Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

サマリー

アデノウイルス粒子は、非天然アミノ酸類似体azidohomoalanineまたはアジド糖のいずれかを含むように設計されています O-GlcNAz。それぞれのアジド基は、化学選択的にウイルスの表面改質の手段として "クリック"化学反応を介して連結されています。

要約

ウイルス粒子の修飾は、遺伝子治療、腫瘍溶解性アプリケーションやワクチン開発に影響を与えるために、その途方もない可能性のために注目かなりの量のを受けています。主に遺伝学ベースでウイルスの表面を、変更することに^1,2,3現在のアプローチは、しばしば減衰に苦しむウイルス産生の、感染性と細胞の情報伝達^。4,5化学選択クリックケミストリーを使用して、我々は、柔軟性の高いアクセスの両方を維持しながら、これらの問題を回避し簡単な代替アプローチを開発しました^。1,2

このプロトコルの目的は、アデノウイルス5型粒子の表面を変更するbioorthogonalクリックケミストリーを用いての有効性を実証することである。それは、タンパク質に標的分子、染料または関心のある他の分子の化学選択的ライゲーションすることができ、この2段階のプロセスは、両方の治療¹または分析的に^、2,6を使用することができますアジタグで事前標識。このメソッドの3つの主要な利点は、（1）代謝標識は、ウイルスフィットネスに影響を及ぼすことなく^、1,7に少し例を示していること、（2）エフェクターリガンドの広い配列を利用することができる、（3）それが著しく、高速で信頼性の高いです。アクセスしやすい^。1,2,7

この手順の最初のステップでは、アデノウイルス粒子がazidohomoalanine（AHA、メチオニンサロゲート）や不自然な糖アジド（-N _3）の機能が含まれ、どちらもO-結合N-azidoacetylglucosamine（O-GlcNAz）、のいずれかをベアリング製造されグループ。アジドで修飾されたウイルス粒子の精製後、蛍光TAMRA部分を含むアルキンプローブは、あらかじめ標識したタンパク質または糖タンパク質の化学選択的な方法で連結されています。最後に、SDS-PAGE分析は、ウイルスキャプシドタンパク質上のプローブのライゲーション成功を実証するために実行されます。 AHAの取り込みは、すべてのウイルスキャプシドにラベルを付けることが示されているタンパク質（ヘキソン、ペントンおよび光ファイバ）、唯一の繊維の標識O-GlcNAz取り込み結果中。

この進化分野では、アジド - アルキンライゲーションのために複数のメソッドが正常に開発されてきた。しかし、我々は最も便利であることが判明した2つだけがここに実証されて - ひずみ昇格アジド - アルキン環（SPAAC）と銅触媒によるアジド - アルキン環（CuAAC）脱酸素雰囲気下で。

プロトコル

このプロトコルで参照されるすべてのメディア、バッファーおよび溶液の調製については、 表1を参照してください。

1。 AHA-標識されたアデノウイルスの生産

1. コンフルエント90％ -彼らが80に達するまで37℃でHEK 293細胞増殖培地中で維持したヒト胚腎細胞（HEK 293）（ 表1参照）の11を100mm組織培養皿を準備します。 （注：90％以上のコンフルエントと文化に感染するのが難しいかもしれませんし、必要に応じて、ウイルスを生成しない場合があります。）
2. まずトリプシン-EDTA（1×）1 mlの1分間細胞をインキュベートし、TDの緩衝液5mlで一回洗浄し、増殖培地を除去することによって料理の一つで、細胞を緩めます。
3. HEK 293細胞増殖培地9mlを追加し、この皿から採取したHEK 293細胞の数をカウントする血球を使用しています。 multiplicitを使用して感染するために必要なアデノウイルス5型（Ad5）の量を計算するためにこの番号を使用して感染症のy（MOI）10 PFU /セルの値。通常のAd5のために、感染指数が（粒子の総数に対する感染性粒子の割合）は、通常午前1時20分であるという事実を占めています。
4. 感染緩衝液10mlを準備します。
5. 徐々にTDバッファー5 mlで洗浄し、残りの10培養皿からHEK 293細胞増殖培地を除去します。 1時間37℃で各皿とインキュベートする感染緩衝液1mlを追加します。この感染期間中に、静かに15分間隔で側に各培養皿側を揺さぶる。
6. 感染後、18時間37℃で新鮮なHEK 293細胞増殖培地とインキュベート9ミリリットルを追加します。
7. アハ標識媒体（または制御のための制御媒体をMET）の100ミリリットルを用意します。ラベリングメディアを準備する前に0.2μmの滅菌シリンジフィルターで濃縮ストック溶液をフィルタリングするようにしてください。
8. 慎重に（ように感染した細胞を洗い流すしないように）18時間後にHEK 293細胞増殖培地を除去ndはTDバッファー5 mlでそれぞれ培養皿を洗う。
9. TDバッファの洗浄溶液を除去し、各培養皿にアハ標識培地10mlを追加します。コントロールでは、メチオニン対照の培地はこの段階でアハ標識培地の代わりに使用する必要があります。
10. 6時間37℃で培地をラベルに感染した細胞をインキュベートします。標識は、12の間にいつでも実施することができます - 24時間後に感染が持続時間が6時間を超えるべきではありません。確実に感染性は大幅に減少されていない間にこの間隔は、ウイルスの構造タンパク質の翻訳との重なりを最大化するために決定されている^7。
11. ように細胞を破壊しないように慎重に標識メディウムを削除します。各皿に新鮮なHEK 293細胞増殖培地10mlを加え、さらに18時間37℃で細胞をインキュベートします。このステップの間に感染した細胞の損失を最小限に抑えるために、それは完全にラベリングソリューションを削除する必要はありません。 HEK 293細胞増殖培地は、Mの過剰が含まれていますらこれは、任意の残留アハをoutcompeteます。
12. 精製のために、手順3に進みます。

2。アジド糖標識アデノウイルスの生産

1. まで、ステップ1.5を含むAHA-標識されたアデノウイルスの生産と題し、次の手順に従います。
2. アジド糖の標識培地100mlを準備します。
3. 44時間37℃で新鮮なアジド糖の標識培地とインキュベートし、10 mlの細胞をカバーしています。

3。アジド標識アデノウイルス粒子の精製

1. 各培養皿とコニカルチューブへの転送から感染した細胞と一緒にメディアを取り出します。 4℃で10分間2,000 gで遠心分離℃、上清を除去し、TDバッファ内のペレット（10皿ごとにTDバッファの8ミリリットルを使用して）再懸濁します。
2. 液体窒素と37℃の水浴中のデュワーフラスコを使用して、繰り返し（3以上）の凍結融解による感染細胞を溶解する。 10分間、2,000 gで遠心分離4℃で上清から細胞残渣を分離する。
3. 初の超クリア遠心管に1.25グラム/ mlの塩化セシウム溶液を2.5 mlをピペットで塩化セシウム密度勾配遠心分離管を準備します。次に、グラデーションのインターフェースを妨げないように注意しながら、徐々に1.4グラム/ mlの塩化セシウム溶液の2.0 mlを追加するには、チューブの底に位置し、その先端にピペットを使用しています。
4. CsCl密度勾配管の上に、ステップ3.2から上清をピペット、チューブを埋めるために必要な追加のTDバッファます。 15で1時間125000グラムでスイングバケットローター°C超遠心機でサンプルを遠心します。
5. 遠心終了後、ウイル​​ス粒子は、2つのCsClソリューションの界面で太い白帯として表示する必要があります。ソリューションは、滴下ドレインできるようにするために滅菌針を用いてチューブの底に小さな穿孔を行います。
6. ターキン、標識されたAd5の粒子を含むべきである、太い白帯を収集gのケアは、過剰な塩化セシウム溶液を除外することができます。ウイルスの層の上に帯域が細胞タンパク質を収集することは避けてください。さらにやや厚めの白いウイルスのバンド上に軽い層を形成する空のビリオンのキャプシドを除外します。
7. 必要に応じて、標識されたAd5の粒子の最終的な精製を行います。ステップ3.6から4 mlの遠心チューブにフラクションを追加し、1.35グラム/ mlの塩化セシウム溶液を用いてチューブを記入してください。 15°Cで18時間125000グラムで遠心分離し、手順3.5と3.6で説明したように、チューブの途中に形成して太い白帯を収集します。 （ウイルス力価が低い場合には、ホワイトバンド秒遠心分離した後表示されない場合があり、それはラベルの付いたウイルスを回収することはできませんので注意してください）​​。
8. 長期間にわたってウイルス粒子の貯蔵については、収集されたウイルスの抽出物の透析は、ウイルス·ストレージ·バッファに対して実行する必要があります。 -80℃で透析したウイルスのサンプルを保存

4。リーひずみ推進アジド - アルキン環化を用いたアルキンプローブを用いた修飾アデノ​​ウイルス粒子のgation（SPAAC）

1. ウイルス·ストレージ·バッファ内のアジドで修飾されたAd5の50μlの溶液に、SPAACラベリングソリューション0.25μlを追加します。 （市販の緊張したアルキンのベンダーのリストについては、試薬の表を参照してください）​​。
2. 室温で一晩続行するひずみ昇格の付加環化反応を可能にします。光感受性プローブ（ 例えば、TAMRA）が使用されている場合は、アルミ箔との反応容器をカバーしています。
3. 手順6に従ってラベルウイルスを精製する。

5。脱酸素雰囲気中で銅（I）触媒によるアジド - アルキン環（CuAAC）を使用したアルキンプローブを用いた修飾アデノ​​ウイルス粒子のライゲーション

1. 銅の代わりに7.2ミリグラム（I）エッペンドルフチュー​​ブ中の臭化物（CuBr）粉末は、アルミ箔で覆われている。
2. 第二のエッペンドルフチュー​​ブにDMSOのピペット1ミリリットル。
3. 準備する第三エッペンドルフチュー​​ブにCuAACラベリング溶液50μl。アルキンプローブ（ 例えば、TAMRA-アルキン）光に敏感であればアルミホイルでカバーしています。
4. 6時間脱グローブバッグに3つのエッペンドルフチュー​​ブ、非キャップを配置します。すべてのサンプルはCuAAC反応が完了するまでグローブバッグの内部に維持する必要があります。
5. 5.4ステップに従って脱酸素化されていますが、どちらもCuBr粉末7.2 mgのDMSO 1 mlを追加することにより、CuBrの50×ストック溶液を準備します。
6. 5.4ステップに従って脱酸素化されていますCuAACラベリング溶液の50μlにこのCuBrストック溶液1μlをピペットでCuAAC反応を開始します。反応は、グローブバッグ内に12時間続行することができます。
7. 手順6に従ってラベルウイルスを精製する。

6。標識されたウイルス粒子の精製とストレージ

1. 遠心〜9月ゲルろ過スピンcを用いて標識ウイルスのサンプルを浄化する製造元のガイドラインに従って、ウイルス記憶バッファーで平衡化しolumns、。
2. また、精製はウイルス記憶バッファーに対して透析することにより行うことができる。
3. 標識されたウイルス粒子は、-80℃で保存してください。

7。標識されたアデノウイルス＆蛍光ゲルのスキャンのSDS-PAGE

1. 10分間標識したウイルスや沸騰の精製20μlに20μlのLaemmliサンプルバッファー（2×）を追加します。沈殿物、不溶性を削除する30秒のサンプルを遠心分離します。残留銅が精製した後に存在する場合、サンプルを煮沸すると、可視化の際に問題を引き起こして、SDS-PAGEゲル上のタンパク質の太い縞になることがあります。このケースでは、この手順でサンプルの沸点を差し控える。
2. 電気泳動セルにゲルカセットを取り付け、ランニングバッファーを追加します。ウイルスのタンパク質サンプルをウェルに必要な数をロードします。前のSTAIをロードする1つのウェルを使用して、NED分子量マーカー。 200℃で1時間のゲルを実行します。V.フルオロフォア標識の退色を低減するために全体の期間中にアルミ箔で覆われた電気泳動セルを保管してください。
3. 最高の解像度と、すべての自由なフルオロフォアを削除するには、トラッキング色素が電気泳動中にゲルが不足することができます。電気泳動を停止し、すぐに蛍光ゲルスキャナーにゲルを転送し、適切な波長（TAMRAのために574 nm）における蛍光発光のためにゲルをスキャンします。
4. それぞれのウイルス粒子に結合した色素分子の数はいくつかの標準TAMRA濃度の蛍光を測定し、ステップ7.3からのサンプルと比較することにより定​​量することができる。

8。代表的な結果

SDS-PAGE＆TAMRA標識Ad5の蛍光ゲルのスキャンの観測結果を図3に示されています。これらの蛍光ゲルのスキャンは、サンプルMODIを行ったが、プローブはSPAACを介して連結されている場合CuAAC経由でfied、結果は同等でなければなりません。砂糖のラベルのみをファイバーカプシドタンパク質を変更しながら、これらのゲルのスキャンは、3 Ad5のキャプシドタンパク質（ヘキソン、ペントン、および光ファイバ）の変更でそのアハラベリング結果を示しています。また、AHAの取り込みの程度が大きいのAHA濃度（4mMの対32 mM）の結果の増加が、それはまた、感染性を減少させることが示されている。前の結果^7は、4mmで生成Ad5のためにああ、露出したメチオニンのサイトの約5％、32 mMのアハが使用されている場合、この数値が10％に増加すると、TAMRA-変更されていることを示しています。これは、それぞれ約280および510、Ad5の粒子あたりの色素で標識した部位に対応しています。砂糖標識¹の分析では、約22 36のグリコシル化部位のAd5の上ではアジド糖によって占有され、その後、TAMRAで標識されていることが示されている。

説明したように10組織培養プレートはAd5のアジド修飾を生成するために使用されている場合このプロトコルは、200に-アジドで修飾されたウイルスの300μlを、約1.5×10 ¹²粒子/ mlの力価では、ステップ3.6で収集されたホワイトバンドから得られるべきである。この手順の一般的な難易度が低いウイルス力価に起因することができ、この精製工程、でのウイルスバンドの不在です。ステップ1ですすぎながら、 - 感染後のプレートからなる緩めている - これは一般的にどちらかの上または下に合流、またはセルを離れて洗浄することにより、ある細胞に感染の結果である。

図1：プロトコルの概要。アジ化ナトリウム含有アハまたはGalNAzは、最初のアデノウイルス粒子に取り込まれます。蛍光アルキンプローブを用いたライゲーションし、 "クリック"化学を介して行われます。最後に、SDS-PAGEは、蛍光プローブのライゲーションを実証するために使用されています。

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脱酸素化、および（c）酸素雰囲気下、（a）にSPAACは、（b）はCuAAC経由して2。アルキンプローブのライゲーションアジドで修飾されたウイルス上図 。

図3。TAMRA-アルキンと共役した後CuAACアジド標識アデノウイルス5型（Ad5）のSDS-PAGEの蛍光をスキャンします。 （1）AHAの2濃度を用いて、Ad5のAHA-標識した。標識は、標識の程度が増加したアハ濃度が増加するとアデノウイルスのヘキソン、ペントンとファイバーキャプシドタンパク質、で発生する表示されます。 （b）はAC ₄ GalNAz標識アデノウイルスは、ファイバーカプシドタンパク質で標識されるように表示されます。

ソリューション	準備	注釈
Ad5のストレージ·バッファ	5mMトリス0.5 mMのMgCl 2、50mMのNaCl、25％（v / v）グリセロール、0.05％（w / v）の（BSA）、ウシ血清アルブミンを含むトリス塩酸緩衝液（pH8.0）	-20℃で保存
Ad5の感染バッファ	2％（v / v）の仔ウシ血清、1×TCソリューションは、ストレージ·バッファ内のAd5の（MOI 10 PFU /セルと1:20の感染指数のを使用して決定ボリューム）。 TDバッファを使用して、最終的なボリュームへの解決策をもたらす	Ad5の濃度は、UV吸収を介して決定されることがあります。
TC溶液（200×）	136 mMのCaCl 2を 、100 mMのMgCl 2	4℃保存
TDバッファ	mMののNa 2 HPO 4、25mMのトリス-HCl、pH7.5の0.07 137 mM塩化ナトリウム、5 mMの塩化カリウム、	4℃保存
HEK 293細胞増殖培地	10％（v / v）の仔ウシ血清（BCS）と1％（v / v）のペン球菌を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）	4℃保存
システインのストック溶液（100倍）	200 mMのL-システインを添加したDMEM（-Metの/-Cys）を	使用前に0.2μmの滅菌シリンジフィルターで新鮮なフィルタ準備します。
AHAストック溶液（25×）	100mMのL-Azidohomoalanineを添加したDMEM（-Metの/-Cys）を	使用前に0.2μmの滅菌シリンジフィルターで新鮮なフィルタ準備します。
なるほど標識培地	10パーセントBCS、AHAのストック溶液（1×）、2 mMのL-システインを添加したDMEM（-Metの/-Cys）を	ご使用の前に新鮮な準備をします。 これは、4mMのcに対応AHAのoncentration、異なる濃度（ 代表の結果を参照）を使用されるかもしれません。
Metのストック溶液（25×）	100mMのL-メチオニンを添加したDMEM（-Metの/-Cys）を	使用前に0.2μmの滅菌シリンジフィルターで新鮮なフィルタ準備します。
会った制御媒体	10パーセントBCS、（1×）ストック溶液を満たし、2mMのL-システインを添加したDMEM（-Metの/-Cys）を	ご使用の前に新鮮な準備をします。
AC 4 GalNAzストック溶液（1000×）	メタノール中の50 mM過アセチルN-azidoacetylgalactosamine（AC 4 GalNAz）	4℃で保管してくださいAC 4 GalNAzはGlcNAzの代謝前駆体である。
アジド糖の標識培地	100μlのAC 4 GalNAzストック溶液を、100ミリリットルHEK 293細胞増殖培地	メタノールは、HEK 293細胞増殖培地を添加する前に蒸発することができます。
塩化セシウム溶液	セシウムは、TD緩衝液に溶解： 1.25グラム/ mlの（18.08グラム/ 50 mlのH 2 O） 1.35グラム/ mlの（25.60グラム/ 50 mlのH 2 O） 1.40グラム/ mlの（31.00グラム/ 50 mlのH 2 O）	超遠心分離用密度勾配
ウイルス格納バッファ	リン酸塩は、0.5mMのCaCl 2を 、0.9 mMのMgCl 2、および10％（v / v）グリセロールを含む、pHが7.2、緩衝生理食塩水（PBS）	-20℃で保存
TAMRA-BCN（SPAAC）ラベリング·ソリューション	DMSO中のTAMRA-BCN： UV abを使用ステップ4.1のウイルス液の力価を決定するためにsorbance（OD 260アッセイ） 50μlのアリコート（N Ad5）の中のウイルス粒子の合計数を決定 TAMRA-BCNのモル濃度は、（M）を使用して決定されます。 C BCN = 4×10 8×（N Ad5の / N アヴォ ） N アヴォ = 6.022×10 23 （ステップ4で調製した反応混合物はビリオン当たり100アルキンプローブを含むように）	ひずみ昇格アルキンプローブ SDS-PAGEのために、約10 12粒子/ mlのウイルス力価が提案されている
TAMRA-アルキン（CuAAC）ラベリング·ソリューション	ウイルス·ストレージ·バッファ内のアジドで修飾されたAd5の50μlの（N Ad5には、上記のように決定）、1.5 mMのbathoフェナントロリンスルホン（ すなわち、1.5×最後のCuBr濃度）、TAMRA-アルキン。 TAMRA-アルキンのモル濃度は、（M）を使用して決定されます。 C Alkは = 2×10 6×（N Ad5の / N アヴォ ） （ステップ5で調製した反応混合物はビリオン当たり100アルキンプローブを含むように）	トリス緩衝液は、銅の競争力阻害リガンドであることが知られている8。
Laemmliサンプルバッファー（2×）	125mMのトリス-HCl（pH6.8）を、4％（w / v）のSDS、20％（v / v）グリセロール、10％（v / v）の2 - メルカプトエタノール、および0.004％（w / v）のブロモフェノールブルー
ランニングバッファー	187 mMグリシン、19 mMのトリス-HCl、H 2 O、3.5 mMのSDS	4℃保存

T "> 表1。このプロトコルによって必要なバッファや溶液の調製。

ディスカッション

アジドのものも含めて化学選択とbioorthogonalクリック反応の開発は、研究の急速に進化している領域であり、その後、バイオコンジュゲーションアプリケーションの中から選択するこれらの反応の増加があります。我々は、我々自身の研究室とすべての試薬の商業的利用であるため、その有用性から選ばれた唯一つの方法を含めるには、このプロトコルの範囲が制限されています。

最初のそのようなルートで-ひずみ昇格アジド-アルキン環（SPAAC） -アルキンはcyclooctyneリング（ 図2a）内に含まれています。これは、最近開発されたメソッドは、酸素雰囲気下、銅触媒を必要とせずに行うことができる^。9,10は最近まで、この方法の一つの欠点は、端末と比較して骨の折れる合成し、これらの緊張したアルキンの還元商業的に入手可能だったで使用されるアルキン銅（I）触媒によるアジド - アルキン環銅（CuAACは）しかし、これらのプローブのライブラリーは（試薬の表を参照）、現在市販されている。これらの理由から、我々は、このプロトコルの選択の方法としてSPAA...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号
GFP遺伝子を含むアデノウイルス5型（Ad5）	BCBC	391
ヒト胎児腎臓（HEK 293）細胞	ATCC	CRL-1573
ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、高グルコース	インビトロジェン	11965-092
ダルベッコ改変イーグル培地、無メチオニン、システインなし（DMEM-MET /-Cys）を、高グルコース	インビトロジェン	21013-024
仔ウシ血清	インビトロジェン	16170-078
ペニシリン - ストレプトマイシン100×ソリューション（ペン連鎖球菌）	インビトロジェン	15140-122
0.5パーセントトリプシン-EDTA（10×）	インビトロジェン	15400-054
100 mmの細胞培養皿、組織培養処理したポリスチレン	BDファルコン	353003
細胞培養CO 2インキュベーター
血球計
バイオセーフティキャビネット
滅菌シリンジフィルター（0.2μmのセルロースアセテート）	VWR	28145-477（NA）、514から0061（ヨーロッパ）
アヴァンティJEの遠心	ベックマン·コールター	369001
コニカルチューブ（50ミリリットル、滅菌）	BDファルコン	352098
チューブ、Thinwall、超クリア、13.2ミリリットル、14×89ミリメートル	ベックマン	344059
SW 41及びSW 60 Rを搭載した超遠心otor	ベックマン
エッペンドルフBiopurセイフ - ロックチューブ、1.5ミリリットル	エッペンドルフ	0030 121.589
遠心機5418	エッペンドルフ	5418
遠心〜9月ゲルろ過スピンカラム	プリンストンセパレーション	CS-901
滅菌した針、18ゲージ
窒素グローブ袋（脱酸素CuAACが実行されることになっている場合）
デュワーフラスコ
液体窒素
電気泳動セル
蛍光ゲルスキャナー
レディゲルのTris-HClゲル	バイオ·ラッド	161-1105
L-Azidohomoalanine	AnaSpec	63669
イエナバイオサイエンス	CLK-AA005
アセチル化N-azidoacetylgalactosamine（AC 4 GalNAz）	インビトロジェン	C33365
サーモフィッシャーサイエンティフィック	88905
Sigma-Aldrich社	A7480
バソフェナントロリンジスルホン酸（BDA）ナトリウム塩	MPのバイオメディカル	0215011201
ジメチルスルホキシド（DMSO）
メタノール
トリス塩基（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）
リン酸二ナトリウム（ナ2 HPO 4）
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）
1MのHCl
グリセロール
ウシ血清アルブミン
L-システイン
L-メチオニン
SDS（​​ドデシル硫酸ナトリウム）
2 - メルカプトエタノール
グリシン
ブロモフェノールブルー
塩化セシウム（CsCl密度）		＆n個のBSPは、
銅（I）ブロマイド（CuBr）
塩化カルシウム（CaCl 2）
塩化カリウム（KCl）
塩化マグネシウム（MgCl 2の ）
塩化ナトリウム（NaCl）
CuAAC *のアルキンプローブ
TAMRAアルキン	インビトロジェン	T10183
SPAAC *の緊張したアルキンプローブ
TAMRA DIBOアルキン	インビトロジェン	C10410