ウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療のための実験技術が記載されている。骨軟骨欠損に同種間葉系幹細胞の移植は、組織工学の分野で有望な開発を提供しています。フィブリン細胞塊の準備 in vitroで移植のための標準化された方法を提供しています。
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方法論記事
フィブリン塊における同種間葉系幹細胞の注入によってウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
骨軟骨関節欠損の治療は、長年医師にとって困難な課題となってきました。近年、関節軟骨と軟骨下骨の相互作用への理解が深まったことで、骨軟骨ユニット全体の修復に注目が集まっています。軟骨病変と比較して、骨軟骨欠損の再生ははるかに複雑であり、外科的および治療的なハードルが非常に高くなります。損傷組織には、表層の軟骨層だけでなく、軟骨下骨も含まれるためです。例えば剥離性骨軟骨炎などで見られるような深い骨軟骨損傷の場合、関節表面を復元するには欠損部の全層を置換する必要があります 1。適切な治療法を選択するには、固有の治癒能力が異なるこれら2つの組織を考慮しなければなりません 2。ここ数十年の間に、いくつかの外科的治療オプションが登場し、すでに臨床的に確立されています 3-6。
自家または同種骨軟骨移植は、関節軟骨と軟骨下骨で構成されており、骨軟骨ユニット全体の置換を可能にする。欠損部は円柱状の骨軟骨移植片で充填され、これにより適合性の高い硝子軟骨で覆われた表面を提供することを目的とする 3,7,8。欠点は、利用可能な移植片の量が限られていること、ドナー部位の罹患（自家移植の場合）、および表面の不適合性であり、そのため、この手法の適用は特に大きな欠損部においては制限される。
組織工学分野における新しいアプローチは、再生骨軟骨治療に有望な可能性を切り拓きました。自家軟骨細胞の移植は、全層軟骨損傷治療のための初の細胞ベースの生物学的アプローチとなり、現在では移植後10年から20年が経過しても良好な臨床結果が得られる手法として世界的に確立されています9,10。しかしながら、現在まで、この手法は軟骨下骨を含む深い欠損などのあらゆる種類の損傷の治療に適しているわけではありません11。
定冠詞（The） サンドイッチ法 骨移植を組織工学における最新のアプローチと組み合わせる 5,6この組み合わせは、骨軟骨移植単独で見られる限界を克服できると考えられています。軟骨下欠損部への自家骨移植の後、自家軟骨細胞を播種したメンブレンをその上に縫合することで、移植片の形態を損傷部位に適合させることが容易になります。当然ながら、事前の骨再建には追加の手術時間が必要となり、多くの場合、さらなる手術が必要となります。さらに、現在まで長期的なデータが不足しています。 12.
追加の骨移植を行わない組織工学は、移植細胞の軟骨形成能および骨形成能により、天然の関節軟骨の複雑な構造と特性を回復させることを目的としています。しかしながら、一般的に再生されるのは多かれ少なかれ軟骨組織のみにとどまります。さらに骨軟骨損傷がある場合は、別途、特定の治療が必要です。骨軟骨欠損の多層構造の再生を実現するためには、自家または同種細胞を播種した三次元組織工学製品が、優れた再生能力を提供し得る可能性があります11。
自家軟骨細胞に加えて、間葉系幹細胞（MSC）は全層軟骨組織を構築するための魅力的な代替手段であると考えられています。数多くの前臨床in vitroおよびin vivo研究において、間葉系幹細胞は優れた組織再生能を示しています13,14。特に骨軟骨欠損の治療において間葉系幹細胞が持つ重要な利点は、骨細胞および軟骨細胞の両方に分化する能力を備えていることです。したがって、欠損部位の多層的な再生を可能にする可能性があります。
そのため、近年、骨軟骨再生能を有するいくつかのスキャフォールドが開発され、有望な予備的結果とともに評価されています 1,15-18。さらに、細胞キャリアとしてのフィブリン糊は、実験的な軟骨修復における好ましい手法の一つとなり、すでにいくつかの動物研究 19-21 や、さらには初期のヒト臨床試験 22 においても成功を収めています。
以下のプロトコルでは、ウサギの骨髄から間葉系幹細胞を単離し、その後、細胞培養で増殖させ、フィブリン細胞凝集塊の標準的なin vitroモデルを調製するための実験手法を実演します。最後に、あらかじめ作製したフィブリン細胞凝集塊をウサギ膝関節の人工骨軟骨欠損部へ移植する手法について解説します。
プロトコル
間葉系幹細胞の単離のためのドナーウサギのA.準備（手術室）
- 細胞はオス4ヶ月歳の時にニュージーランドホワイト（NZW）ウサギ、約3キロ体重から分離されています。
- プロポフォールで麻酔（10 mg / kg体重体重IV）を誘導し、ペントバルビタールナトリウム（100 mg / kg体重体重IV）を生け贄に捧げる。
- 電気クリッパー、真空毛皮で後肢、背中と腹から毛皮を剃る。
- 70％エタノールで完全に剃毛した領域を消毒する。
- 鈍鉗子、鋭いハサミ（またはメス）と組織や靭帯のための骨のカッターを使用してください。
- 足とふくらはぎの頭蓋の表面に沿って切開を行います。
- どちら鋭いまたは鈍的切開によって皮膚や皮下組織を反映しています。
- 脛骨と大腿骨とは別の筋肉や靭帯。きれいな解剖を行うことが可能のような骨の近くにカットしてください。この時点で脛骨から大腿骨を分離しないでください。
- THRをカットウワーッ寛骨臼から大腿骨頭を分離する股関節。
- 脛骨 - 大腿骨複合体を昇格。
- 骨から残りの軟部組織を掻きまたは滅菌布の組織と骨をこするように手術用メスの刃を使用します。この時点で、大腿骨および脛骨はまだ接続されている。
- 切断することにより膝蓋骨を外し、その後最終的に独立した骨に膝関節の靭帯を切った。
- スプレーは、空気が乾燥....
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結果
記載の外科技術は、人工骨軟骨欠損部に同種間葉系幹細胞の単離及び移植の成功を可能にする。実験装置は、周囲の軟骨にインプラント統合の成功をもたらした。
欠陥が周囲の軟骨に比べて類似の生体力学的特性と類似した耐久性と修復組織で充填した。フィブリン血餅細胞が骨軟骨欠損（ 図3）と同じサイズを有していた事前ドリル穴を有する滅菌プレート上にインビトロで調製した。結果として、注入フィブリン塊、早期変性または層間剥離（ 図6）の危険因子であろう周囲の軟骨との間に裂け目はなかった。軟骨下骨を貫通し、したがって、せん断に対して働いていたので修復組織の基底治癒が確保されました。もう一つの重要な側面は、STIFだったその上に負荷が増大し、可能時期尚早変性を避けるために、健康な周囲の軟骨組織と一致している必要があり修復組織のfness。我々の予備実験（データは示していない）においては、12週間後に十分な剛性がすでに達成され得ることを示した。また、移植の無傷で均質表面をせん断応力と可能な注入損傷（ 図6）を<.......
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ディスカッション
近年では、複雑な関節骨軟骨欠損治療の可能性 - そのような骨軟骨炎の離断、骨壊死や外傷に起因するものなどを - 組織工学的アプローチでは、ますます魅力的になりました。前述した病的なエンティティでは、組織の損傷は軟骨下骨に延びており、別の本質的な癒しの容量1によって特徴付けられる2組織が 含まれます。骨軟骨関節損傷11,23の病原性プロセスの軟骨下骨の役割に関心が高まっている。関節軟骨とそのサポート骨の機能的条件がしっかり接続されています。どちらの組織の損傷は機械的な環境だけでなく、全体のジョイント24の恒常性のバランスに悪影響を及ぼす。関節運動の機械的破壊、緩い体形成、関与コンパートメント内機械的摩耗や消耗を通じて骨軟骨単位の変化対向面には変形性関節症1,11以前の発症と発展につながる可能性があります。したがって、骨軟骨欠損の再生のための組織工学アプローチは、宿主組織2を包囲して効果的な組合を向上させるために、下地軟骨下骨の適切な修復を添付しなければならない。間葉系幹細胞は、骨軟骨修復、これらの特定の要件を提供するための理想.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
このプロジェクトは、ドイツ研究協会（助成HE 4578/3-1）で、部分的にFP7 EU-プロジェクト "GAMBA" NMP3-SL-2010から245993によって賄われていた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| プロポフォール | Fresenius Kabi | ||
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Biochrom AG | A 2210 | 0.9% NaCl中 1,000 units/10 μg/μl |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| エタノール (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| トリパンブルー溶液 (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll 分離溶液 | Biochrom AG | L6115 | 等張溶液 密度: 1,077 g/ml |
| トリプシン-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| フェンタニル | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| NaCl溶液 (0.9%) | BBraun | 8333A193 | |
| 注射器 (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| 注射針 (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| ピンセット (鈍的/鋭的) | Aesculap | ||
| はさみ | Aesculap | ||
| メス | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| 研究用ピペット | Eppendorf | ||
| 骨切断鉗子 | Aesculap | ||
| 組織培養皿 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | 培養面積 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| 組織培養フラスコ 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| 遠心管 (50 ml) | TPP AG | 91050 | ガンマ線滅菌済み |
| CO2 インキュベーター | Forma Scientific Inc. | ||
| 細胞培養用ラミナーフローフード Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| 滅菌鋸 | Aesculap | ||
| 遠心分離機 Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| 血球計数器 | Brand GmbH+Co KG | 717810 | ノイバウアー |
| エア駆動式電動ドリル | Aesculap | ||
| TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| 縫合糸 (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| スプレー処置材 (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | 水蒸気透過性 |
参考文献
- Kon, E., et al. Novel nano-composite multilayered biomaterial for osteochondral regeneration: a pilot clinical trial. The American Journal of Sports Medicine. 39, 1180-1190 (2011).
- Kon, E., et al.
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再版と許可
