凍結ヒトES細胞

サマリー

ここでは私たちの研究室ではヒト胚性幹細胞株の色合いをフリーズする方法を示します。

要約

ここでは私たちの研究室ではヒト胚性幹細胞株の色合いをフリーズする方法を示します。健康、指数関数的に拡大培養は、特にトリプシン反応を停止可能性が残存するメディアを削除するには、PBSで洗浄する。温めた0.05％トリプシン- EDTAは、細胞をカバーするために追加され、プレートは最高室温で5分のインキュベートを許可されます。この時間の間に細胞が丸めを観察し、コロニーがプレート表面上に持ち上げすることができます。穏やかな繰り返しピペッティングは、プレート表面から細胞とコロニーを削除します。トリプシン処理細胞は、残りのトリプシンをクエンチするために予め温めておいたhES細胞の培地を含有する標準のコニカルチューブに入れ、その後スピンしている。細胞はメディア、ある冷凍分量は10cmのプレートに文化を復活させるのに十分であるような濃度の1枚のMLで約100万セルの濃度で増殖培地を再懸濁する。細胞が十分に再懸された後、氷冷凍結のメディアは、同じボリュームで追加されます。細胞懸濁液は、十分に混合し凍結バイアルに分注し、ゆっくりと24時間かけて- 80Cに凍結することが許可されています。凍結細胞は、長期保管のための液体窒素の気相に移動する、または約半年-80のままでかまいません。

プロトコル

1. 健康、指数関数的に拡大培養は、特にトリプシン反応を停止可能性が残存するメディアを削除するには、PBSで洗浄する。
2. 温めた0.05％トリプシン- EDTAは、細胞をカバーするために追加され、プレートは最高室温で5分のインキュベートを許可されます。この時間の間に細胞が丸めを観察し、コロニーがプレート表面上に持ち上げすることができます。
3. 穏やかな繰り返しピペッティングは、プレート表面から細胞とコロニーを削除します。
4. トリプシン処理細胞は、残りのトリプシンをクエンチするために予め温めておいたhES細胞の培地を含有する標準のコニカルチューブに入れ、その後スピンしている。
5. 細胞は、メディアの1枚のMLで約100万セルの濃度で増殖培地を再懸濁する。
6. 細胞が十分に再懸された後、氷冷凍結のメディアは、同じボリュームで追加されます。
7. 細胞懸濁液は、十分に混合し凍結バイアルに分注し、ゆっくりと24時間かけて- 80Cに凍結することが許可されています。
8. 凍結細胞は、長期保管のための液体窒素の気相に移動する、または約半年-80のままでかまいません。

注：106細胞/ mlの濃度でそのような冷凍アリコートを10cmのプレートに文化を復活させるだけで十分です。

ディスカッション

我々は凍結色合いの細胞株に対して説明する手法は、効率的に色相の細胞株とでも関心の任意の哺乳動物細胞の保存と復活に適しています。核型の異常が発生する可能性があると異常な細胞が迅速に行を引き継ぐことができるように、ヒトES細胞株を扱う場合、各継代時の細胞の小さな割合をフリーズすると、重要な考慮事項です。従って、冷凍は特定の通路で、大手銀行に加えてすべての通路に分割持つことは非常に望ましいです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HuES培地	培地			合計651.5 mLにするために以下を加える： 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA + 0.6 µL β-メルカプト–エタノール (14.3 M ストック溶液) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (最終濃度 ~10 ng/mL)
凍結培地	培地			80% FCS (ウシ胎児血清) + 20% DMSO (ジメチルスルホキシド)。4 °Cで保存。