このような神経筋接合部（NMJs）で端末シュワン細胞（SCS）と密集した組織内の個々の細胞を可視化に挑戦している。 "シーケンシャル光退色"漂白シーケンシャルはタイムラプスイメージングと組み合わせることができますオトガイ三角胸骨筋の外植片、便利な神経筋標本において、例えば、単一のターミナルSCを、輪郭を描くことができ、事後免疫染色。
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この記事について
サマリー
要約
光退色シーケンシャルNMJで個々のSCにラベルを非侵襲的な方法を提供します。 NMJは、哺乳動物の中枢神経系の最大のシナプスで、シナプスの構造と機能を研究するためのモデルを導く務めている。マウスNMJsモーター軸索末端の筋肉の繊維とプレッツェル状の接触部位を形成する。モーター軸索とその端子は、SCSによって覆われている。過去数十年にわたって、いくつかのトランスジェニックマウスは、それぞれTHY1-XFP 1、PLP-GFPマウス2例えば、運動ニューロンおよびSCを可視化するために生成されています。
運動軸索に沿って、軸索のミエリンSCは跳躍活動電位の伝播を可能にするために、ランヴィエ絞輪で区切られた、非重複節間に配置されている。これとは対照的に、シナプスの端末SCは監視と神経伝達を促進し、破片やガイド再生軸索を消化する特殊なグリア細胞である。 NMJsはしっかり半ダース非myelまでで覆われているターミナルSCをinating -彼らが直接膜接触3にあるように、これらは、しかし、個々に、光学顕微鏡では解決できません。
いくつかのアプローチは、個別の端末SCを可視化するために存在しています。これらのどれとはいえ、完璧なありません。例えば、単一の細胞が色素充填微小電極で突き刺さアール染料充填は、2つ目を充填する前に標識した細胞を破壊する必要があります。これにより、その後の時間経過の録音3と互換性がありません。 SCのマルチスペクトル"Brainbow"標識は、蛍光タンパク質の組み合わせ式4を使用することによって達成されてきた。しかし、この手法にはいくつかの導入遺伝子を組み合わせることが必要であり、使用されるプロモーターの発現パターンによって制限されます。将来的には、SCの中で"光切替可能な"タンパク質の発現は、さらに別の代替5かもしれない。ここでは、順次、光退色単一の細胞が漂白されている場所、および減算によって得られたそれらのイメージを提示する。我々は信じているこのアプローチという-その使いやすさと汎用性に起因する-それがインビボで使用され、他の細胞型、解剖学的部位や種6に転送することができ、特にとして、神経科学者の技術パレットに恒久加算を表しています。
オトガイ三角胸骨筋の外植片で端末のSCに、以下のプロトコルでは、我々は詳細漂白シーケンシャルおよびその後の共焦点タイムラプス顕微鏡法の適用を。これは、薄い表面的で簡単に解剖神経筋標本7,8 NMJ開発学、生理学、病理学9の研究のために有用であることが証明されました。最後に、我々はオトガイ三角胸骨筋が相関の高分解能共焦点イメージング、免疫組織化学や超微細構造検査を実行するために固定した後に準備される方法を説明します。
プロトコル
1。オトガイ三角胸骨外植片（ 図1）
タイミング：15分。
- 鉗子の2ペア、はさみの1ペア、春のはさみの1ペア、1組織培養皿（10センチ）：手術器具を準備します。 （15分間以上）事前バブリング冷却（4℃）を5％CO 2/95％O 2でリンゲル液。氷で15cmの組織培養皿を記入し、金属板とそれをカバーしています。解剖顕微鏡を準備し、解剖時に外植片を冷却するために、解剖用スコープの下に氷で15 cmの皿を置きます。
- 致死量のイソフルラン過剰摂取（または犠牲の他の承認された方法）によって、マウスを麻酔。外植片の毛皮の汚染を防止するために、70％エタノールでマウスを吹き付けます。 SCは漂白のために、我々は軸索の同時可視化のためTHY1-OFP3またはTHY1-Membow13には交雑可能PLP-GFPマウスを使用していました。
- 大きなはさみのペアを使用して、の正中切開を作る胸骨と肋骨の下縁に平行な2つの切開の上の皮膚。
- 大きなはさみのペアを使用すると、皮膚を除去腹壁を開き、脊柱に戻ってすべての道を胸郭に切開が平行する。その後、胸骨の筋肉の挿入に近い切開を行うことで、胸筋を切っ解剖。
- ただ剣状軟骨下オープン横隔膜をカットし、その沿岸に沿って挿入ダイアフラムをオフに解剖する。
- 鉗子のセ....
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結果
イメージング皿の準備オトガイ三角胸骨植片の例を図1Gに示されている。オトガイ三角筋は筋線維のいくつかの層からのみ構成されていますので、この外植片は、イメージングNMJs エクスビボのために特に適している。これは、いずれかのSC（PLP-GFPの2）および/ または軸索（THY1-XFP 1）を強調するトランスジェニックマウス系統由来の外植片から高解像度の画像を得ることができる。高品質のイメージングのための重要な要因には、（i）筋線維の損傷を防止するための植準備中にオトガイ三角筋に触れて回避する、（ii）（> 37（ⅲ）過熱していないサンプル、深さに関連した収差を低減する表面的で平らなシナプスを選択注意深くサンプルを触れないように灌流チューブおよび温度プローブを配置する（V）だけでなく、K;°C）とサンプルがよく酸素を維持し、（iv）は、潜在的にドリフトや振動を低減するために撮像中に灌流を停止ドリフトを防ぐために乾燥した皿の裏側をeeping、（vi）のコントラストを最大にするために、オフターゲット.......
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ディスカッション
ここに提示され、SC漂白方法は、簡単で高速かつ汎用性があります：（i）はそれは、単一の導入遺伝子をもとに共焦点顕微鏡によって、単一のSC形態とダイナミクスを明らかにすることができます-追加の対立を必要とする疾患モデルとアプローチなどを組み合わせたときに重要な利点である。解剖から固定には半日で行うことができるように（ii）の方法は、迅速である。それはこのような細胞切除、イメージング小器官、電気生理学や免疫組織化学などの他の方法と組み合わせることができますように（ⅲ）出願件数は、広いです。さらに、ネズミNMJsでSCにここに提示されたアプローチは、他の細胞、組織、または種に一般化することができる - ゼブラフィッシュにおける関連技術の応用の一例は、参考文献6に示されている。また、GFP以外の蛍光タンパク質は、例えばYFP又はCFPのために、漂白とタイムラプス顕微鏡に使用することができます。我々は、SCS、bleachiでこれらの蛍光タンパク質を使用していないものの軸索のngは、この設定ではあまり安定した蛍光タンパク質（ 例えば CFP）が有利で あることを示しています。しかし、漂白効.......
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
私たちは、優れた技術支援にマヌエラBudak、Ljiljana MarinkoviとクリスティーナWullimannに感謝したいと思います。我々は、PLP-GFPマウスを提供するためのW·マックリンに感謝します。アレクサンダー·フォン·フンボルト財団、国家助成機関（ "エリーゼのためBundesministerium Bildung undのForschung"により、TMはドイツ学術振興（Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG）による高等研究所（ミュンヘン工科大学）によってサポートされています）ERA-Netのニューロン "iPSoALS"と "2光子イメージング"の枠インチTMとMBが統合蛋白質科学研究センター（ミュンヘン）によってサポートされています。 PMは、ミュンヘン工科大学（TUM-GS）の大学院によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名称 | 会社（例） | カタログ番号 | コメント（オプション） |
| 70％（vol / vol）のエタノール溶液 | ロート | T913.1 | スプレーボトルで |
| イソフルレン | Forene、アボット | 他の承認された麻酔薬を致死量の麻酔に使用することができます | |
| トランスジェニックマウス（PLP-GFP） | 引用した情報源から得られる | ||
| 冷光照明を用いた解剖顕微鏡 | オリンパスSZ51 | Schott社KL 1500液晶搭載 | |
| 鉗子＃2 | ファイン科学ツール | 11233から20 | |
| 鉗子＃5 | ファイン科学ツール | 11295から00 | |
| はさみ、大規模な医療 | ファイン科学ツール | 14108から09 | |
| はさみ、小さな角度の春 | ファイン科学ツール | 15033から09 | |
| インラインヒーター | ワーナー·インスツルメンツ | SF-28 | |
| 3.5 cmの皿のために加熱リング | ワーナー·インスツルメンツ | 64から0110のDH-35 | |
| 2チャネルの温度制御システム | ワーナー·インスツルメンツ | TC-344B | |
| 灌流ポンプシステム | 特注の | ||
| 15cmの組織培養皿 | ザルスタット | 83.1803.003 | 氷で満たされて、金属板で覆われて |
| 10cmの組織培養皿 | ザルスタット | 83.1802.003 | 酸素化リンゲル液と |
| 3.5 cmの組織培養皿 | ザルスタット | 83.1800.003 | シルガードポリマーを充填 |
| シルガードポリマー | ダウコーニング | シルガード184シリコーンエラストマーキット | |
| 共焦点顕微鏡 | オリンポス | FV1000 | アルゴンレーザーと |
| 50mlの反応管 | ザルスタット | 62.547.254 PP | |
| PBS中4％PFA | シグマ | P6148 | |
| カニューレ0.5ミリメートルX 25ミリメートル | Neolab | E-1510 | |
| 注射器1ミリリットル | Neolab | E-1496 | |
| シナプトフィジン抗体 | インビトロジェン | 18から0130 | ウサギ |
| 二次抗体 | インビトロジェン | - 11012 | アレクサ594 |
| 24ウェルプレート | ザルスタット | 83.1836 | |
| 0.01MのPBS | シグマ | P4417 | |
| PBS中の0.1 Mグリシン | ロート | 3790.1 | |
| カバースリップ | Neolab | E-4132 | |
| スライド | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | ベクトルラボ | H-1000 | |
| minutienピン×10 | ファイン科学ツール | 26002から20 | <4 mmに短縮 |
| α-ブンガロトキシンアレクサ594に結合された | Invitrogen社（Molecular Probes社） | B-13423 | |
| ブロッキング溶液 | |||
| 0。01 M PBS | |||
| 0.2％トリトン-X100 | ロート | 3051.3 | |
| 10％正常ヤギ血清 | アブカム | ab7481 | |
| 1％ウシ血清アルブミン | シグマ | A7030 | |
| リンガー 95％O 2/5％CO 2でバブリング | |||
| 125 mMのNaCl | シグマ | S7653 | |
| 2.5mMのKClを | シグマ | P9333 | |
| 1.25mMののNaH 2 PO 4 | シグマ | S8282 | |
| 26 MMのNaHCO 3 | シグマ | S6297 | |
| 2mMのCaCl 2 | シグマ | 21114 | |
| 1mMのMgCl 2 | シグマ | 63020 | |
| 20mMグルコース | シグマ | G7528 | |
表1に特異的な試薬や機器。 |
参考文献
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid pro....
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再版と許可
