フィブリン塊における同種間葉系幹細胞の注入によってウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4423

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方法論記事

フィブリン塊における同種間葉系幹細胞の注入によってウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療

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DOI：

10.3791/4423

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2013年5月21日

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療のための実験技術が記載されている。骨軟骨欠損に同種間葉系幹細胞の移植は、組織工学の分野で有望な開発を提供しています。フィブリン細胞塊の準備 in vitroで移植のための標準化された方法を提供しています。

要約

骨軟骨関節欠損の治療は、長年医師にとって困難な課題となってきました。近年、関節軟骨と軟骨下骨の相互作用への理解が深まったことで、骨軟骨ユニット全体の修復に注目が集まっています。軟骨病変と比較して、骨軟骨欠損の再生ははるかに複雑であり、外科的および治療的なハードルが非常に高くなります。損傷組織には、表層の軟骨層だけでなく、軟骨下骨も含まれるためです。例えば剥離性骨軟骨炎などで見られるような深い骨軟骨損傷の場合、関節表面を復元するには欠損部の全層を置換する必要があります ¹。適切な治療法を選択するには、固有の治癒能力が異なるこれら2つの組織を考慮しなければなりません ²。ここ数十年の間に、いくつかの外科的治療オプションが登場し、すでに臨床的に確立されています ^3-6。

自家または同種骨軟骨移植は、関節軟骨と軟骨下骨で構成されており、骨軟骨ユニット全体の置換を可能にする。欠損部は円柱状の骨軟骨移植片で充填され、これにより適合性の高い硝子軟骨で覆われた表面を提供することを目的とする ^3,7,8。欠点は、利用可能な移植片の量が限られていること、ドナー部位の罹患（自家移植の場合）、および表面の不適合性であり、そのため、この手法の適用は特に大きな欠損部においては制限される。

組織工学分野における新しいアプローチは、再生骨軟骨治療に有望な可能性を切り拓きました。自家軟骨細胞の移植は、全層軟骨損傷治療のための初の細胞ベースの生物学的アプローチとなり、現在では移植後10年から20年が経過しても良好な臨床結果が得られる手法として世界的に確立されています^9,10。しかしながら、現在まで、この手法は軟骨下骨を含む深い欠損などのあらゆる種類の損傷の治療に適しているわけではありません¹¹。

定冠詞（The） サンドイッチ法 骨移植を組織工学における最新のアプローチと組み合わせる ^5,6この組み合わせは、骨軟骨移植単独で見られる限界を克服できると考えられています。軟骨下欠損部への自家骨移植の後、自家軟骨細胞を播種したメンブレンをその上に縫合することで、移植片の形態を損傷部位に適合させることが容易になります。当然ながら、事前の骨再建には追加の手術時間が必要となり、多くの場合、さらなる手術が必要となります。さらに、現在まで長期的なデータが不足しています。 ¹².

追加の骨移植を行わない組織工学は、移植細胞の軟骨形成能および骨形成能により、天然の関節軟骨の複雑な構造と特性を回復させることを目的としています。しかしながら、一般的に再生されるのは多かれ少なかれ軟骨組織のみにとどまります。さらに骨軟骨損傷がある場合は、別途、特定の治療が必要です。骨軟骨欠損の多層構造の再生を実現するためには、自家または同種細胞を播種した三次元組織工学製品が、優れた再生能力を提供し得る可能性があります¹¹。

自家軟骨細胞に加えて、間葉系幹細胞（MSC）は全層軟骨組織を構築するための魅力的な代替手段であると考えられています。数多くの前臨床in vitroおよびin vivo研究において、間葉系幹細胞は優れた組織再生能を示しています^13,14。特に骨軟骨欠損の治療において間葉系幹細胞が持つ重要な利点は、骨細胞および軟骨細胞の両方に分化する能力を備えていることです。したがって、欠損部位の多層的な再生を可能にする可能性があります。

そのため、近年、骨軟骨再生能を有するいくつかのスキャフォールドが開発され、有望な予備的結果とともに評価されています ^1,15-18。さらに、細胞キャリアとしてのフィブリン糊は、実験的な軟骨修復における好ましい手法の一つとなり、すでにいくつかの動物研究 ^19-21 や、さらには初期のヒト臨床試験 ²² においても成功を収めています。

以下のプロトコルでは、ウサギの骨髄から間葉系幹細胞を単離し、その後、細胞培養で増殖させ、フィブリン細胞凝集塊の標準的なin vitroモデルを調製するための実験手法を実演します。最後に、あらかじめ作製したフィブリン細胞凝集塊をウサギ膝関節の人工骨軟骨欠損部へ移植する手法について解説します。

プロトコル

間葉系幹細胞の単離のためのドナーウサギのA.準備（手術室）

細胞はオス4ヶ月歳の時にニュージーランドホワイト（NZW）ウサギ、約3キロ体重から分離されています。
プロポフォールで麻酔（10 mg / kg体重体重IV）を誘導し、ペントバルビタールナトリウム（100 mg / kg体重体重IV）を生け贄に捧げる。
電気クリッパー、真空毛皮で後肢、背中と腹から毛皮を剃る。
70％エタノールで完全に剃毛した領域を消毒する。
鈍鉗子、鋭いハサミ（またはメス）と組織や靭帯のための骨のカッターを使用してください。
足とふくらはぎの頭蓋の表面に沿って切開を行います。
どちら鋭いまたは鈍的切開によって皮膚や皮下組織を反映しています。
脛骨と大腿骨とは別の筋肉や靭帯。きれいな解剖を行うことが可能のような骨の近くにカットしてください。この時点で脛骨から大腿骨を分離しないでください。
THRをカットウワーッ寛骨臼から大腿骨頭を分離する股関節。
脛骨 - 大腿骨複合体を昇格。
骨から残りの軟部組織を掻きまたは滅菌布の組織と骨をこするように手術用メスの刃を使用します。この時点で、大腿骨および脛骨はまだ接続されている。
切断することにより膝蓋骨を外し、その後最終的に独立した骨に膝関節の靭帯を切った。
スプレーは、空気が乾燥させ、70％エタノールで骨を分離し、それらの潤いを保つために、細胞培養培地（DMEM + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン））で50 ml遠心チューブに各ボーンを配置。
今無菌細胞培養層流フードの下に切り替える。

骨と拡張からウサギMSCのフラッシュB.（細胞培養フッド）

チューブからの骨を収集し、滅菌ピンセットを使用して150ミリメートル皿にそれらを配置します。
両方の骨を取り除き、新しい150ミリメートル皿に無菌のこぎり、移動部分で終わる。
メディとを10mlの注射器を埋めるUM（DMEM）、18ゲージの針を取り付け、骨髄の開口部に挿入します。
その後、皿に骨髄をフラッシュする媒体と骨髄腔をすすいでください。可能であればその後、もう一方の端からすすいでください。必要に応じて、両端から多くを見送った。骨が壊れるべき場合は、単に骨の内部をすすいでください。
シリンジに細胞培地懸濁液を吸引除去し、サスペンションは骨髄腔と骨髄血栓が表示されない、さらに骨を通して自由に浮遊するまで繰り返し骨髄をすすいでください。
一度骨髄はすべて骨から収集された、18ゲージの針を通過することによって骨髄塊を乱す：針付属とシリンジを記入し、培地中に追い出す。
その後、50ミリリットルチューブに細胞フィルターを通してサスペンションをフィルタリング。セル損失を防止するために10mlの培地で培養皿の2倍を洗浄し、同様にこむ。
室温で5分間、500×gでサスペンションを遠心分離。
清と再懸セルペルを削除らを10mlの培地（DMEM + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）であった。
Biocoll分離ソリューションを使用して、末梢血単核細胞（PBMC）及び間葉系幹細胞（MSC）から独立した血液細胞。
を15mlチューブにBiocoll分離溶液5mlを記入し、慎重に室温で20分（ブレーキなし）のために800 xgで上部と遠心分離機に細胞懸濁液を5ミリリットルを追加します。
PBMCと間葉系幹細胞は、界面でのままBiocoll、底まで赤血球堆積物よりも高密度であること：可能な結果は、 図1を参照してください。
慎重を15mlチューブにインターフェイスを削除し、5 mlのPBSで洗浄する。
ステップ22で説明したように、遠心5ミリリットルのPBSに再懸と2〜3倍を繰り返す。
その後、室温で10分（ブレーキ付）、350 xgで再び遠心。
を10mlの培地に再懸濁し、血球のセルを数える。
150ミリメートルの皿で約5×10 ⁶の初期の播種密度でプレート細胞。
2-3日後、再非接着細胞を移動します。あなたは、細胞の破片を除去するためにPBS最初ですすぎが必要になる場合があります。その後、新鮮な完全培地（DMEM + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）を追加する。
3〜4日ごとに（ 図2）の細胞を養う。
5-10日後、経過初めて細胞。

in vitroでフィブリン塊のC.の準備

移植の日には、0.25％トリプシン-EDTAに3分露出でフラスコ/皿から接着細胞を解放。完全培地を追加することで、トリプシン処理を停止します。
50ミリリットルファルコンチューブで細胞を配布し、PBSで2回、それらを洗ってください。
トリパンブルー染色により細胞の生存と数字を決定します。
50,000細胞/マイクロ遠心チューブを追加し、室温で5分間、500×gで遠心分離によりペレットを収集します。必要に応じて、少なくとももう1つの塊のためにマスターミックスを準備します。
17μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、TISSUのフィブリノゲン成分を25μlのを混ぜてこの17μlのMSCサスペンションとCOL-キット。
in vivoでのドリル穴（ 図3）に基づき、事前ドリル穴（3x3.6ミリ）で滅菌プレートを取る。
まず、一番上に42μlのフィブリノゲン - 細胞懸濁し、再び4μlのトロンビン溶液の即時加え、続いて一つの穴の中に4μlのトロンビン溶液（500 IU / ml）を接種。ピペットチップ内凝固を避けるために、サスペンションを混在させないでください。まず、分取フィブリノーゲン細胞懸濁液50μlの体積は、表面張力により溶融せずにプレドリル穴の縁に突出します。しかし、完全に凝固した後（60分後）血栓は縮小していると事前ドリル穴に収まります。
PBSでマイクロ遠心チューブに鈍鉗子と場所を使用して慎重に血栓を削除します。 2血栓/動物を準備します。
手術室に血栓を取る。

フィブリン塊における同種間葉系幹細胞のD.の移植

プロポフォールの静脈注射（10 mg / kg体重）でウサギ（NZW、男性、3.5〜4.0キロの体重、5-6ヶ月）に麻酔を誘導する。
電気クリッパー、真空毛皮でログオン操作する膝を剃る。前に指定されたすべての手順は、手術室の無菌環境の汚染を避けるために手術の準備室で行われる。
挿管後、静脈内に1.5 mg / kg体重/分プロポフォール及び0.05 mg / kg体重/分フェンタニルで麻酔を維持します。カプノグラフィ、パルスオキシメトリと脈拍数を用いて麻酔を監視する。
徹底的に剃っているd膝を消毒、滅菌ドレッシングでウサギの残りの部分をカバーしています。
膝蓋骨を触診し、膝蓋骨に内側の皮膚切開を行います。
無菌条件下で内側parapatellar関節切開による膝関節を開きます。どんな小さな表在血管を切断しないようにしてください。
（ 図4）横方向に膝蓋骨を置換。
inspe後に任意の付随軟骨病変や関節の異常のために膝関節のctionは、ストップデバイスと無菌空気オペレーティングパワードリルと滑車溝に2つの骨軟骨欠損（ディープ3ミリメートル、8字型の図）（直径3.6ミリメートル）を作成（ 図5）。
欠陥をきれいにし、滅菌生理食塩水でそれらを洗い流してください。
移植の前に、欠陥にフィブリン糊の20μLを記入し、欠陥の底に均等に分配する。
その後血栓フィギュア8字型欠陥に圧入植え込む。
凝固後、滑車溝内膝蓋骨を再配置し、数回曲げると膝を伸ばす。
もう一度横膝蓋骨を置換し、フィブリノーゲン細胞塊の場所に残っているかどうかを確認します。
再び膝蓋骨を交換し、（両方吸収性縫合糸を持つ単一のボタン縫合（4-0 VICRYL）および連続皮膚縫合（4-0モノクリル）と層における創傷閉鎖で動作を終える材料）。
最後に、水蒸気透過性ドレッシングスプレーで傷を封印。
術後ケアのため、傷は7日間毎日チェックされます。ウサギは術後鎮痛カルプロフェン4 mg / kgを皮下毎24時間（4日間）とブプレノルフィン0.03 mg / kgを皮下毎12時間（2.5日間）のために受け取る。膝の安定化（ 例えばドレッシング）は必要ありません。