ウサギモデルにおける軟骨欠陥の改造と修理のためのマトリックス支援自家軟骨細胞移植

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4422

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方法論記事

ウサギモデルにおける軟骨欠陥の改造と修理のためのマトリックス支援自家軟骨細胞移植

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DOI:

10.3791/4422

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2013年5月21日

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ウサギの膝関節内の軟骨欠損の治療のための実験技術が記載されている。マトリックス上に播種自家軟骨細胞の移植は、満足の長期的な結果を提供する関節軟骨病変の改造や修理のために広く受け入れ方法です。マトリックス支援自家軟骨細胞移植（MACT）が標準化され、臨床的に確立された注入方法を提供しています。

要約

関節軟骨は自己再生¹限られた容量を有するので、関節軟骨の欠陥が重大な健康問題と考えられている。未処理の軟骨病変は進行中の痛みにつながる、否定的に生活の質に影響を与えると変形性関節症のためにやすく。過去数十年の間に、いくつかの外科技術は、このような病変を治療するために開発されてきた。しかし、今まで、硝子関節軟骨を有する欠陥を覆う又は十分な長期の回復^2-4を提供するという点で完全な修復を達成することは不可能であった。したがって、関節軟骨の損傷は、そのような組織工学などの再生技術のための主な目標のまま。多くの場合、繊維状または線維軟骨組織の形成をもたらす他の外科技術とは対照的に、組織工学は、完全に移植された細胞の軟骨産生能を使用して、元の関節軟骨複合体の構造および特性を回復することを目的とする。 Recent発展は再生軟骨の治療のための有望な可能性を開いた。

全層軟骨や骨軟骨病変の治療のための最初のセルベースのアプローチは、臨床自家軟骨細胞移植^{（ACI）5を}開拓ラース·ピーターソンとマットBrittbergによって1994年に行われた。今日では、技術は臨床的にも、10〜20年後に移植⁶良好な臨床結果を維持し、膝の大硝子軟骨欠損の治療のために十分に確立されています。近年では、自家軟骨細胞の移植は、急速な進行を受けた。その後、細胞を植え替えされた人工的な三次元コラーゲンマトリックスの使用は、ますます人気^7-9となった。

MACTが2つの外科的処置を含む：軟骨細胞を収集するために、まず、軟骨生検は、tの非体重を支える軟骨領域から行う必要がある彼は膝関節を。その後、軟骨細胞は、抽出、精製し、 インビトロで十分な細胞数に拡張されている。軟骨細胞は、その後、三次元マトリックス上に播種され、その後、再移植することができる。組織工学インプラントを調製する場合、増殖速度および分化能力が成功した組織再生¹⁰にとって極めて重要である。細胞担体としての三次元マトリクスの使用は、これらの細胞の特性^11を支持すると考えられる。

以下のプロトコルは、3Dマトリックス（ 軟骨·ジッド 、Geistlichバイオマテリアル、Wollhusen、スイス）の上に軟骨生検、in vitroでのそれらの増殖とその播種から軟骨細胞を単離するための手法を要約し、デモンストレーションを行います。最終的に、ウサギの膝関節の人工的に作成された軟骨細胞の欠陥にマトリクス構築物の注入について説明する。この技術は、実験的な設定として使用することができる軟骨修復のさらなる実験のために。

プロトコル

A.軟骨生検（手術室、非滅菌準備室の手順1-5）

適切に用量薬することができるように、手術後の体重を監視するために、ウサギ（ニュージーランドホワイトウサギ、女性、3.5〜4.0キロの体重、生後6ヶ月）の最終重量の制御を行う。
10 mg / kgをプロポフォールの静脈内注射によりウサギに麻酔を誘導する。
挿管後、静脈内に1.5 mg / kg体重/分プロポフォール及び0.05 mg / kgでフェンタニルで麻酔を維持します。カプノグラフィ、パルスオキシメトリと脈拍数を用いて麻酔を監視する。
電気クリッパー、真空毛皮でログオン操作する膝を剃る。
徹底的に剃っているd膝を消毒、滅菌ドレッシングでウサギの残りの部分をカバーしています。
膝蓋骨を触診し、膝蓋骨の内側に皮膚切開を行います。
無菌条件下で内側parapatellar関節切開による膝関節を開きます。どんな小さなSUを切断回避しようperficial血管。
横方向に膝蓋骨を置換。
任意の異常や巨視的軟骨病変に対する膝関節を点検。
慎重に滅菌メス（ 図1）と滑車骨大腿の外に小さな軟骨片（2-3 mm）の皮をむく。
使用直後の体外培養右を続行する完全培地（DMEM + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン））で50 mlチューブにこれらの軟骨生検を配置。
欠陥をきれいにし、滅菌生理食塩水でそれらを洗い流してください。
滑車の溝内に膝蓋骨の位置を変更。
シングルボタンの縫合（4-0 VICRYL）、継続皮膚縫合（4-0モノクリル）と層における創傷閉鎖。吸収性縫合糸の素材を使用しています。
最後に、水蒸気透過性ドレッシングスプレーで傷を封印。

体外培養における B.

生検Cを処理無菌層流の組織培養フード内操作後できるだけ早くartilageはピース。
室温で3分間、500×gで遠心分離し、後続とのPBS中の滅菌収穫軟骨2倍を洗ってください。
30分間1ミリメートル^3、50ミリリットルファルコンへの転送部分で軟骨をカットし、10ミリリットルトリプシン-EDTA（0.25％）および10 mlのPBSで30分間シェーカーでそれらを消化
30分後、完全培地を添加することにより、トリプシン処理を停止する。その後、無血清培地（DMEM + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）のコラゲナーゼ（0.21 U / mg）を、12時間のために別のために軟骨の部分を横に振る。
室温で3分間、170×gで得られた溶液を遠心分離。
5ミリリットル完全培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
シード5ミリリットル完全培地で25cm ^2の組織培養フラスコに上の孤立した軟骨細胞と37℃加湿組織培養インキュベーター中で保つ℃、5％CO _2。
80％の密度に軟骨細胞を成長させる。
細胞fを放し3分間0.05％トリプシン-EDTAにさらす前に、PBS 2倍で洗浄することによりROMフラスコ。軟骨は切り離したら、10μlの完全培地の添加によりトリプシン処理を停止します。
完全培地中300 XG（3分）とペレットを再懸濁しでサスペンションを遠心分離。
種子組織培養フラスコ中の細胞（75cm ^2の）と1:3（〜5,000細胞/ cm ^2）ごとに5 ^日目または80％コンフルエント時で分割。
トリパンブルー染色により細胞数と生存率を決定します。

マトリックスのC.の細胞播種

上述したように、注入洗浄および剥離細胞に先立っ。細胞数を実行し、1.5 mlのマイクロチューブに5×10 ^4個の細胞を移す。その後、室温で5分間、500×gで遠心。
行列の完全な飽和状態のために15μlの完全培地中でペレットを再懸濁します。
無菌の生検によって滑車欠陥の正確な寸法に重層コラーゲン足場をカットパンチ。
適切な大きさの組織培養皿（ 例えば、24ウェルプレート）に、プレース行列。
マトリックスの多孔質、細胞接着面への種子の細胞。これは離れてマトリックスから細胞遊走を阻止。
軟骨細胞の完全な遵守を可能にするために1時間インキュベーター内でさらに細胞培養培地なしで細胞播種行列をしておきます。
新鮮な完全培地で培養容器（ 例えば 、24ウェルプレート）に続いて、場所細胞-マトリックス構築物。強力な遵守が期待されるにもかかわらず行列オフ任意の細胞を洗い流すないように注意してください。
現在、細胞 - マトリックス構築物は、再移植のための手術室に取り出すことができる。

D.マトリックス支援自家軟骨細胞移植

（A. 1-8）上記のように反対側の膝にparapatellar関節切開を行います。
無菌の空気のoperatinと滑車溝に2つの孤立した軟骨欠損を作成Gパワードリル（直径3.6ミリメートル）。
欠陥をきれいにし、滅菌生理食塩水で洗い流してください。
注目はいつでも骨髄腔を開くために支払われるべきではない。必要であれば、出血に対する電気焼灼と欠陥の底部をシールします。
多孔質の側面下に（ 図2）で培養軟骨細胞を播種行列を植え込む。その後、ドリル穴に圧入し、周囲の表面を洗い流す。
安全な固定を保証するためにフィブリン糊を少し（TissucolデュオS）を移植した行列を封印。
数回凝固した後、滑車溝内膝蓋骨を再配置し、膝関節への動きの完全な範囲を適用する。
もう一度横膝蓋骨を置換し、不安定な固定のいずれかのイベントやサインを確認してください。行列は場所ではまだ開催されている必要があります。
再び膝蓋骨を交換して、上記のようにドレッシング層とスプレーで創傷閉鎖して操作を終了します。