RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞

Summary

このプロトコルは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞にトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqの、強力な次世代DNAシーケンシング技術を適用するための完全かつ詳細な手順を示します。このプロトコルは、異なる試薬又は病気の状態によって影響を受ける様々な細胞や組織に一般化できる。

Abstract

mRNAレベルの測定を介して細胞内での遺伝子発現の特性は、細胞の転写機構を外部信号（ 例えば、薬物治療）、またはどのように細胞が健康な状態と病気の状態の間で異なることによりどのような影響を受けるかを決定するのに有用なツールです。次世代DNAシーケンシング技術の出現と連続洗練された、RNAシーケンシング（RNA-seq）は、転写物の全ての種をカタログ化するすべての発現している遺伝子の転写構造を決定するために、定量化するトランスクリプトーム解析のますます普及している方法となっている与えられた細胞、組織または生物^1,2における転写産物の全体集合の変化の発現レベル。 RNA-seqは徐々にそれが完全なトランスクリプトームのプロファイリングの利点を持っているので、トランスクリプトーム解析のための好ましい方法として、DNAマイクロアレイを交換するデジタルdatum型（任意の転写物のコピー数）を提供すると、任意の既知のゲノムシーケンシャルに頼っていませんCE ^3。

ここでは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞のトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqを適用するための完全かつ詳細なプロトコルを提示。このプロトコルは、と題する我々の最近発表された研究に基づいている我々は正常ヒト肺微小血管内皮細胞の最初の完全なトランスクリプトーム解析を行っている⁴ "RNA-seqはトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞における遺伝子およびそのアイソフォームの新規トランスクリプトームを明らかにする" RNA-seqを使用してトロンビンで処理した。これは、炎症状態、癌、糖尿病、冠状動脈性心臓病の病因におけるトロンビン媒介内皮機能不全の分子機構についての洞察を得るためにさらなる実験のための前例のない資源をもたらし、これらの疾患に対する治療ターゲットの潜在的な新規のリードを提供しています。

このプロトコルの記述テキスト4つの部分に分かれています。最初の部分は、トロンビンおよびRNAの単離、品質分析と定量化したヒト肺微小血管内皮細胞の治療について説明しています。第二部では、ライブラリーの構築およびシーケンシングを説明しています。第三部は、データ分析を説明しています。 4番目の部分は、RT-PCR検証アッセイを記載する。いくつかの重要な手順の代表的な結果が表示されます。重要なステップでの成功を後押しするための有用なヒントや注意事項は、ディスカッション·セクションで提供されています。このプロトコルはトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞を使用していますが、それは哺乳類と非哺乳類細胞の両方で、さまざまな刺激または阻害剤で処理した組織内のプロファイル·トランスクリプトームに一般化することができる、または健康状態の間の細胞または組織にトランスクリプトームを比較する疾病状態。

Protocol

このプロトコルを概説するフローチャートを図1に表示されます。

1。トロンビン、RNA単離、RNAの品質評価と定量で細胞を処理する

1. 5％のFBS、成長因子および抗生物質によるEGM-2培地で6ウェルプレートで90〜100％コンフルエントまで培養ヒト肺微小血管内皮細胞（HMVEC-LBL）（Lonza社、カタログ番号CC-3202）。
2. 飢餓·メディア（0％FBS）を30分トロンビンによる治療に先立って、メディアを変更してください。
3. 0.05 U / mlのトロンビンを用いて細胞を治療したり、℃、5％CO _2、37℃で6時間のコントロールとして未処理のままにしておきます。
4. メーカーの指示に従ってアンビオンミールヴァナキットを使用して処理した細胞および対照細胞から全RNAを単離する。
5. Experionの自動電気泳動Station上の標準プロトコルに従ってExperionのStdSense真核生物RNAチップを搭載したRNAの品質を評価する（= "_blank"> www.bio-rad.com）。
6. 標準分光光度法を用いてRNAを定量化する。

2。ライブラリーの構築とシーケン

1. 出発原料として、サンプルあたり....

Results

ステップ1：28S：18S比は伝統的にRNA分解の指標として用いられる。理想的には、28Sのピークは18歳のバンド（2の比）の約2倍の面積を持つ必要がありますが、この理想的な比率は、しばしば、実際には見られません。さらに、28S：分光光度法から得られた18S比はRNAの分解量を過小評価することができます。より正確に劣化、したがって、RNAサンプルの品質を定量化するために、Experionのシステムは、RNAの品質インジケータ（RQI）数を計算します。 RQIアルゴリズムは、標準化され、分解されたRNAの一連のサンプルからのデータにRNAサンプルの電気泳動図を比較して、自動的に10（インタクトなRNA）と1（分解されたRNA）の範囲の数値を返します。 RNAの品質は8より大きい理想的には少なくとも7のRQIを有するべきであり、 図2は、8.4のRQIで高品質のRNAサンプルを用いたExperionの結果を示しています。

のためにステップ2：ライブラリは約250から300 bpの広.......

Discussion

主な手順

RNAの取り扱い：RNaseがあっても、最も高品質のRNAを低下させます従ってケアはRNAを¹⁰の分離、貯蔵及び使用時に注意が必要です。手袋は常に人間の手で発見のRNaseの混入を防ぐために着用されています。手袋は、特に皮膚、ドアノブや他の共通の表面に触れた後、頻繁に変更する必要があります。ピペットのセットは、単に仕事をRNAに専念すべきであり、すべてのヒントやチューブは、RNaseフリーであるべきである。 RNAの単離と下流のアプリケーションは、日常などのRNase-ZAPとして製品に除染されている低トラフィック地域で行われるべきである。劣化はまた、凍結融解の繰り返しで発生する可能性があります。これらは分離直後にダウンストリームアプリケーション用のRNAを分取することで最小限に抑えることができます。あるいは、cDNAを直接分離後に、そのような定量RT-PCRなどのダウンストリーム·アプリケーションのために行うことができます。 RNAは-80℃で保存し、使用中に氷の上で保たれるべきである。また、IMPで完全に解凍し、ボルテ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬や機器	会社	カタログ番号	注釈
ヒト肺微小血管内皮細胞	ロンザ	CC-2815
ロンザ、Bulletのキット	ロンザ	CC-3202	EGM-2、FBS、成長因子や抗生物質が含まれています
トロンビン	シグマ	T4393
アンビオンミールヴァナキット	ライフテクノロジーズ	AM 1560
のRNaseザップ	ライフテクノロジーズ	AM9782
ExperionのStdSens RNA	バイオ·ラッド	700-7103
TruSeq RNAの調製キット	イルミナ	FC-122-1001
AMPureXPビーズ	ベックマン·コールター	A63881
スーパースクリプトII逆転写酵素	ライフテクノロジーズ	18064-014
ExperionのDNAの1K	バイオ·ラッド	700-7107
のQuantiTect SyberGreen	キアゲン	204163
PEのクラスタ生成キット	イルミナ	PE-401-3001
PHIXコントロールキット	イルミナ	FC110-301
200サイクルSBSキット	イルミナ	FC-401-3001
HiScanSQ *	イルミナ	SY-103-2001
CBOT	イルミナ	SY-301-2002
定量PCRマシン - Viia7	ライフテクノロジーズ	モデル＃VIIA7 /機器＃10631261	または同等の
Experionのシステム	バイオラッド	7007001	バイオアナライザは、代替システムである
分光光度計	バイオテック	エポックマイクロプレート分光光度計	または同等の
遠心分離機 - ソーバルレジェンドXTR	サーモサイエンティフィック	75004521	または同等の
マグネットスタンド	ライフテクノロジーズ	AM10027
96ウェルサーモ	一般的なラボサプライヤー
			表3主な試薬のリストとEメジャーquipment。 *、ビデオでは、代わりにHiScanSQのHiSeq1000が実証された。