海馬のインスリンおよびマイクロインジェクション<emインビボ&gt;</em空間記憶テスト中&gt;マイクロダイアリシス

サマリー

直接海馬内マイクロインジェクションによってhippocampally依存空間ワーキングメモリの変調は、同行と続くマイクロダイアリ。

要約

グルコース代謝には、2 - デオキシグルコースと機能的磁気共鳴画像法などの方法の基礎を形成し、局所神経活動のための有用なマーカーである。しかし、動物モデルでのそのような方法を使用します。麻酔を必要とし、それ故に両方が脳の状態を変化させ、行動措置を防ぎます。代替の方法は目を覚まし、気ままな動物におけるグルコース、乳酸、及び関連代謝産物の脳細胞外液濃度の連続測定を取るために生体内微小透析での使用です。特定の脳領域および/または急性薬理操作に依存するように設計タスクと組み合わせる場合は、この方法は特に有用であり、例えば、空間的ワーキングメモリタスク（自発的交替）時の海馬の測定値である乳酸の細胞外グルコースと立ち上がりで泳ぎを見せる強化された糖の^1,2の挑発、そして海馬内インスリン投与は、メモリを向上させ、海馬グリコールを増加させ、両方のysis ^3。インスリンなどの物質は、代謝物を測定するために使用されるのと同じマイクロダイアリシスプローブを介して海馬に送達することができる。海馬機能の尺度としての自発的交替の使用は、ストレスの多い動機（ 例えばフットショック）、拘束、またはタスクのパフォーマンスと代謝の両方を変更することができるすべては報酬（ 例えば食品）から任意の混同を避けるために設計されており、この作業も提供しています治療の非特異的な影響のための制御を可能にする運動活性の尺度。組み合わせることで、これらの方法は、行動を規制する神経化学的および代謝の変数の直接測定を可能にします。

プロトコル

1。手術の準備

1. 取り扱い。動物（最も一般的には、ラットやマウス、行動試験とマイクロダイアリシスとの組み合わせのための方法は、主に麻酔用など必要に応じて、必要な種特異的な適応、との一般的なものがあるが）少なくとも次の10分/日の最小値に対して処理されます手術の2日前まで。豊富な取り扱いが可能混同^2,4,5を避け^て 、テスト時にストレスのない状態で動物を残すことが示されている。ここでは、例の種として、このプロトコルを通してラットを使用します。これは最高の施設の獣医師や従業員の衛生当局と協議の上、素手を用いて達成することができる：取扱いは、 例えばラテックスやニトリル手袋から毛皮を引っ張ることによって引き起こされるストレスなく行う必要があります。これができない場合は、柔らかい綿の手袋はラットの毛皮を引っ張って回避するバリア手袋の上から着用する必要があります。
2. 滅菌野の準備。前に手術を始め、surgicへアルエリアが用意されており、滅菌野は、ラットの体温を維持するために使用される加熱パッドをカバーし、定位固定装置と装置間に配置され、無菌ドレープまわり用意。正確なサーモスタット付き循環温水パッドは動物の過熱を防止するために使用されます。
3. 麻酔導入。イソフルランイソフルラン気化器は、誘導室に接続された、最適なレベルを含むようにチェックされます。接続は閉じたループを確認するためにチェックされます。空調真空システムは、運用がチェックされます。イソフルラン気化のスイッチを入れ、動物は酸素混合の5％イソフルランを用いた誘導チャンバー内に配置されます、イソフルラン5％は100％の酸素の流れに加え、誘導室に配信されている。
4. 装置内に配置。動物はearbarsと歯バーを使用して定位固定装置に固定されている。 earbarsに沿って平らに不動の頭と耳で正しいearbar配置結果。動物急速に固定され、鼻が目的に合うように設計され麻酔ノーズコーンに挿入され、気化したイソフルランの配信が誘導室からノーズコーンに行く酸素ストリームにイソフルラン2-3％を提供するように調整ノーズコーンおよび麻酔ミックスに切り替えられます。
5. 麻酔の確認。外科麻酔面は足と​​目への空気のパフにハードピンチを提供することによって確認された。どちらも任意の応答を引き起こすべきです。これらのテストは、手術麻酔面の維持を確認するために手術中に約15分間隔で繰り返されます。髪は無菌領域に入る前に切開部位から除去されます。

2。手術

1. 動物の初期治療。眼軟膏は乾燥を防ぐために、各眼球に適用されます。 1ミリリットル滅菌生理食塩水は、手術中に脱水症状を防ぐためにSCを与えられ、体は、滅菌ドレープで覆われている。ベタジンは、頭皮に塗布し、中心からスワブさ外に綿棒で、70％エタノールを同様にスワブされてお​​り、両者のスワブ手順が適切な切開部位を確実にするためにさらに2回繰り返しています。ベタジンおよびアルコールのために皮膚への接触時間は、切開の前に少なくとも3分でなければなりません。麻酔が維持され、手術中、定期的にチェックされます。鎮痛を開始するために与えられているカルプロフェン5グラム/ kgを単回皮下注射）と、無菌技術が使用されます。鎮痛は、注射から任意のストレスを最小限に抑えるために、麻酔導入の後に指定されています。
2. 切開し、頭蓋骨の準備。 3〜4cmのカットは、頭蓋骨の中心にsagitally作られています。 bupivicaineの1:1混合：エピネフリンは、さらに鎮痛作用を提供し、出血を最小限に抑えるために局所的に適用される。頭皮は外科用クリップを使って切開部から離れて保持され、滅菌綿棒は、頭蓋骨から上層膜を除去するために使用されています。掘削のための座標が基準点としてブレグマを用いて測定され、無菌ドリルビットを（あるいは、手持ち焼灼デビ使ってマークCE）、掘削を開始する前に精度のために再確認した。興味のある特定の脳領域（ 例えばここ海馬）の座標は、脳アトラスを用いて決定される。海馬微小透析のために、私たちはブレグマ、横5.0、および硬膜から腹3.0〜5.6ミリメートル後部でのドリルサイトを使用します。
3. 掘削。三穴は硬膜と下層膜への外傷が最小限か、または存在しないよう、最小限の力を加えるように気とられてて、頭蓋骨にドリルで開けています。一つの穴は、カニューレ挿入の測定されたサイトにある、他の2つは、頭蓋骨のネジを挿入するための便利なように配置されている。目的サイズのねじ（ 例えば 1.17ミリメートルセルフタッピングネジ;ファイン科学ツール）が下に脳に影響を与えることなく、これらの穴に挿入され、その後の歯科用セメント·アプリケーション用のアンカーポイントとして使用されます。
4. カニューレの配置と閉鎖。カニューレは穴ドリルのサイトであることが再確認された挿入座標、、に位置しているその後徐々に目標深度まで下げられる。一度正しく配置、カニューレは歯科用セメントで所定の位置に固定されています。必要に応じて、単一の滅菌外科用縫合糸は、創傷を閉じるために使用されます。スタイレットは開存性を維持するために、カニューレに挿入されます。このプロトコルでは、CMA12プローブとガイドカニューレ（CMA /マイクロダイアリシス）を使用します。
5. 急性術後ケア。 3ミリリットル滅菌生理食塩水は、水和を継続するためにSCを与えられる;カルプロフェン5グラム/ kgを単回皮下注射）も鎮痛を開始するために与えられている。彼らは完全に麻酔から回復されるまで、動物は、装置から取り出し、清潔なケージで、温められた回復室に配置され、監視されています。完全な回復が反射し、通常の歩行を正すの回復によって評価される。動物はその後、自宅のケージと正規保持室に戻ります。
6. 短期的なフォローアップケア。手術を受けた動物のケージは、手術の日付が付いています。動物は、少なくともThrを少なくとも1日に1回監視されているeeは、手術後の数日間、手術と2次の日のそれぞれ翌日1カルプロフェンチュアブル錠（2mg）を与えられた。動物はカルプロフェンを消費していない場合は、注射カルプロフェンは十分な鎮痛を確保するために与えられるかもしれません。動物の全体的な健康状態や制度動物ケアガイドラインに従って、必要に応じて、動物のケアスタッフや獣医師からの支援や助言を求める創傷部位（感染症、発赤等）の状態の両方を監視します。重要なことは、実験者への適切な取り扱いと馴化が不可欠であることに注意してください：実験者によって処理するとき緊張やストレスの兆候がなくなるまでの動物は、カニューレの操作を含む、広範囲に処理する必要があります。
7. その後の動物のケアと治療。動物は、承認されたプロトコルとその特定の実験群に応じて適切なテストおよび安楽死手順に従います。

3。マイクロダイアリシス（MD）

1. Perfus準備を食べました。人工細胞外液（aECF）は153.5 mMのナトリウム、4.3 mMのK、0.41 mMのマグネシウム、0.71 mMのカルシウム、139.4 mMのはCl、pH7.4の⁶で緩衝1.25 mMグルコース、で作られています正確な流体組成物が不可欠であることに注意してください。不正確または使用例えば、リンゲルやマイクロダイアリシス用PBSなど、それ以外のあまり生理的流体が著しく誤った結果が⁶になります。具体的には、我々は海馬ECF ⁶の2004の詳細な研究で示したように細胞外液（ECF）のイオン組成は、CSFのと同じでないことに注意してください。試験当日は、（BSA）のウシ血清アルブミンを2％（重量/重量）で加え、完全に溶解されるべきであるが、これはそのような固執からチューブへのインスリンとしてのペプチドの損失を低減し、また、流体損失の危険（限外ろ過）を低減プローブ膜で。調製後、灌流液を0.2μmのフィルターでろ過しなければならない。
2. インスリンなどの治療は、ブラジャーに配信される場合関心領域（ここでは海馬）で、適切な薬物濃度を用いてプリペアドaECFのアリコートを使用して、この治療法を準備します。インスリンは、逆マイクロダイアリシスを介した配信のために400 nMの濃度（66.7μU/μl）を海馬の代謝および認知機能⁷に影響^を与えること^が示されている。インスリンの結果として組織内濃度は、ここで測定され、未知のままでないことに注意してください。
3. MDプローブや線を設定。新鮮なマイクロダイアリシスプローブとラインテストの前日に準備をします。 "流入"と "流出"の2つの別々の行を作成します。 FEPチューブの2 1メートルの長い部分を接続し、ライン間の最小のデッドスペースがあることを確認するためにPE50チューブを使用してください。無菌濾過し、脱イオンH _{2 0（2} 0 DH）を充填した1ミリリットルハミルトンシリンジへ流入配管を接続し、プローブに取り付けます。
4. マイクロダイアリシススイベル。測定をしながら自由に動物の動きを可能にするために、iに液体スイベルを接続nflowと流出ラインは、追加のFEPチューブを使用して、ポンプの近隣にあります。試料捕集（下）のタイミングを考える際に考慮に入れ、このスイベルやチューブの内容積を取ることを忘れないでください。
5. MDポンプを設定。 MDポンプをオンにして_、2 0、プローブに流出管から出るdHが表示されるまで、1.5μL/分で動作します。ポンプの電源がオフになっている間に、次に、流出管及び試料採取管の間に他の線を接続します。チューブを通して5ミリリットルを実行し、無菌のdH ₂ 0一晩を含むバイアルにプローブを配置し、プローブの先端が常に湿ったままであることを確認してください。
6. プリプロービング被験者。試験前24時間は、ラットの頭からダミースタイレットを除去し、10分間MDプローブ（この目的のためではなく、サンプリングのためにのみ使用される）を挿入します。その後ダミースタイレットを交換して、そのケージに戻しラットを入れた。この手順は、テスト⁸の日に、私たちの手の中に反応性グリオーシスの影響を最小限に抑えるように設計されており、これは良いresulを与えるtsはその他の技術からのデータを照合し、海馬の活性化^2,5,7,9を反映し^ているものもあれば、また良いアプローチである測定に先立ち、24時間の場所にプローブを残し同様のアプローチを使用した場合の損傷プローブは一晩を避けることができます。
7. プローブ平衡。マイクロダイアリシスの当日、1時間平衡に通して濾過しaECFとポンプでハミルトンシリンジとシンチレーションバイアルを埋める。必要に応じて、準備された治療法（例えば、インスリンaECF）、シリンジポンプに場所を有する第2のハミルトンシリンジを埋める。
8. プローブ挿入。平衡化が完了したら、ダミースタイレットを取り外し、ゆっくりとカニューレを介してラットの脳に平衡化したMDのプローブを挿入します。ラットの自宅の布団の一部が含まれています透明なプラスチックの箱にネズミを配置します。重力がmicrodiを保持するように、ケージの外管に水を充填した1.6ミリリットルマイクロチューブを取り付ける：チューブが相殺することを確認してくださいalysisラインはunkinkedしかし張りつめていない。プローブは2時間のラットで平衡化しましょう​​。この期間の開始時に、灌流液のその流れがブロック解除されたことを確認：これは最も簡単に定義された期間にわたって灌流液流出を集めると予想されるボリュームは、システムを終了していることを確認するためにサンプルを秤量することによって行われます。利回りは<90体積％の予想、取り外しおよび再挿入した後に自己修正するものではありませんが、交換しなければならないことをすべてのプローブ（プローブ·チップでそうでなければ浮腫が発生します）。流れが持続的に低いかまたは存在しない場合は、漏れのためにすべての接続をチェックしてみてください。、閉塞を単離することができるかどうかを確認する段階でチューブを切断することができなかった。問題が特定できない場合には、プローブを交換して、問題が解決しない場合は、新しいプローブと3.3節線で新たに起動する必要があるかもしれません。 2時間平衡期間は、プローブの周りに封印し、プローブ挿入のいずれかの急性効果を避けるために、血液脳関門を許可します。
9. サンプルを収集する。ことを確認して共同サンプルの透析（脳から）とコレクション（チューブに）間rrelationを正確に計算されます。例えば、スイベルとプローブ間のFEPチューブの2メートルを使用して、プローブおよび30μlのコレクションの間の総ボリュームがあり、したがって、それは、プローブ、チューブ、コネクタを通過するように1.5μlのサンプル/ minの流量で20分かかりますとコレクションのためにチューブの端に到達するために旋回。サンプル採取は、あなたのアッセイに必要な濃度を持っているために十分な量を集めることを保証します。ここでは、5分間のサンプルビンを使用するでしょう、そして、その結果、それぞれのコレクションチューブに透析液の7.5μlを収集します。
10. ベースラインのサンプル。平衡化が完了したら、サンプル収集を開始します。ラットは、測定値の安定したベースラインを確立するために家庭室で休息している間、少なくとも3つのサンプルを収集
11. 治療のタイミング。実験前に治療の開始のために必要なタイミングを計算するために世話をする：透析の間にタイムラグがあるのと同様、ことを覚えておいてくださいとサンプル採取は、灌流液シリンジを残して、動物の海馬に到着するまでのタイムラグ（通常は同じ）がある。したがって、注射器とプローブ間の30μlの体積とのセットアップでは、海馬に到着し始めるために治療を希望する前に、その含まれている治療灌流20分に注射器を変更してください。
12. シリンジを変更。液体スイッチは、必要に応じて使用されるが、必須ではありませんすることができます適切な時期に、単に制御灌流シリンジから流入ラインを切断し、迅速に治療灌流液のシリンジに接続します。これは、灌流液の流れにかなりの中断を回避するためには、5秒以上を取る必要があります治療の期間限定配信が望まれているなら、所望の投与量が、配信された後、このプロセスが逆になることに注意してください 。あるいは、治療（ 図2を参照）は、サンプリングの期間継続することができる。気泡はスイッチング時のラインに導入するべきではありません注射器は、彼らは透析膜に蓄積し、プローブの効率を低下させる可能性がある。
13. 行動試験。行動のタスクを実行する場合は、（以下のセクション4を見てください）その手順に従ってください。海馬に対する治療の配信との連携が重要であることに注意してください 。例えば、インスリンの配信が始まる前に、試験¹⁰から¹⁰分に行われるようにタイミングを合わせる必要があります。したがって、インスリン含有灌流液への切り替えは行動試験（灌流のための20分は先にテストの行に加えて、10分間の配送希望時間を通過する）の前に30分を発生する必要があります。
14. サンプル収集が完了したとき。希望するサンプルを収集した後、そっと再び透析とサンプル採取の間でアカウントのタイムラグを考慮することを忘れない、動物の頭からプローブを削除。そのホームケージに動物を戻すと動物が殺され、脳が正しい確認するために除去されるまで、健康や行動のいずれかのポスト実験的な変化を注意深く観察するプローブ配置。犠牲はすぐに発生しない場合には、異物の任意の導入を避けるために、カニューレにダミースタイレットを返す。
15. 分析。分析方法は、関心のある検体（S）によって異なります。透析のサンプリングプローブ膜で完全な検体の平衡を許容しないため、サンプルの濃度はゼロ正味フラックス法^11,12を使用^して ECF濃度を与えるように修正する必要があります。

4。行動試験

1. 迷路上に配置。ベースライン試料（ すなわち 、少なくとも3試料は透析を完了しているが、それでも収集される流出配管であってもよいの後）した後、静かに行動試験装置にラットを移動します。任意の適切なタスクを使用することができる。 図1のデータは、次の4つの腕十字型迷路を用いて、空間的ワーキングメモリの尺度で自発的交替を測定収集した：ラットは最初CENに配置され自由に^9,13探索する迷路のterおよび許可された。任意の行動試験を用いることができるため、このプロトコルの焦点は、特定のタスクにここでは例として使用されていない（他に^9,14,15詳述されている）が、要するに、動物を迷路（期間を探索する許可されている図1の灰色のボックス）と腕が最近訪問されているそのうちのメモリを保持するhippocampallyに依存するプロセスを使用しています。
2. テスト中に透析チューブの動き。それはどちらもネズミの動きを妨げることも、動物の目の前に移動し、それをそらすために許可されて、自由に動くようにチューブを保持します。場所に滞在して、ラットの行動に影響を与えないように、自分自身の動きを最小限に抑えます。
3. 継続的なサンプル収集。ベースライン時のように、5分毎に新しいコレクションチューブに流出配管を移動します。
4. 交代テスト。動物が自由に20分間迷路を探索することができます。使用して、いずれかのアームのエントリの順序とタイミングを記録ビデオ録画以降のタスクのパフォーマンス分析のための^9,15手で。

5。事後テスト

1. 最終的なサンプル収集。テストに続いて、チャンバーを制御するために迷路とリターンから優しくラットを削除します。タスクパフォ​​ーマンスからの回復の期間をカバーするために、少なくとも4つのサンプルのための微小透析サンプル収集を続行します。
2. プローブの除去。すべてのサンプルが収集された後、穏やかに貯蔵バイアル中に動物の頭と場所からプローブを削除であり、そのホームケージに動物を返す。
3. プローブストレージ。ホームケージに動物を返すと、残りの透析液の収集が完了したら、DH ₂ 0とdH ₂ 0で満たされて、パラフィルムで覆われたシンチレーションバイアル中の店舗で徹底的にプローブをすすいでください。微生物の増殖を防ぐためのdH ₂ 0で1:10,000カトンの溶液を含有する注射器に切り替えることにより、チューブをフラッシュします。彼らは良い流れを維持しているようにプローブがあれば、再使用することができる膜への損傷;ケアこれには、日常的に使用する10を超えてはいけません。
4. 組織学。動物を殺し、脳を取り外します。クライオスタットのスライスと正しいプローブの配置を確認するために、標準組織学的技術（ 例えばクレシルバイオレット染色）を使用します。

結果

ラットは手術から急速に回復し、麻酔の中止後30分以内に、アラート運動性とアクティブになっているはずです。手術がきれいに行われ、最小限の歯科用セメントが使用されている場合はカニューレのキャップの影響は最小限であるべきです。感染の兆候は、手術後の監視中に気づいた、またはラットは苦痛や不快感の兆候を示してどのような方法でもあり、すぐに実験を終了している場合、これは非常にまれであるはずです。試験前に処理中に、動物は、アラート自由に運動し、フレンドリーで好奇心旺盛であるべきである。よく取り扱う動物は、基本的に手術、手術後の回復、あるいは実験者の存在から残りの観察可能なストレスを持つべきではない;プラズマストレスホルモンを測定することにより必要に応じてこれを確認することができます（エピネフリン、グルココルチコイド）、および/ ​​またはグルコース^{2,4 、5。}

脳ECFのグルコースは、範囲、典型的には0.5 - 1.5 mMの、脳の領域によって変化する、高い値であるが糖尿病動物で見られるかもしれません;海馬で、ベースラインのグルコース濃度は1.25 mMの^6...

ディスカッション

微小透析で使用されるすべてのソリューションは、0.2μmのフィルターを用いて、直ちに使用前にフィルタリングする必要があります。ガイドカニューレにプローブを挿入した後、その流れが妨げられており、サンプル採取が行われていることを確認するために守ってください。流れが挿入後に停止した場合、最も可能性の高い原因は、挿入時に不十分なケアによって生じるプローブ膜への損傷であり、新鮮なプローブは、置換されている必要があります。

上述しましたように、これらのメソッドへの鍵となる利点が目を覚まして、自由に移動する動物での行動と神経化学的両方の対策を可能にして、混乱させるの欠如である：これを活用するために、試験前に大規模な処理は動物が中に強調されていないすべきことを命ずることが不可欠である測定。平衡期間は一般的に安定した代謝のベースラインを提供するのに十分であるが、動物全体で均一な血糖値を確保するために必要に応じて食品は試験前に1〜2時間のために削除されることがあります。

木曜日電子サンプリング手法としてMDの2つの最も重要な制限は、（i）制限検体...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
			試薬の大半は標準的な実験用グレードであり、選択肢のサプライヤーから入手することができます。同様に、このようなシリンジポンプと配管などの機器は、複数のメーカーのいずれかから使用することができます。詳細は重要であるためここでは、特定の項目が含まれます：
CMAは12マイクロダイアリシスプローブ	CMA /マイクロダイアリシス	CMA-12-XXX	これらは中に特定のコードが示す各種膜の長さとカットオフでご利用いただけます "XXX"。
ヒトインスリン（ヒュー）	イーライリリー	N / A
液体スイベル	インステック	375/D/22QM	この特定のスイベルは、非常に低トルクと内部容積ならびにnonreaを持つctive石英ライニング。