膜受容体の細胞外ドメインにsuperecliptic pHluorinをタグ付けし、培養マウスニューロンにおいてこれらの融合受容体をイメージングすることで、受容体の形質膜への個々の小胞挿入イベントを直接可視化することができます。本手法は、受容体の形質膜への挿入を制御する分子メカニズムを解明する上で極めて有用です。
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この記事について
サマリー
要約
原形質膜（PM）と細胞内コンパートメント間の受容体の輸送を支配するメカニズムの理解は、優れた空間的および時間的な解像度で実験的なアプローチを必要とします。さらに、そのようなアプローチは、細胞内区画のものからPMに局在受容体を区別する能力を持っている必要があります。各小胞が受容体の数が少ないを運ぶので、最も重要なのは、単胞の受容体を検出することは、卓越した検出感度を必要とします。と細胞の化学固定を必要とするため、十分な時間分解能1-6を欠いている免疫標識表面受容体の蛍光顕微鏡検査、、受容体の輸送を調べるための標準的なアプローチは両方必要な空間および時間解像度を欠いている生化学的検出、続いて表面ビオチン化が含まれています。これらの制限を克服するために、私たちと他の人が開発され、新しいストラを採用してきた7月17日優れた空間的および時間的な解像度でPMに受容体の動的挿入の可視化を可能にtegy。アプローチでは、受容体のN末端 細胞外ドメインにpH感受性GFP、superecliptic pHluorin 18のタグが含まれています。 Superecliptic pHluorinは、酸性pHで中性pH及び非蛍光液（pH <6.0）での蛍光性のユニークな特性を持っています。したがって、細胞内輸送小胞またはエンドソーム区画の酸性ルーメン内タグ付けされた受容体は、非蛍光性であり、PMの外表面に、細胞外pH中性の環境にさらされた場合にのみ、それらは容易に可視になります。当社の戦略は、結果的に私たちは細胞内輸送小胞の中でそれらからPM表面受容体を区別することができます。十分な空間的および時間的な解像度だけでなく、受容体の動的輸送を研究するために必要な感度を達成するために、我々は採用反映内部合計私たちは光イメージング（〜170 nm）の最適な空間分解能を達成することができイオン蛍光顕微鏡（TIRFM）は、ビデオレート顕微鏡（30フレーム/秒）、感度の時間分解能は、単一GFPの蛍光を検出する分子。 TIRFM下イメージングpHluorinタグ付きの受容体によって、我々は直接培養神経細胞におけるPMに個々の受容体挿入イベントを可視化することができました。このイメージングアプローチは、潜在的にsuperecliptic pHluorinで標識することができる細胞外ドメインを持つ任意の膜タンパク質に適用することができ、異なる膜タンパク質（受容体、イオンチャネル、トランスポーター、など）の挿入をするために、管理キー詳細なメカニズムの解剖を許可します午後。
プロトコル
1。神経培養エアコン用マウスグリア文化の準備
- T75フラスコは、コラーゲン溶液（蒸留H 2 O中Purecolの1:3希釈）でコーティングされています。フラスコを立設し、組織培養フード中で一晩乾燥させています。
- 解離バッファ（ACSF：119 mMのNaCl、カルシウムなし5mMのKCl、1mMのMgCl 2、30mMのデキストロース、25mMのHEPES、pH7.4で）やグリア培地（DMEM、10％FBS、10単位/ mlペニシリン、10 μg/ mlストレプトマイシン、およびグルタマックスは）℃使用直前まで準備し、4℃で保存されています。
- グリア文化の日に、グリアメディアがマウスの脳の解剖の前に37℃の水浴中で少なくとも30分間加温する。胚または新生仔マウスは、急速な断頭により安楽死させる。脳皮質を解剖顕微鏡下で解剖されています。
- 解剖した脳組織を37℃パパイン溶液（100mlパパインおよび2 ml郭清を緩衝液中の20μlの1パーセントのDNase I）°CのFOで消化されるR 20分。
- パパイン消化後、脳組織を10mlの予め温めグリアメディアでリンスしています。新鮮グリアメディア（2 ml）を消化した脳組織に追加され、組織はファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを用いて摩砕しています。
- 新鮮グリアメディア（8ml）を解離組織に追加されます。 70μmのセルストレーナ....
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ディスカッション
理由は不明ですが、マウスニューロンは常にラットニューロンよりも培養が困難です。私たちの経験では、マウス一次培養ニューロンにはニューロンとグリアの混合培養が有効です。しかし、このような混合培養はTIRFイメージング実験には適していません。なぜなら、このタイプの培養ではニューロンとその突起がグリア細胞の上に成長する傾向があり、ニューロンの細胞体や樹状突起がTIRF顕微鏡の届かない範囲に位置してしまうためです。したがって、TIRFイメージングには、カバーガラス上にグリアが少なく、ニューロンの密度が低い培養が理想的です。私たちはまずBanker法19;20を試しました。この方法では、培養皿の底にグリアを播種し、カバーガラスにニューロンを播種して、それを培養皿の中に逆さまに配置します。カバーガラスとグリア層は、カバーガラス上に置いた3つの小さなワックスの滴によって隔てられています。この方法は、小型のカバーガラス（15 mmまたは18 mmなど）ではうまく機能しますが、25 mmのカバーガラスを使用してテストしたところ、カバーガラスの中心付近のニューロンは、端付近のニューロンほど健康的ではありませんでした。
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
本研究は、ザ・ジャクソン研究所からのスタートアップ資金による支援を受けています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 精製ウシコラーゲン溶液 (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| ハンクス平衡塩溶液 (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14185-045 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (Pen Strep) | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| ピルビン酸ナトリウム | GIBCO, by Life Technologies | 11360-070 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO, by Life Technologies | 10313-021 | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| パパイン | Worthington Biochemical Corp. | LS003126 | |
| ウシ膵臓由来デオキシリボヌクレアーゼ I (DNase I) | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dulbeccoリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.05% トリプシン | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| ポリ-L-リシン臭化水素酸塩 | Sigma-Aldrich | P2636-1G | |
| ホウ酸 | Fisher Scientific | BP 168-500 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 無血清サプリメント | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| 不活化馬血清 | GIBCO, by Life Technologies | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| 培養用インサート | EMD Millipore | PICM03050 |
参考文献
- Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
- Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and syn....
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再版と許可
