同時に右心機能、肺の炎症、免疫応答を調査するために具体的かつ迅速なプロトコルが学習ツールとして記述されています。ビデオおよび図は大型の研究に小さなために使用されるのに適応され組織されたチーム·アプローチでは、生理学や顕微解剖の手法について説明します。
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方法論記事
肺およびマウスにおける免疫組織サンプルの収穫との組み合わせで右室収縮期圧測定
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
右心の機能は、このように右心生理学と肺血管生理学をつなぐ、肺から血液を送り出す事である。炎症細胞浸潤は、サイトカインや成長因子の産生を起草によって、リモデリングプロセス1を開始することによって、心臓や肺の機能の一般的な修飾子です。
左心室に比べて、右心室は圧力変化の比較的狭いゾーンで動作する低圧ポンプです。増加した肺動脈圧、肺血管床および肺高血圧2の圧力の増加に関連付けられています。肺高血圧症は、多くの場合、炎症性肺疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患、または自己免疫疾患の3に関連付けられています。肺高血圧症は、生命と平均余命の質のための予後不良を与えるので、多くの研究がそのMIGメカニズムを理解に向けられているhtは、薬学的介入のための目標である4。肺高血圧症のための効果的な管理ツールの開発のための主な課題は、右心、肺、免疫系の分子や細胞の変化の同時理解の複雑さのままです。
ここでは、マウスの右心内の圧力変化を迅速かつ正確に測定するための手続きのワークフローや心臓、肺、免疫組織からのサンプルの同時収穫を提示します。メソッドが最初に肺動脈5-13の圧力の代理指標として、1990年代後半に開発されたクローズ胸マウスにおける頸静脈を介して右心室の直接カテーテル法に基づいています。主催チームのアプローチは非常に急速な右心カテーテル法を容易にします。これにより、自発的に部屋の空気を呼吸するマウスで測定を行うことができます。異なる作業領域で作業の流れの組織時間遅延を低減すると同時に、生理学実験や収穫免疫、心臓と肺の組織を実行する可能性を開きます。
ここで概説手続きワークフローが大きい薬剤スクリーニングアッセイには、小さなターゲットの実験から、実験室の設定や研究デザインの多種多様に適合させることができる。心エコー検査5,14-17、心臓、肺、免疫組織の収穫を含むように拡張することができ、心臓の生理データの同時取得は、前方の科学的知識の基礎を移動するデータを取得するために必要な動物の数を減らすことができます。また、ここに提示され、手続きのワークフローは、免疫、肺や心臓の機能をリンクするネットワークの知識を得るための理想的な基盤を提供します。ここで概説同じ原則は、必要に応じて他のまたは追加の臓器を研究するために適合させることができます。
プロトコル
1。準備
- 次のように以下の溶液とチューブを（ 表1）を準備します。
- ハンクス液、ペニシリン（100単位/ ml）/ストレプトマイシン（100 mg / ml）を持つ無カルシウム、マグネシウムまたはインジケータ。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、1X、ノーカルシウム、マグネシウムをバッファリングしない。
- エタノール、70％、500ミリリットルを作る。
- PBSでホルムアルデヒド、7から10パーセントバッファ付き、500ミリリットルを作る。
- 麻酔ソリューション：
- AVERTIN。 2,2,2 - トリブロモ慎重5gに2 - メチル-2 - ブタノール5mlを加える。一度溶解し、暗所で室温の原液を保つ。ストック溶液0.25ミリリットルを取ると、ガラス底の瓶で1xPBS 10mlで薄め。 37℃アルミ箔、場所でボトルを包む℃で溶解し、次いで、アリコート5mlのポリプロピレンチューブに、冷蔵庫にキープまで。実験日の朝に1つのアリコートを温める。
- バルビツレート。 2.6パーセントのバルビツール酸ゾルを与えるためにPBSで原液を希釈しution。ポリプロピレン管3-4 mlのアリコートを置きます。
- 3作業領域（ 図1）を整理します。
- 体....
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結果
右心圧カーブを得るための主要転帰は、右心カテーテルの正しい位置にすることによって達成される。右心室のカテーテル内部の正しい配置は圧力プラトー（ 図4）になりますので、圧力時間曲線の形状は非常に重要です。先端のとがった曲線は、代わりに、右心室の壁に呼吸や心臓の拍動によって移動されるカテーテルを示す。動物の生存の段階で潜在的な問題を検出するには、ΔPの標準偏差、および心拍数は計算する必要があります。両方の値は治療群間で有意差はないことが予想されます。また、期待は、ΔPの値と心拍数が記録時間にわたるドリフトを示していないということです。たとえば、ゆっくりとΔPの値を大きくすると、低酸素性肺血管収縮18から20を示すでしょう。心拍数を下げるとindicatう麻酔のレベルは動物の死につながる高すぎることを電子。当研究室では別の人が手順を実行します。マウスの全グループにわたって、我々は日常的に右心室の圧力データを取得することに90〜95％の成功率を達成しています。
手順を学びながら、それは大きな頸静脈を持ち、雄マウスよりも少ない皮下脂肪預.......
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ディスカッション
ここで概説した実験フローは肺、心臓およびマウスにおける免疫系の応答の分析のために右心室収縮期圧およびサンプルの収穫の迅速かつ同時測定を可能にします。手順は、心臓生理学測定、顕微解剖と生細胞研究、組織学的分析、または組織のオミクス解析のためのその後の組織の収穫を兼ね備えています。完全な手順については、マウス当たり未満20分かかります。仕事がないためにエリア編成ワークフローから、2月3日、動物を同時に検討することができる。したがって、プロシージャは、小さな研究室から大手製薬研究に、設定の広い範囲で行われ、小さなターゲットを絞った実験12と大型画面に適しています。
心臓生理学の測定と組織の収穫の組み合わせは、心を制御したり、同期することを生物学的ネットワークを検出するように設計された分析を実行するための可能性を開き、肺トランスジェニックおよびノックアウトマウスの資源を活用したND免疫機能、。同時手続きの流れの重要な利点は、研究ごとに必要な動物の数の減少である。この手続きのワークフローの別のアプリケーションが必要に応じて同じ動物から他のまたは追加の臓器を研究する可能性.......
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
この作品は、米国国立衛生研究所1R21HL092370-01（GG）、1R01 HL095764-01（GG）によって賄われていた。R01HL082694（JW）を、米国心臓協会、ファウンダーズ·アフィリエイト（0855943D、GG）、ストーニーウォルド - ハーバート基金、ニューヨーク（SHP）。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント（オプション） |
| 試薬 | |||
| 2 - メチル-2 - ブタノール | シグマアルドリッチ | 152463 | |
| 2,2,2 - トリブロム | シグマアルドリッチ | T48402 | |
| 消毒石鹸（カバレッジスプレーTBプラスステリス） | フィッシャー·サイエンティフィック | 1629年から1608年 | |
| エチルアルコール、200プルーフ、無水、絶対ACS / USPグレード | PHARMCO-AAPER | 111000200 | 蒸留水で70％に希釈し、 |
| ホルムアルデヒド溶液 | シグマアルドリッチ | F1635-500ML | 7から10までパーセントフォーマに希釈PBS原液と水を使用して1xのPBSの濃度でldehyde濃度 |
| ハンクス液、無カルシウム、マグネシウム | フィッシャー·サイエンティフィック | 21から022-CV | |
| 10月 | 組織 - Tek社 | 4583 | |
| ペニシリン（10,000 U / ml）を/ストレプトマイシン（10,000 mg / ml）のソリューション | サーモサイエンティフィック | SV30010 | |
| リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、無カルシウム、マグネシウムなし、1xと10xの緩衝溶液 | フィッシャー·サイエンティフィック | ||
| ペントバルビタールナトリウム26パーセント | フォートダッジ·アニマルヘルス | NDC 0856-0471-01 | |
| 実験機器 | |||
| プレート12、24、96ウェル | ファルコン | ||
| トランスファーピペット | フィッシャー·サイエンティフィック | 13から711-9BM | |
| チューブは、EDTAコーティングされた | ザルスタット | 2013から08 | |
| チューブ0.65ミリリットルと1.7ミリリットルマイクロ遠心 | VWR | ||
| チューブ12×75mmのポリプロピレン | フィッシャー·サイエンティフィック | 14から956-1D | |
| チューブ、様々なサイズ、ポリプロピレン | フィッシャー·サイエンティフィック | ||
| インスツルメンツ | |||
| 鉗子、デュモン5位ファイン | ファイン科学ツール | 11254から20 | |
| 鉗子、湾曲極細グレーフェ-0.5ミリメートルのヒント | ファイン科学ツール | 11152から10 | |
| 鉗子、余分FiありNEグレーフェ-0.5ミリメートルヒントストレート | ファイン科学ツール | 11150から10 | |
| カニューレ18GA、19 GA | BD | 精度グライド針 | 、最適な長さに切断し平滑化し外粗い外表面を作成するためにrasped |
| はさみ、解剖用はさみスリムブレード9センチメートル | ファイン科学ツール | 14081から09 | |
| BAL、編んだ絹縫合用の糸、4から0 | ファイン科学ツール | SP116 | |
| 右心カテーテル検査、編んだ絹縫合糸、6-0のための縫合 | Teleflexは医療 | 18020から60 | |
| 注射器、1ミリリットル | BD | 309659 | |
| 機器 | |||
| アンプ、PowerLabの4月30日 | ADInstrument | モデルML866 | |
| カテーテル、圧力F1.4 | ミラー·インスツルメンツ株式会社 | 840-6719 | |
| 解剖顕微鏡 | Variscope | ||
| 鉗子、はさみVannas春〜2mmのブレード | ファイン科学ツール | 15000から00 | |
| ハロゲンイルミネーションデスク拡大鏡 | フィッシャー·サイエンティフィック | 11-990-56 | |
| ラップトップコンピュータ | Asusの | モデル番号A52F i5プロセッサ、15インチ | |
| 光源 | Amscope | HL-250- | |
| 圧力調整装置 | ミラー·インスツルメンツ株式会社 | PCU-2000 | |
| ソフトウェア、Labchart-ProのV.7 | ADではインストゥルメント |
参考文献
- Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
- Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
- Hassoun, P. M., et al.
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