機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

サマリー

我々は、フローサイトメトリーのネガティブ選択による一次マウスII型肺胞上皮細胞（AECII）の迅速な単離を記述している。これらAECIIは高い生存率と純度を示し、そのような自己免疫疾患や感染症などの呼吸器疾患におけるそれらの役割に関する機能と分子生物学的研究の広い範囲のために適しています。

要約

最後に年間を通して、肺における免疫制御のさまざまな側面に肺胞II型上皮細胞（AECII）の寄与がますます認識されてきた。 AECIIは、炎症を起こした気道でのサイトカイン産生に参加しても感染やT細胞媒介性自己免疫^1月8日の両方において抗原提示細胞として作用することが示されている。したがって、彼らはそのような外国人と自己抗原と同様に、直接または間接的にターゲットAECII感染に対する気道過敏性などの臨床の文脈でも、特に興味深いものです。しかし、健康な肺だけでなく、炎症で肺胞II型上皮細胞によって提供される詳細な免疫機能の我々の理解では、断片的なままである。 AECII機能に関する多くの研究が^9月12日 、マウスやヒトの肺胞上皮細胞株を使用して実行されます。セルラインでの作業は確かにそのような大量の可用性oと、様々な利点を提供します詳細な分析のためのf細胞。しかし、我々は、プライマリマウスAECIIの使用は感染症や自己免疫炎症のような複雑なプロセスでこの細胞タイプの役割の理解を深めることができると信じています。プライマリマウスAECIIは、彼らが分析設定の役割を果たしているすべての追加の外的要因の影響を受けてきた意味、そのような呼吸器疾患を患っている動物から直接単離することができる。例として、実行可能なAECIIは鼻腔内に主に複製¹³のためにこれらの細胞を標的とするインフルエンザウイルスに感染したマウスから単離することができる。重要なのは、健康なマウスから単離しAECII の ex vivo での感染を介して、感染時にマウントされた細胞応答の研究は、さらに拡張することができます。

プライマリーネズミAECIIの単離のための私達のプロトコルは、CD11cのは、CD11b、F4/80に特異的な抗体で得られた細胞懸濁液を標識続いマウス肺の酵素消化に基づいているCD19、CD45およびCD16/CD32。粒状AECIIは次に高いラベルの付いていないと脇に散乱（SSC ^高 ）細胞集団として同定されており^、3を並べ、蛍光活性化細胞で区切られています。

マウス肺からプライマリ上皮細胞を単離する代替的な方法と比較して、負の選択によるAECIIのフローサイトメトリ分離のための我々のプロトコルは比較的短時間で手つかず、極めて現実的で純粋AECIIをもたらします。また、パンとリンパ球の減少による分離の従来の方法とは対照的に、抗体結合磁気ビーズ^14,15の結合を介して、フローサイトメトリー細胞ソーティングは、細胞の大きさや細かさによって差別することができます。フローサイトメトリー細胞選別のための計装が使用可能であることを考えると、説明された手順は、比較的低コストで適用できます。このような磁気のような肺の崩壊のために標準的な抗体や酵素、追加の試薬の隣ビーズが必要です。単離された細胞は 、in vitro 培養およびT細胞刺激アッセイならびにトランスクリプトーム、プロテオーム、またはsecretome で分析^3、4、機能および分子生物学的研究の広い範囲に適しています。

プロトコル

必要な試薬および材料に関する詳細は、下記のプロトコール末尾の表にリストされています。水浴中で37℃に作業を開始する前に、ディスパーゼ4mlを含む15 mlチューブを使って（マウス1匹あたり1）を準備し、事前暖かいそれら。加熱ブロックでは、まもなく95から1パーセント低融点アガロース（水中）の小アリコートを加熱℃で液化するまで、使用するまで45℃に続いてクール。

1。マウス肺の調製

1. CO ₂窒息によりマウスを生け贄に捧げる。注：正常に実行できませんが、そのような液体と肺のインストールとして、プロトコルの手順に従うように、これは気管を傷つけるように頸椎脱臼を実行しないでください。侵害受容性反射の消失を確認してください。
2. エタノールでマウスをスプレーし、体の腹側正中線に沿って長いカットを行います。腹毛や皮膚を引き、その後も慎重にカットし、腹膜を削除します。
3. Exsanguinate左と右の頚静脈（ 頸静脈 ）並びに腎動脈（ 腎動脈 ） を切断することによって、マウス。組織と流れる血液を除去する。
4. 慎重に穿刺してからリブを切り欠いて、心臓や肺を露出するようにダイヤフラムを取り外します。肺を傷つけないよう十分注意してください。
5. 緩衝生理食塩水（PBS）冷リン酸で満たさ26Gカニューレおよび10mlのシリンジを用いて、穿刺、心臓の右心室と血がなくなるまでPBSで肺を灌流。
6. 気管を露出するために唾液腺を切り取り、削除します。また、慎重に気管を周囲の筋肉を切った。
7. 気管に22Gの留置カニューレを挿入し、針を除去し、肺に向かってプラスチック製のカテーテルを押してください。気管およびカテーテルの周りに糸の小片を結合することにより、カテーテルを固定します。

2。肺組織の酵素消化

必要であれば、気管支肺胞洗浄液サンプルはできる次のステップに進む前に、PBSまたは培地で気管内に挿入されたカテーテルを介して肺を洗浄することによって調製した。

1. 2ミリリットルのシリンジを用いて、慎重にすべてのローブが完全に展開されるように、カテーテルを介して肺にディスパーゼの2ミリリットル（4 mlのアリコートから）の最大音量を植え付ける。液化アガロース0.5 mlを含む1mlシリンジで注射器を交換し、また肺に植え付ける。
2. アガロースの逆流を防止し、すぐに実験室のティッシュペーパーと氷で肺をカバーするためにカテーテルにシリンジのままにしておきます。分のカップルのためのアガロースゲルをみましょう。
3. 胸から肺、心臓、胸腺、ティッシュペーパー、氷、注射器やカテーテルを取り外して気管を切断し、消費税。その後、PBSで皿に肺を洗浄し、心臓、胸腺、残りの気管を削除します。
4. ディスパーゼの残りの2ミリリットルに肺を入れて、45分間室温でインキュベートする。

3。肺の調製細胞懸濁液

1. ディスパーゼから肺を外し、DMEM培地、100μlのDNaseでanti-CD16/32抗体の7ミリリットル（1μg/ mlの最終濃度）を含む皿に移す。
2. ピンセットを用いて、それを完全に引き離すことにより肺組織を崩壊させ、穏やかに200rpmに設定ロッカーに揺らしながら室温で10分間インキュベートする。必要に応じて、細胞懸濁液は、その後、次のステップまで4℃で保存することができます。
3. 100μmであり、その後で、70ミクロン、48ミクロン、30ミクロンの細孔を有する第一ナイロンメッシュを介して細胞懸濁液をろ過する。細胞の損失を最小限に抑え、歩留まりを最大化するために、各メッシュだけでなく、DMEMで徹底的にチューブや食器を洗うために世話をする。あなたがサンプルをプールしている場合、これはその後に同じフィルタを介して1つの群のマウス由来の細胞懸濁液を通過させることによってここに達成することができます。目詰まりした場合にフィルタを新たにする。
4. ボリュームに応じて、1つまたは複数の50mlチューブにろ液を転送し、160×gで15分間、4℃で遠心分離上清を取り除きます。
5. 2ミリリットル赤血球溶解バッファー（0.15M NH _{4 Clを} 、0.01M _{KHCO3、0.1mM}のEDTA、pH7.2）中で細胞ペレットを再懸濁し、迅速DMEM培地13ミ ​​リリットルを添加して溶解を終了します。 15 mlのチューブと遠心分離機160×gで12分間、4℃に溶液を移す

4。フローサイトメトリー細胞選別のための抗体染色

1. フローサイトメトリーに適した希釈でDMEM培地で調製した3ミリリットル一次抗体カクテル、中に細胞を再懸濁します。 （抗体は以前に100μlの体積で1×10 ⁶脾臓細胞を染色することによって最適な作業希釈の滴定した。使用は5匹までからプールされた細胞のために使用される抗体のそれぞれについて、最適な濃度を含む一次抗体カクテルの3ミリリットル。より多くのマウスは1サンプルにプールされている場合は、ボリュームを調整してください）​​。
2. 染色のために、暗所で10分間細胞をインキュベート4℃
3. 160×gで12分および4のDMEM培地、遠心分離にて15mlチューブを充填することにより、細胞を洗浄℃、
4. ケースでは非結合またはビオチン化抗体が4.1で使用された：2で上清を除去し、細胞を再懸濁し - 3ミリリットル二次抗体カクテル。暗闇の中で10分間4℃で染色。
5. 160×gで12分間、4℃でDMEMおよび遠心チューブを充填を介して細胞を洗う
6. セルソーティングのためのチューブにフィルターが50μmを通過DMEMおよびプレフィルター1mlに細胞を再懸濁する。オプション：肺の細胞懸濁液中の総細胞数を得るために、細胞をカウントする。

5。セルソーティング

1. 並べ替えの前にボルテックスにより細胞を混ぜる。 AECIIのセルソーティングのために100μmのノズルを使用しています。シース液圧だけでなく、レーザー発光、検出波長は、フローサイトメトリー細胞選別ならびにantibで使用蛍光色素のために使用される機器に依存ODY染色法。
2. DMEMを含むチューブに染色とソートに使用される蛍光色素に対して陰性であるSSCの^高い細胞にゲート。 （SSC-）ウィンドウ（でゲーティング戦略の詳細を参照して任意のダブレットまたは細胞凝集体を除外するには、散布高さ（FSC-H）対面積（FSC-A）と側方散乱の高さ（SSC-H）対面積フォワードを使用図1）。
3. 選別された細胞は、20×gで280分、4℃で遠心分離収集するために、
4. その後の分析の必要に応じて、文化培地または緩衝液で細胞を再懸濁します。

結果

健康なマウスから単離された肺の細胞懸濁液をソートする場合、AECIIゲートは通常は約42を占めることになるすべてのイベントの±10％。この割合は、初期の細胞懸濁液は、気道に補充リンパ球および他の免疫細胞のかなり高い割合が含まれていますように、このようなウイルス感染などの呼吸器疾患を持つマウスを使用する場合に著しく低くすることができる。 AECIIのために、私たちは約50％AECIIゲート内の細胞の頻度の減少を観察してきた3日目、次の感染にIAV感染肺から単離された。

選別された細胞の典型的なものとしてだけでなく、再分析は、 図1bおよび 1cに描かれている。示されるように、単離された細胞の純度はおよそ92±5％を占めています。 図2aに 、私たちは純粋な細胞集団の分離が成功したことにより排他的に発現されている界面活性タンパク質Cのために染色することによって確認することができる表示AECII ^16、17。

我々は、単一の動物ごとに分離されA...

ディスカッション

フローサイトメトリーによるマウスAECIIの単離のための我々のプロトコルは、機能と分子生物学的研究の全体の範囲のためのマウス肺から初代培養細胞にアクセスするための迅速な方法を提供しています。説明する手順では、このようなRNAの単離（ 図2bを参照）、トランスクリプトーム研究などの直接その後の分析のための番号で十分ですAECIIの非常に現実的で純粋な集団が得られます。機能的なアプリケーションでは、AECII馴化培地または共培養実験の世代EGできるように、単離された細胞を培養することも可能です。特にこれらの機能研究のための利点として、ここで説明したように負の選択による初代培養細胞の単離は、抗体結合の対象とされていない手つかずの細胞が得られます。しかし、細胞株において行われるものを介してプライマリAECIIにおける研究の利点にもかかわらず、これらの一次細胞の使用に実用上の制限があります。数字の単なる制限の隣、大規模なスクリーニングを必要とする研究の要件を満たしていないことでしょうが、一次AECIIのみ我々は48時間の周りの平均に観察している限られた時間のための文化の中で生き残る。これらの短期...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名称	会社	カタログ番号	注釈
留置カニューレIntrocan 22G	ブラウン	REF 4252098B
ディスパーゼ、100ミリリットル（5000カゼイン単位）	BD Biosciences社	354235	15 mlチューブで4ミリリットルのアリコート、-20℃で保存
Biozymプラークアガロース	Biozym	840101	H 2 O中の1％w / vの
ウシ膵臓、2000クニッツ単位/バイアルからリボヌクレアーゼI	シグマアルドリッチ	D4263	新たに300μlのDMEM中で1バイアルの内容物を溶解
DMEM	ギブコ	22320-022	（メーカが提供する低Gとして使用lucose、ピルビン酸、HEPES）
セルストレーナー（100μm以下、75μm以下）	BDファルコン	352360、352350
ナイロンメッシュ（48ミクロン、30ミクロン）	バックマン社	03-48/26-1020、03-30/18-108
50μmのフィルターCellTrics	パーテック	04-0042-2317
抗マウスCD16/CD32	BioLegend	101302	クローン93;精製
抗マウスF4/80	BioLegend	123116	クローンBM8; APC結合
抗マウスCD11bを	BioLegend	101208	クローンM1/70、PE結合
抗マウスCD11cは	BioLegend	117310	クローンN418; APC結合
抗マウスCD45	BioLegend	103102	クローン30-F11;精製
抗マウスCD19	eBioscience社	12-0193-83	EBIO 1D3、PE結合
ポリクローナルヤギ抗ラットIgG	BDファーミンジェン	550767	ポリクローナル抗体、PE結合
			代替の蛍光色素に結合された抗体は、使用可能なフローサイトメーターやレーザーに応じて、使用することができます。