生化学的に定義された大型単層小胞（LUVs）は、BCL-2ファミリーの相互作用を解析するための便利なモデルシステムであり、アポトーシスのミトコンドリア経路の理解を深める上で直接的な有用性を持ちます。本稿では、LUVsの作製方法に加え、LUVの透過性を調べるための標準的なBCL-2ファミリータンパク質の組み合わせおよびコントロールについて提示します。
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この記事について
サマリー
要約
BCL-2（B細胞CLL/リンパ腫）ファミリーは約20種類のタンパク質で構成されており、これらが協調して細胞の生存維持またはアポトーシスの誘導を行います1。細胞ストレス（e.g., DNA損傷）が生じると、プロアポトーシスBCL-2ファミリーエフェクターであるBAK（BCL-2 antagonistic killer 1）および/またはBAX（BCL-2 associated X protein）が活性化し、ミトコンドリア外膜透過性亢進（MOMP）と呼ばれるプロセスを通じてミトコンドリア外膜（OMM）の完全性を損なわせます1。MOMPが起こると、プロアポトーシスタンパク質（e.g., シトクロムc）が細胞質へ放出され、カスパーゼの活性化を促進し、速やかにアポトーシスが進行します2。
BAK/BAXがMOMPを誘導するためには、BID（BH3-interacting domain agonist）などの、BCL-2ファミリーの別のプロアポトーシスサブセットであるBCL-2ホモロジードメイン3（BH3）オンリータンパク質との一過的な相互作用が必要です3-6。抗アポトーシスBCL-2ファミリータンパク質（例：BCL-2 related gene, long isoformであるBCL-xL、myeloid cell leukemia 1であるMCL-1）は、BAK/BAXと、BAK/BAXを直接活性化できるBH3オンリータンパク質との相互作用を厳密に制御することで、細胞の生存を調節しています7,8。さらに、抗アポトーシスBCL-2タンパク質の利用可能性は、BAD（BCL-2 antagonist of cell death）やPUMA（p53 upregulated modulator of apoptosis）などのセンシタイザー/脱抑制BH3オンリータンパク質によっても決定され、これらは抗アポトーシスメンバーに結合してその機能を抑制します7,9。抗アポトーシスBCL-2レパートリーの大部分はOMMに局在しているため、生存を維持するかMOMPを誘導するかという細胞の決定は、この膜における複数のBCL-2ファミリー間の相互作用によって決定されます。
大型単層小胞（LUVs）は、BCL-2ファミリーの相互作用と膜透過性の関係を探索するための生化学的モデルである10。LUVsは、溶媒抽出したXenopusミトコンドリアの脂質組成研究で特定された比率（46.5% phosphatidylcholine、28.5% phosphatidylethanoloamine、9% phosphatidylinositol、9% phosphatidylserine、および7% cardiolipin）で構成される定義済みの脂質で形成されている10。タンパク質および脂質成分が完全に定義されており制御可能であるため、これはBCL-2ファミリーの機能を直接探索するのに便利なモデルシステムであり、これは初代ミトコンドリアでは必ずしも達成できない。OMM全体でcardiolipinが通常これほど高くはないものの、このモデルはBCL-2ファミリーの機能を促進するようにOMMを忠実に模倣している。さらに、上記プロトコルの最近の改変により、ポリアニオン性色素（ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid）とカチオン性消光剤（DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide）を含むLUVsに基づいた、タンパク質相互作用の速度論的解析および膜透過性のリアルタイム測定が可能になった11。LUVsが透過すると、ANTSとDPXが拡散して離れ、蛍光の増加が検出される。ここでは、ANTS/DPXを含むLUVsを用いた、一般的に使用される組換えBCL-2ファミリータンパク質の組み合わせおよびコントロールについて説明する。
プロトコル
1. 脂質の混合と脂質膜の形成
- 照明を最小限に抑えたドラフトチャンバー内で、クロロホルムで洗浄したHamiltonガス密閉ガラスシリンジを用いて、クロロホルム溶解脂質を1.5 mlの褐色ガラスバイアルにまとめます。これにより、約4 mgの脂質が得られます（図 1A）。
- Cardiolipin 10 mg/ml (CL) - 63 μl
- Phosphatidylcholine 10 mg/ml (PC) - 84 μl
- Phosphatidylethanoloamine 10 mg/ml (PE) - 125 μl
- Phosphatidylinositol 10 mg/ml (PI) - 59.5 μl
- Phosphatidylserine 10 mg/ml (PS) - 65 μl
- クロロホルムを除去するため、バイアル内に不活性ガス（例：窒素またはアルゴン）の緩やかな気流を当てます。通常2〜3時間で乾燥し、バイアルの底面と側面に脂質膜が確認できるようになります（図 1A）。
2. リポソーム溶液の調製
- 1.7 mlマイクロ遠心チューブに、LUVバッファー（0.2 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7], 200 mM KCl, 5 mM MgCl2 ）で調製した12.5 mM ANTS溶液 500 μlと、同じくLUVバッファーで調製した45 mM DPX溶液 500 μlを用意する（Figure 1B）。
- ANTS溶液とDPX溶液を混合し、室温で1分間ボルテックスした後、1分間超音波処理を行う。超音波処理は超音波洗浄機（例： Branson 3510MTH、設定なしの「on」状態）を用いて行う。これにより、溶液を完全に溶解させ、均一にする。
- ANTS/DPX溶液を脂質フィルムに加え、バイアルをパラフィルムで密閉する（Figure 1B）。
- 上述の洗浄機を用いて、脂質フィルムを5分間超音波処理する。超音波処理後、溶液は乳白色になる。小さな脂質凝集体は以降のステップに悪影響を及ぼすため、脂質フィルムが完全に溶解していることを確認すること。また、バイアルの側面と底面に脂質フィルムが残っていないか確認する（Figure 1B）。
3. リポソームの押出および精製
- 製造元のガイドラインに従ってエクストルーダーを組み立て、LUVバッファーを用いてフィルターサポートとポリカーボネート膜を湿らせます。押出中に液量が失われないようにユニットのケーシングを締めますが、膜が破裂しないよう締めすぎないようにしてください。また、漏れや問題がないかを確認するため、LUVバッファーでエクストルーダーをテストしておくことが推奨されます。
- 右側のシリンジに脂質溶液を入れ、脂質溶液を31回押し出します。これによりLUVが左側のシリンジに溜まり、すべての脂質が少なくとも1回は膜を通過したことが保証されます。最初の数回は、膜を通過させるためにもう少し圧力をかける必要がある場合があります。溶液が突然急速に膜を通過した場合は、膜の破裂を確認し、必要に応じて交換してください（図 1C）。
- 10 mlのSepharose S-500重力フローカラム（1.0 cm x 20 cm、ビーズ量 10 ml）を準備します。3カラム分量のLUVバッファーで洗浄し、カラムの流れが止まるまで待ち、キャップをします。この工程には時間がかかるため、脂質を合わせて乾燥させている間に洗浄を開始することを推奨します。使用準備が整うまで、カラムにキャップをしたまま保持してください。
- 押し出し後のLUVを一度にカラムに添加します。このとき、ビーズの界面を乱さないように注意してください。バッファーがカラムから流れ切り、流れが止まったらプラグで塞ぎます。ゆっくりとLUVバッファーでカラムを満たします。ここでも、ビーズが乱れないよう、バッファーを添加する際は注意してください（図 1C）。
- プラグを取り外し、1 mlずつの分画を6回回収します。通常、LUVは分画3および4に溶出し、白濁した外観で識別できます。分画の回収後、カラムを5分量の水および2分量の20%エタノールで洗浄します。カラムは4 °Cで保存してください（図 1C）。
- 回収した分画は、試験まで4 °Cの暗所で保存してください。
4. カラム分画のテスト
- カラム分画について、LUVバッファーと0.5% CHAPSを添加したLUVバッファーを用いて蛍光性を試験します。CHAPSの存在により蛍光が増加する分画にLUVが含まれています。LUVバッファーまたはLUVバッファー + 0.5% CHAPSをそれぞれ6つのウェルに100 μlずつ分注し、適切な分画を5 μl加えて混合します。すべてのLUV研究には、不透明な黒色の未処理96ウェルプレートを使用してください（図1D）。
- 37 °Cで、以下のパラメータを用いてプレートを読み取ります。励起波長：355 nm、蛍光波長：520 nm、ゲイン（電圧）：125、光学系位置：Top、読み取り高さ：5.5 mm。この設定は、Gen 5 2.0ソフトウェアを使用したBioTek H1 Synergy用です（図1D）。
- 一般的に分画3および4で蛍光が5〜10倍に増加します。分析後、LUVを含む分画を合わせて4 °Cの暗所で保存します。これにより、約2 mMの脂質が約2 ml精製されます（図1D）。
5. LUVを用いたBCL-2ファミリー研究
- BCL-2タンパク質を用いて、LUV膜透過性を直接誘導する能力およびその透過活性の調節について検討します。LUVアッセイは通常、37 °Cで100 μlの容量で実施され、30 - 60分後の単一時点での分析（Figures 2A-C, 3A-B）、または最大1時間まで1 - 2分ごとに測定するキネティック解析（Figure 2D）のいずれかで分析が可能です。構成成分、ストック濃度および最終濃度、添加順序を示した代表的なアッセイ設計を提示します（Table 1）。また、各測定前にマイクロプレートリーダーでプレートを軽く振盪させることを推奨します。開始後数分間は、温度変化や混合などの影響により測定値が不安定になることが多いため、キネティック解析では通常、2 - 3回の測定後のデータポイントを採用します。また、LUVバッチ間のばらつきや、活性化または抑制の境界付近の濃度におけるタンパク質相互作用の効率により、一部の条件下で大きなエラーバーが生じることがあります。
- BCL-2ファミリータンパク質のストック溶液は、LUVバッファーを用いて100倍濃度に希釈します。BAX、BID、およびその他のすべてのタンパク質について必要なタイトレーションを行い、BID不在下で最小限のBAX依存的なLUV膜透過性を検出するために必要な最低濃度、およびBAXとBIDの間の顕著な相乗効果を確認するための濃度を決定します。さらに、タンパク質の浪費を抑え、後続のタンパク質添加量を最小限にするため、他のすべてのタンパク質についてもタイトレーションが必要です。
6. 代表的な結果
BCL-2ファミリー依存的なLUV透過性の調節を観察および検討するためのオプションは数多くあります。LUV透過性のポジティブコントロールを作成するために、界面活性剤で活性化したBAX12を使用します。界面活性剤であるn-octyl-β-D-glucoside (OG) は、人工的にBAXの活性化を誘導します（2.3 μM OG-BAX 100 μlの調製：LUVバッファー中に5 μg BAX + 0.7% OGを加え、4 °Cで60分間インキュベートし、分注して-80 °Cで保存）。したがって、OG-BAX (10 - 100 nM) を信頼性の高いポジティブコントロールとして使用できます。なお、0.025%未満のOG濃度では、LUV透過性に直接的な影響は及びません。1アッセイあたりのLUV蛍光の最大量を決定するために0.5% CHAPS処理を行い、この値を100%として設定します。すべての処理は3連（triplicate）で設定してください。LUVコントロールアッセイ設定の一例をTable 1に示し、対応するデータをFigure 2Aに提示します。
BCL-2ファミリータンパク質によるLUVの透過性を研究する上で不可欠な出発点は、最適な放出を促進するためのBAXおよびBIDの濃度を決定することである。タンパク質の調製ロットによって背景となる透過活性が異なるため、より高度な解析を行う前にタイトレーションを行うことが推奨される。背景放出を最小限に抑え、かつ最適な相乗効果を得るために、BAX（50～200 nM）およびBID（0～10 nM）のタイトレーションを行う必要がある。その詳細は、以下の通りである。 図2B-C、それぞれである。さまざまな形態のBIDタンパク質はRから購入できる。&D Systemsから入手可能です。あるいは、BID BH3ドメインペプチドはAnaspecからも入手できます。LUVアッセイに適したBAXの市販品は存在しないため、既報の方法を用いて発現および精製する必要があります。3,13.
BAXおよびBIDの濃度と相乗効果が確定した後、一般的に行われるアッセイは、抗アポトーシス蛋白がBAXおよびBID依存的なLUV透過性に及ぼす影響を決定することです。BCL-xLは市販されている抗アポトーシスBCL-2ファミリーの一員であり、通常、BAXまたはBIDに対して5〜10倍のモル過剰量で、用量依存的にBAXおよびBIDの活性を抑制します（図3A）。この抑制効果は、その後にBH3-only蛋白（BCL-xLに対して2〜5倍のモル過剰量）またはBH3ドメインペプチド（BCL-xLに対して5〜10倍のモル過剰量）を添加することで解除されます。これらがBCL-xLに結合することで、BAXとBIDが相乗的に作用し、LUVを透過させることが可能になります（図3B）。図3Bでは、フルレングスのリコンビナントヒトPUMAβの効果を示していますが、PUMA BH3ドメインペプチドも機能的に同様の結果を示します（データ未掲載）8。この実験は、PUMA蛋白がBCL-xLによるBAXおよびBIDへの抑制効果を解除するため、一般に「脱抑制アッセイ（de-repression assay）」と呼ばれます。理想的には、脱抑制に用いるBH3-only蛋白/ペプチドの添加が、BAXの活性化に及ぼす影響は最小限である必要があります14。
図1. (A) クロロホルムで可溶化した脂質を混合し、乾燥させて脂質フィルムを作成し、蓋をする。 (B) ANTSおよびDPX溶液を調製して混合し、完全に可溶化および均質化させるために超音波処理を行う。この溶液を脂質フィルムに添加し、バイアルをパラフィルムで密封し、ウォーターバスで5分間超音波処理する。これにより、溶液は乳白色になる。 (C) 超音波処理した脂質溶液をミニエクストルーダーに充填して31回処理し、その後の精製のために調製済みのSepharose S-500カラムに添加する。 (D) サイズ排除クロマトグラフィー後に得られたフラクションを、LUVバッファーおよびLUVバッファー + 0.5% CHAPSにおける相対蛍光単位（RFU）を比較して解析する。「LUVバッファー」の読み取り値は、完全なLUVが存在する場合のバックグラウンド蛍光を示す。「LUVバッファー + 0.5% CHAPS」の条件では、溶解によって誘発される蛍光の増加が見られ、これがLUVの存在を示唆する。通常、フラクション3および4にLUVが含まれており、解析後にこれらを混合する。フラクション5および6には、取り込まれなかったANTS（すなわち、エクストルージョン後にLUV内に存在しないもの）が含まれており、CHAPSに関わらず高い蛍光を示す。 ここをクリックして拡大図を表示。
図2. LUVを用いたBCL-2ファミリーのコントロール実験およびBAX/BIDのタイトレーション。(A) コントロール実験。LUVをLUVバッファーのみ、0.025% octylglucoside「OG」、50 nM BAX、または50 nM OG-BAXで処理した。LUVを37 °Cで60分間インキュベートした。透過率（%）は、すべてのサンプルからバッファー処理分の蛍光値を差し引いて算出し、0.5% CHAPSで可溶化したサンプルを100%透過とした。実験値をCHAPSの値で除してLUV透過率（%）を求めた。OG-BAXは界面活性剤で活性化したBAXであり、LUV透過性の信頼性の高いポジティブコントロールとなる。(B) 最適なBAX濃度の決定。LUVを、10 nM C8-BID「BID」の存在下で、濃度を上げて添加したBAX（50 - 200 nM）、またはバッファーのみで処理した。(C) 最適なBID濃度の決定。LUVを、100 nM BAXの存在下で、濃度を上げて添加したBID（0 - 10 nM）で処理した。(D) LUV透過性のキネティクスデータセットの一例。LUVをBAX（100 nM）± BID（10 nM）で処理した。30分間、2分ごとに測定を行い、各測定前に2秒間の緩やかなプレートシェイキングを行った。最初の3回の測定値（0、2、4分）はグラフに含まれていない。最小および最大相対蛍光単位（RFU）は、セクション4.3に記載の方法で決定した。図2A-Cのエラーバーは、3連データの標準偏差を表す。2Dのデータは2連のアッセイ結果である。
図 3. LUVを用いて探索した、一般的なBCL-2ファミリー相互作用の例。(A) BAXおよびBIDによるLUV透過性は、BCL-xLによって抑制される。LUVを100 nM BAX、10 nM BID、および濃度を漸増させたBCL-xL（0 - 500 nM）とともに、37 °Cで60分間インキュベートした。(B) PUMAはBCL-xLの抑制を解除し、BAXおよびBIDの機能を促進する。LUVを100 nM BAX、10 nM BID、500 nM BCL-xL、および（0 - 2.5 μM）PUMAの組み合わせとともに、37 °Cで60分間インキュベートした。BAX単独の場合、PUMAを2.5 μMで使用した。エラーバーは3連データの標準偏差を示す。
| 添加順序： | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 条件 | 大型単層小胞 緩衝液 | OG (0.7%) | BAX (2.3 μM) | OG-BAX (2.3 μM) | CHAPS (10%) | 大型単層小胞 (LUVs) (2 mM) | 合計 |
| 緩衝液 | 95 μl | 5 μl | 100 μl | ||||
| OG (0.015%) | 92.83 μl | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | |||
| BAX (50 nM) | 92.83 μl | - | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | ||
| OG-BAX (50 nM) | 92.83 μl | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | |||
| CHAPS (0.5%) | 90 μl | 5 μl | 5 μl | 100 μl |
表1. LUVの透過性に及ぼすOG-BAXの影響を決定するためのコントロールアッセイの例。
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ディスカッション
記述されたLUVの作製法は、OMMに類似した生化学的に定義された膜環境において、さまざまなBCL-2ファミリータンパク質、ペプチド、および関連試薬の機能を迅速かつ効率的に試験することを可能にします。LUVの透過性を決定するためにエンドポイント値を用いる場合、複数のプレートを準備することで、1日で数百もの条件を分析することができます。これらのアッセイにおける制限要因は、リコンビナントタンパク質の品質と量になる傾向があるため、タンパク質の精製に十分な時間とリソースを割くことが、再現性のあるLUVアッセイ結果を得る鍵となります。
我々の経験では、LUVを4 °Cの暗所で保存した場合、通常は最大2週間までBAXおよびBIDに反応します。しかし、組換えBCL-2タンパク質はより不安定であり、凍結融解を繰り返すと活性が著しく変化しやすくなります。タンパク質ストックは可能な限り高濃度で、小分注して-80°Cで保存し、使用直前に希釈することを推奨します。そうすることで、タンパク質の効率が大幅に向上し、結果のばらつきを抑えることができます。気泡があるとプレートの読み取り値に誤差が生じるため、アッセ...
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開示事項
利益相反はありません。
謝辞
Chipuk研究室のすべてのメンバーに、同僚としての協力と支援に対する感謝の意を表します。また、本研究の実験的基盤を構築したTomomi Kuwana氏とDonald Newmeyer氏に感謝いたします。本研究は、NIH CA157740（J.E.C.への助成）およびNIH P20AA017067（J.E.C.への助成）のパイロットプロジェクトによる支援を受けました。また、本研究の一部は、March of Dimes財団の研究助成金 5-FY11-74（J.E.C.への助成）によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph–thanolamine "PE" | Avanti | 850725C | |
| L-α-ホスファチジルコリン（鶏卵） "PC" | Avanti | 840051C | |
| L-α-ホスファチジルイノシトール（ウシ肝臓） "PI" | Avanti | 840042C | |
| L-α-ホスファチジルセリン（ブタ脳） "PS" | Avanti | 8400320 | |
| カルジオリピン（ウシ心臓 - ナトリウム塩） "CL" | Avanti | 840012C | |
| ミニエクストルーダーセット | Avanti | 610023 | |
| PCメンブレン 0.2 mM | Avanti | 610006 | |
| Costar ブラック 96ウェルプレート | Fisher Scientific | 07-200-590 | |
| Caspase-8切断済みヒトBID | R&D Systems | 882-B8-050 | |
| ヒト BCL-xL（C末端除去） | R&D Systems | 894-BX-050 | |
| BID/PUMA BH3ドメインペプチド | Anaspec | 61711/62404 | |
| Synergy H1 ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダー | BioTek | None |
参考文献
- Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).
- Green, D. R. Apoptotic pathways: ten minutes to dead. Cell. 121, 671-674 (2005).
- Gavathiotis, E. BAX activation is initiated at a novel interaction site. Nature. 455, 1076-1081 (2008).
- Dewson, G. To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions. Mol. Cell. 30, 369-380 (2008).
- Dewson, G. Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices. Mol. Cell. 36, 696-703 (2009).
- Gavathiotis, E., Reyna, D. E., Davis, M. L., Bird, G. H., Walensky, L. D. BH3-triggered structural reorganization drives the activation of proapoptotic BAX. Mol. Cell. 40, 481-492 (2010).
- Kuwana, T. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Mol. Cell. 17, 525-535 (2005).
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- Letai, A. Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics. Cancer Cell. 2, 183-192 (2002).
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- Lovell, J. F. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
- Hsu, Y. T., Youle, R. J. Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family. J Biol Chem. 272, 13829-13834 (1997).
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- Du, H. BH3 domains other than Bim and Bid can directly activate Bax/Bak. J Biol Chem. 286, 491-501 (2011).
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