplies（ www.biosupplies.com.au ）、Carbosourceサービス（ www.carbosource.net ）とPlantProbes（ www.plantprobes.net ）。
- ネガティブコントロール、のみMPBS無一次抗体と共にインキュベートマイクロアレイを含む。
- マイクロアレイのリン酸塩で3回洗浄すると、非特異的な結合を除去するために5分間緩衝生理食塩水（PBS）。
- 2時間MPBSにおける西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に結合させた二次抗体を用いてマイクロアレイを探る。細胞壁糖鎖に対する最もモノクローナル抗体は抗マウスまたは抗ラット二次抗体を必要とします。
- 非特異的結合を除去するために5分間3回PBS緩衝液での洗浄手順を繰り返します。
- 発色（3,3 - ジアミノベンジジン）またはchemilを使用してマイクロアレイを開発uminecent（ルミノール）基板。
5。定量化
- 現像後、高解像度（1,200 dpiの）デスクトップスキャナを使用して、個々のマイクロアレイをスキャンして、負の、16ビットのTIFFファイル（ 図3）のように画像を保存します。
- 自動グリッドツールを搭載画像処理ソフトウェア（LabNEXT）Xplore使用して、各スポットの積分強度を計算します。インテグラルスポット強度は、各スポットを囲むグリッド領域内のピクセルの合計から導出されます。
- 各マイクロアレイのグリッドデータをtxtファイルとしてエクスポートされ、手動で解析するためのExcelスプレッドシートにインポートすることができます。オンラインツール（ http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/は ）自動的に翻訳して、個々のtxtファイルからのデータを処理するために開発されました。
- インテグラルスポット強度は '平均スポットを得るために、印刷複製し、希釈液で平均化されている各サンプルの強度"の値（ 図2）。代わりに、アレイ上のちょうど1希釈値に対応するスポット信号は、各サンプルの相対的な糖鎖エピトープの存在量を定量化するために使用されています。
- 異なるサンプル間の相対的な平均スポット強度は、Excelまたはオンラインヒートマッパーツール（で条件付き書式を使用してヒートマップ（ 図4）として提示されているhttp://bar.utoronto.ca/welcome.htm ）。各抗体の種類のデータを100に修正され、5％のカットオフ値は、バックグラウンド信号と誤検出を除去するために課せられています。
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結果
ニコチアナダイジョの花から6種類の組織における糖鎖の相対的な存在量（葯フィラメント、花粉、卵巣、花弁、萼片と偏見）がCoMPPを用いて決定した。図3Aは、部分的に（低）メチルエステル化homogalacturonan（HG）、ペクチン多糖類14日に発生したエピトープに対して特異的mAb JIM5でプロービングされた代表的なマイクロアレイを示しています。 JIM5エピトープは、しかし、柱頭組織中の花粉や最下位（ 図3Aおよび4A）で最も高く、すべての花の組織のCDTA抽出物中に検出されます。興味深いことに、JIM5エピトープはまた、花粉ではなく、他の組織中のNaOH抽出物（ 図3A）で検出される。
興味のある糖鎖の発生に関する定量的な情報は、マイクロアレイ上の内部標準（ 図3B）として精製された多糖類のシリーズを含むことによって得られる。異なるトンの抽出物の積分スポット強度 mAbのJIM5でプロービングの問題がhomogalac...
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ディスカッション
CoMPPは、数日のうちに何百もの植物由来のサンプルの糖組成をプロファイリングするための迅速かつ高感度な方法である。この方法は、レクチン、受容体、抗体16と糖結合タンパク質と糖の相互作用のハイスループットスクリーニングのためにすでに利用可能な細菌または哺乳動物糖鎖アレイ·プラットフォームを補完します。細胞壁糖鎖を検出するための利用可能なプローブの大きな多様性と、それは植物の細胞壁8,9の多糖類のすべての主要なクラスに属するグリカンエピトープに関する詳細な情報を得ることが可能である。しかし、これらは8,9確認されている糖鎖構造のわずかな割合を包含し、いくつかの事情でCoMPPのわかりやすさを制限します。それにもかかわらず、この機能は最近植物グリカン17に対して、また、非グリコシル解像度によって特徴付けエピトープに対する糖結合モジュールの使用（CBMS）によって拡張されましたそのようなグリコシル残基を変更し、糖鎖機能に重要な役割を果たしているフェノール類18とアセチル残19としてidues。
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
IEMは資金調達のためにデンマークの研究評議会（FTPとFNU）を承認したいと思います。 ERLは、ARCのDP助成金の支援を認めている。 ABは、植物の細胞壁の助成金で優秀のARCセンターの支援を認めている。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名称 | 会社 | カタログ番号 | コメント（オプション） |
| 3 mmのタングステンカーバイドビーズ | キアゲン | 69997 | |
| コレクション·マイクロチューブ（1.2ミリメートル） | キアゲン | 19560 | 1.5 mlのマイクロチューブを使用することもできます |
| キアゲンTissueLyserを世 | キアゲン | 85300 | |
| 3ミリのガラスビーズ | シグマアルドリッチ | Z143928 | |
| CDTA | シグマアルドリッチ | 34588 | |
| 酸化カドミウム | シグマアルドリッチ | 202894 | |
| 1,2 - ジアミノエタン | シグマアルドリッチ | 03550 | |
| ニトロセルロース膜（孔径0.22μmのサイズ） | GEウォーター＆プロセス·テクノロジー | EP2HY00010 | 異なる大きさの細孔膜は異なるピンタイプに適しています |
| XACT IIマイクロアレイロボット | Labnext | 001A | トランザクション配信IIのロボットは、ニトロセルロース膜が添付されているカスタム20×20センチメートルセラミックプレートが取り付けられていた |
| RMのマイクロアレイ上のアイコンをXTEND | Labnext | 0037-350 | ピンは、膜上スポッティングに適していなければならない |
| 384ウェルマイクロタイタープレート（ポリプロピレン） | グライナー | 781207 | |
| 抗糖鎖モノクローナル抗体 | 植物プローブ/ CarboSource / Biosupplies | ウェブサイト; PlantProbes（ www.plantprobes.net ）、Carbosource（ww.carbosource.net "ターゲット=" _blank "> www.carbosource.net）とBiosupplies（ www.biosupplies.com.au ）。 | |
| 抗ラットIgG（全分子） - ヤギで産ペルオキシダーゼ抗体。 | シグマ | A9037 | 二次抗体の種類（ 例えば 、ラット、マウス、ヤギなどで提起された）を使用し、一次抗体に依存します。 |
| SIGMA FAST 3,3 ' -ジアミノベンジジン錠 | シグマ | D4293 | 試薬の開発のタイプは、使用される二次抗体および検出方法（colourmetric、またはchemiluminecent）に依存します。 |
| SuperSignalウェスト·ピコ化学発光基質 | Thermoscientific | 34080 | 上記を参照 |
| 画像処理ソフトXplore | LabNext | 008 | 自動グリッド化ツールを使用して、多くのソフトウェアの種類がありますマイクロアレイのスポットの画素値を測定します。 |
| 植物性多糖類 | シグマ/ Megazyme |
参考文献
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