方法論記事

乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍微小環境における薬剤応答のイメージングを生きる

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DOI：

10.3791/50088

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2013年3月24日

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1Watson School of Biological Sciences, 2Cold Spring Harbor Laboratory, 3Departments of Medical Genetics, University of Oslo and Oslo University Hospital

この記事について

サマリー

我々は、抗癌治療への応答のイメージングのための方法を説明と単一細胞の解像度で。

要約

腫瘍微小環境は、腫瘍の開始、進行、転移、抗癌治療に対する反応において重要な役割を果たしている。三次元共培養システムは頻繁に薬剤応答における役割を含め、腫瘍間質の相互作用を解明するために使用されます。しかし、無傷の微小環境における生体内で発生する相互作用の多くは完全にin vitroでの設定で、これらの中で複製することはできません。このように、リアルタイムでこれらのプロセスの直接可視化は、治療に対する腫瘍の応答を理解し、がん細胞およびこれらの応答に影響を与えることができる間質間の相互作用を同定する際に重要なツールとなっている。ここでは、直接薬物分布、癌細胞応答および乳癌モデルにおける全身療法の投与後、腫瘍間質相互作用の変化を観察するために生きている、麻酔したマウスのスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用するための方法を提供する。我々はlabeliするための手順について説明しngの異なる腫瘍成分、治療応答を観察するための動物の治療、最大40時間までのイメージングのための腫瘍組織を露出させるための外科的処置。このプロトコルから得られた結果は、薬剤浸潤、癌細胞死と間質細胞遊走などの過程を画像解析ソフトを用いて評価することができるタイムラプス映画、です。

概要

腫瘍の成長1のための適切な環境を維持するために支援する癌細胞と間質成分（細胞および非細胞の両方）：固形腫瘍は大きく二つの区画で構成されています。これらの間質成分は乳房2-5のものを含む癌の多くの種類の開発、進行、および転移に重要な役割を果たしています。間質環境はまた、治療応答2,4,5に影響を与えます 。このように、がん細胞は無傷微小環境のコンテキスト内で、従来と新しい治療法にどのように反応するかを決定することは、がんの生物学の理解を促進し、現在の治療戦略を改善するために重要である。さらに、癌細胞間質の相互作用は、治療の投与後にどのように変化するかを定義することは、腫瘍再発の生物学を理解するために重要です。

器官型共培養システムは、腫瘍間質の相互作用を研究するために有用であったまでが、それは現在利用可能な方法が正常に免疫細胞の血管機能及び募集に関し、特に、in vitroで無傷の腫瘍微小環境を再現できないことは明らかである。実際、in vitroで観察される治療に対する癌細胞の応答は、しばしば微小環境が損なわれていない5、 インビボにおいて観察されたものとは大きく異なっている。したがって、腫瘍間質の相互作用と治療反応に与える影響を研究するためのin vivoモデルでより良い臨床的に関連する機構7を反映しているかもしれない 。

in vivoでの抗癌治療への応答を研究するための主な手段は、腫瘍の大きさと処理された動物または患者由来組織の組織学的評価の測定をしてきた。しかし、過去20年間の顕微鏡と蛍光レポーターの進歩は、細胞間および細胞内プロセスの可視化を有効にしているライブ、麻酔動物では、高解像度（生体内イメージング）8時。これらの生体顕微鏡技術は、空間的および時間的に携帯とサブ携帯解像度8,9で腫瘍間質の相互作用の in vivo動態の解剖のために特に有益であることが証明された。

生体内イメージングによって解明されたプロセスは、抗腫瘍T細胞の細胞毒性10,11、T細胞および骨髄細胞12、治療の13以下のコラーゲン組成と組織の変化のダイナミクス、マクロファージ依存性癌細胞の脈管内への侵入および転移との間の相互作用を含む14、および血管透過性15。

生体内イメージングのための3つの主要な要件があります。これらは、適切な準備と露出イメージングのための組織の、関心の組織成分の蛍光標識し、ペアになって顕微鏡カメラsを含む16枚の画像を取得することができるystem。これらの要件に対処するために使用される最も一般的な方法は次のとおりです。1）異所性製剤（ 例 、耳や目の軌道の接種）、恒久的なイメージングウィンドウ、または体外製剤（ 例 、背部皮膚フラップ）、2）トランスジェニック蛍光レポーターとラベル組織成分に蛍光注射剤、3）多光子共焦点顕微鏡システムは、それぞれ9、光電子増倍管または電荷結合素子（CCD）カメラとペア。我々は、蛍光レポーターをコードする導入遺伝子を発現する麻酔動物でのイメージングのための鼠径部乳腺を公開するための外科的に準備された皮弁モデルを使用します。画像は4レーザースピニングディスク共焦点顕微鏡システム17とペア激化CCD（ICCD）カメラを使用して12から40時間の期間にわたって得られる。この方法でイメージングは、私たちはステージ依存CH、in vivoでの薬物分布のように、このようなプロセスを学ぶことができましたemotherapeutic応答、化学療法誘発性細胞死のタイプ、および骨髄細胞の挙動5。

我々は、抗がん治療と乳癌のマウスモデルにおける腫瘍間質の相互作用に対する癌細胞応答の生体内イメージングのためのプロトコルを提供する。このプロトコルは、単一の撮像セッションで40時間までの期間のトランスジェニックおよび移植両モデルにおけるトランスジェニックおよび注射用蛍光ラベルの多種多様な癌細胞と間質成分の両方の行動や死を追跡するために使用することができます。

プロトコル

記載されている全ての手順はローカルインスティテュー動物実験委員会による事前の承認を含む脊椎動物の使用のためのガイドラインおよび規制に従って行わなければならない。

1。イメージング（トランスジェニックまたは同所）のマウス乳腺腫瘍を発生させる

  1. 遺伝子改変マウスモデルを用いたイメージングのための乳腺腫瘍を発生させる（ 例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復[MMTV]オーマミドルT抗原[PyMT]またはラットC3（1）プロモーター、SV40のラージT抗原（タグ）を駆動[C3（ 1）タグ]モデル）または同所移植モデル（同系、同種、または異種）。
  2. トランスジェニックレポーター株（ 例えば ACTB-ECFP）または原発性癌細胞又は移植に続く細胞株（ 例えば伝達） の ex vivo での操作を使用して遺伝子組み換えモデルを掛け合わせることによりラベルのがん細胞を。同所移植、sのサンプル·プロトコルのためのeeは18。

2。腫瘍微小環境またはサブ細胞成分の可視化コンポーネント

  1. トランスジェニックラベルを使用して腫瘍コンポーネントを視覚化する。トランスジェニックレポーターマウス（ 例えばc-FMS-EGFPの原子核の骨髄細胞またはACTB-H2B-EGFPの場合）または移植、標識された組織の受信者としてこのようなマウスを使用して遺伝子組み換え腫瘍モデルを交配。これは、それぞれ、細胞死に伴う治療や核変化に応じて、癌細胞間質細胞の相互作用の可視化を可能にします。
  2. 注射剤を使用して微小環境を可視化する。剤（ 例えば、蛍光標識された抗体又は化学染料）、多種多様な腫瘍の様々なコンポーネントにラベルを付けるために使用することができます。色素の半減期は、1つは追跡に興味を持っているの応答に応じて、注射は撮影開始前に投与してもよいし、イメージングセッション中に静脈内（IV）またはintのどちらかraperitoneally（IP。、 図1）。

3。顕微鏡やイメージングソフトウェア

  1. 顕微鏡。顕微鏡システムおよびソフトウェアの様々な生きたマウスのイメージングのために使用することができます。最も一般的に使用されるシステムは、共焦点顕微鏡や多光子です。我々は、ICCDカメラ（XR-メガ10EX S-30、スタンフォードフォトニクス、パロアルト、CA）でマイクロレンズ付きスピニングディスク共焦点顕微鏡（Solamereテクノロジーズ、ソルトレイクシティ、ユタ州）を使用します。
  2. イメージングソフトウェア。我々はオープンソースソフトウェアμManager（ヴァーレ研究所、カリフォルニア大学サンフランシスコ[UCSF]）を使用します。
  3. 画像解析。我々は、画像解析にImaris（ビットプレン）、Volocity（パーキンエルマー社）と、ImageJ（健康[NIH]総合研究所）を使用します。

4。イメージングのための動物の（前）処理

  1. 鼠径部乳腺腫瘍は長径がキャリパーmeasurで約8mm以下を測定したときに我々のプロトコルを使用してイメージング用に最適であるement。
  2. 実験の必要に応じて、小分子阻害剤、抗体医薬や化学療法薬で治療イメージングの動物については、イメージングの前またはその間に治療を開始する。イメージングは​​化学療法薬ドキソルビシンによって誘導される細胞死のイメージングが最高のイメージング24時間を開始することで、捕獲されている間、（映画1と2）開始以降、薬物治療の後にされた後、例えば、薬剤溢出と分布のイメージングには、管理を必要とします（作品3および4）。

5。イメージング中に動物の水和と血液浸透圧を維持するための生理食塩水の準備

  1. 1ミリリットルのシリンジへの1X PBS約1mlを描画します。ヨウ化プロピジウム（PI、インビトロジェン、1 mg / mlの希釈、1時15分）が定期的にイメージングセッション中（IP）投与されるであろう、この溶液に添加することができる。これは、細胞膜透過性を持っている人が死亡または瀕死の細胞の核のイメージングを可能にする。 PIは非常に短いHALを持って血管系のf-生活、したがってイメージングセッション全体を再投与しなければならない。
  2. このシリンジに翼の輸液セット（23ゲージ、¾インチ針、12インチチューブ）を取り付け、チューブの終わりに生理食塩水が終了した針の先端の一滴までチューブを通してソリューションを押してください。
  3. 輸液セット、および適切な食塩水を補充してからシリンジを取り外します。
  4. ラインに気泡が混入しないように注意しながら、輸液セット、シリンジを再度取り付けます。

6。イソフルラン麻酔システムの整備

  1. 噴霧器に水を加えて、所定の位置にねじ込みます。これは、動物に送達ガスを加湿する肺の炎症を防止し、長期的な麻酔下動物の生存を延長します。
  2. 一番上の行にイソフルランタンクを埋める。注意：イソフルランはまた、研究者に影響を与えることができる強力な麻酔薬である。適切な真空システムべきB過剰ガスが領域から削除されていることを確認するための場所で、電子。
  3. 酸素タンクと窒素タンクの両方をオンにして、流れを調整します。酸素は約0.2 L /分（〜21％）であるべきである一方、窒素は、約1.0 L /分であるべきである。
  4. （インハウス）真空をオンにします。真空度は約1.2 L / minである必要があります。
  5. 誘導室へ麻酔のラインが開いていることを確認し、手術領域に線や顕微鏡が閉鎖されています。
  6. 麻酔システムに接続されたラテックス呼吸袋が膨張していることを確認します。バッグが膨らまない場合は交換します。
  7. 顕微鏡のステージおよび外科プラットフォームに麻酔を提供するノーズコーンのそれぞれのゴムダイヤフラムをチェックしてください。ゴムが薄いに開始している場合は、それを交換します。

7。手術道具と手術プラットフォームの準備

  1. ホットビーズ滅菌器の電源をオンにして、それが> 200℃に到達させ
  2. 石鹸と水で手術器具を洗う（1鉗子[好ましくは歯を持つ]と動物の皮膚を切断するためのはさみ、鉗子の1ペア[好ましくは鋸歯状]と腫瘍のさらなる暴露用ハサミ）。
  3. ホットビーズ滅菌器（あるいは、手術道具を事前にオートクレーブにかけることができます）を使用して、少なくとも30秒間、手術器具を滅菌する。
  4. 滅菌済みのツールを汚染しないよう確認しながら手術道具が冷えるましょう。
  5. 発泡スチロール出荷クーラーに蓋を収集します。これはあなたの手術プラットフォームになるだろう。
  6. 発泡スチロールの蓋（十分にそれをカバーする）の上にラボ浸すのピースを置きます。
  7. 接辞実験用テープを用いるラボ浸す（1〜麻酔システムへのラインとノーズコーン "のテープが一番ここで動作します）。、18G×1½挿入"を維持するためにノーズコーンのいずれかの側に発泡スチロールの蓋にテープを通して針をノーズコーンは、所定の場所に固定。
  8. ベタジン、滅菌ガーゼ、2 70％イソプロパノールワイプ、顕微鏡を脇に置きますスライド、Krazyの接着剤、およびラボテープ4個（½ "の幅）。

8。顕微鏡の調製

  1. 顕微鏡、カメラ、顕微鏡を実行しているコンピュータの電源をオンにします。
  2. 毛布の電源をオンにします。
  3. 倒立顕微鏡を使用する場合は、カスタムメイドステージインサートが鼠径部乳腺の位置に対応する撮影ポートを使用して設計されるべきである。ステージは、石鹸と水でよく乾燥した挿入清掃してください。イメージングポートを介してカバーガラス（＃1.5厚み）を確保し、70％イソプロパノールで表面全体をきれいにする（半 "は最高の作品）ラボのテープを使用してください。汚染から保護する滅菌ガーゼと一緒にステージをカバー。ステージのステージインサートを置きそれは空気乾燥することができます。
  4. 、ラボテープの4から6個（1 "幅）を引き裂く、長さ約6インチと顕微鏡の側面に取り付けます。テープのこれらの作品は、動物に麻酔を提供するノーズコーンを配置するために使用されますdは、所定の位置に固定します。
  5. 長さ1インチ程度であるテープの2枚以上（½インチ幅）を引き裂く。これらは、マウスや場所に腫瘍を公開するために使用顕微鏡スライドにPBSを提供翼状針を維持するために使用されます。

9。イメージングのための鼠径乳腺をさらす

  1. キャリアガスとして酸素21％と窒素バランス（約1.0 L /分の流量）とイソフルラン4％を用いた誘導チャンバー内に動物を麻酔。これは、2月4日分を取る必要があります。
  2. それが上を向いて腹面で、深くゆっくりと呼吸したら外科プラットフォームにマウスを移す。外科的なプ​​ラットフォームに麻酔ラインを開き、その後、麻酔システムにおける高すぎる圧力を回避するために、このためには、誘導室に麻酔ラインを閉じます。この時点で4％から2.5％にイソフルランの濃度を減少させる。
  3. 動物が十分anesであることを確認するために反射ペダル撤退をチェック蹠ピンチを行うことにより、外科手術用thetized。それは足蹠ピンチに（ 例えばけいれんや尻尾をカール）反応しない場合、動物は適切に麻酔をかける。動物が足蹠ピンチに反応しない場合、イソフルランの濃度を増加させる。
  4. 実験用テープで手術プラットフォーム（½ "テープこのために最高の作品）にマウスの手足を固定します。
  5. 動物が手術プラットフォームに固定したら（省略可能）、髪は電子シェーバーを使用して腹面から取り外すことができます。化学脱毛を優先する場合は、これは手術の前に24〜48時間を実行する必要があります。浮遊毛が強く、急性免疫応答を誘導することができるように、手術前に髪を削除すると、撮像部位の汚染を防止するのに役立ちます。
  6. 70％イソプロパノールワイプやベタジンで動物の腹面を消毒する。
  7. 滅菌はさみや鉗子（歯を持つ）の最初のペアを使用して、皮下腹側正中切開を作るそれは〜3ミリメートル尿道上から剣状突起まで実行されます。穿刺または腹膜切開を避けるために注意してください。
  8. 滅菌はさみや鉗子（鋸歯）の第二のペアを使用して、静かに腹腔から、接続されている鼠径乳腺で、肌をデタッチします。
  9. 顕微鏡スライドガラスを取り出し、前の手順で生成された皮膚のフラップに対して、それを配置します。マウスがステージ上に配置された後、腫瘍の大部分がフラットに座って、それが後肢の機動性を妨げないような方法でスライドを配置します。
  10. 顕微鏡スライドが適切に配置された後、瞬間接着剤（ 例えば 。、クレイジーグルー）を使用して皮膚の外表面にスライドを添付してください。

10。ステージ上にマウスを置く

  1. 外科的なプ​​ラットフォームに動物の手足を固定している研究室のテープを取り外します。
  2. 顕微鏡ステージに麻酔ラインを開き、anestheを閉じるこの順序で手術プラットフォームにSIAライン、。
  3. 迅速顕微鏡ステージに動物を転送します。
  4. 一度動物は、転送された位置とマウスを麻酔したままで快適な位置にあることを確実にするために（ 例えばラボのテープを使用して）適切に麻酔ラインとノーズコーンを固定されています。
  5. それが一番上と顕微鏡ステージでカバーガラスで覆われたイメージング·ポートの1つの中心に位置するように腫瘍を公開します。
  6. 接眼レンズを使用して、腫瘍が正しく配置されていることを確認し、ゆっくりと顕微鏡スライドダウンテープ。組織への血流が遮断されないように、スライドが緩く固定する必要があります。顕微鏡スライドを下にテーピングすると動物の呼吸によって導入された画像アーチファクトを最小限に抑えることができます。
  7. 翼の点滴と腹腔内留置線を挿入すると、＃5で調製滅菌1X PBSまたは生理食塩水を（必要に応じてこのようなPIとして色素を含む）を含む1mlのシリンジに取り付けセット。注射100μlのIPを動物に電気ショック療法。行が挿入されます。この時点からの撮影セッションが終了するまで、1時間間隔（またはPIの生理食塩水25μlの30分毎）に生理食塩水50μlと動物を注入します。
  8. 動物のバイタルサインを監視するには、オキシメータプローブ（スターライフサイエンス、株式会社などによるMouseOxシステム）19を添付してください 。
  9. 低体温症を防ぐために毛布を使用して、マウスをカバーしています。

11。画像の取得

オープンソースソフトウェアμManager（ヴェールラボは、UCSF）のタイムラプス画像を取得するために使用されます。生データはImaris（ビットプレン）ソフトウェアでコンパイルされており、独立した観察者によって手動で得点、または（ 例えば Volocity [パーキン]またはImageJの[NIH]）のいずれかImarisまたは他の画像解析ソフトウェアで解析することができます。

12安楽死

画像セッション（1-4の終わりに0時間は、）は、分析プロセスの種類に応じて、動物を安楽死させています。

  1. イソフルランの濃度が4％に上昇する。
  2. それは呼吸を捕捉し、ステージから削除した後に動物が30秒になるまで観察される。
  3. 頸椎脱臼は、動物を安楽死されていることを確認するために実行されます。

13。代表的な結果

それは腫瘍、治療処置後の細胞死、細胞死5に対応して、腫瘍間質の相互作用に達すると、この方法を用いて生体内イメージングは、腫瘍、血管外漏出や薬物の分布に薬物送達を含む様々なプロセスの直接可視化することができます。画像が取得されている間、腫瘍組織への血管外遊後の腫瘍とその分布への薬物の到着を観察するために、動物が注入される。 chのであるが、いくつかのクラスemotherapeuticsが（例えば、ドキソルビシンなど）が弱い蛍光性で、多くはそうではありません。蛍光共役デキストランは、組織への薬物送達および拡散のためのサロゲートマーカーとして使用することができます。 図2と映画1は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合静脈注射2 MDデキストラン（Invitrogen社、1 mg / mlの1xPBS）の到着を示しています。 ACTB-ECFPマウス; MMTV-PyMTの腫瘍へ。

腫瘍への薬物の到着後、組織を通して血管外漏出と拡散は、薬物と薬物分布5の両方の血管内半減期を決定するために撮像することができる。ムービー2は静脈注射のAlexa Fluor-647-共役10 kDのデキストラン（Invitrogen社、1×PBS中1 mg / ml）での血管外漏出と分布を示している。 ACTB-ECFP;、撮影時のc-FMS-EGFPマウスC3（1） - タグに変換します。 Imaris（ビットプレン）のタイムラプスムービーをコンパイルした後、血管内半減期および薬剤分布が定量化される。血管内半減期を測定するには、各時点での腫瘍血管の平均蛍光強度を計算し、時間に対してプロットされている。薬物分布は、薬物陽性である総腫瘍面積あたりのパーセント領域として定量化される。

腫瘍への薬物送達の動態を追跡するだけでなく、腫瘍が治療に反応する方法を決定するために頻繁に重要である。抗がん治療は、細胞死を誘導することが期待されているように、プロピジウムアイオダイド（PI）染色又は構造的核変化は薬剤誘発性細胞死5のマーカーとして使用することができる。 図3は、MMTVにおける細胞傷害性化学療法薬ドキソルビシンに対する腫瘍の反応を示しています-PyMT; ACTB-ECFPと、c-FMS-EGFPマウス。でこのトリプルトランスジェニックMMTV-PyMT; ACTB-ECFPと、c-FMS-EGFP動物、ECFPラベル乳癌細胞（青）、およびEGFPラベル骨髄細胞（緑）。イメージングが始まったとPIはトン全体でIP配信される前に、このセッション中に撮像された動物は、ドキソルビシン18時間投与した彼は上記のようなイメージングセッション。癌細胞（ACTB-ECFPラベリング）は、青色で表示され、死者や死細胞は赤色（PI染色）として表示されます。ここに提示された時系列は、時間の経過とともにドキソルビシン依存性細胞死の誘導を示す。腫瘍における細胞死の誘導を定量化するために、薬物の分布を決定するために使用される分析、同じ種類の定量的な出力は、PI陽性である総腫瘍面積あたりのパーセント領域である場合、使用されています。

高倍率での撮像は、癌細胞が5を受けることが細胞死のタイプに関する情報を提供することができます。ムービー3は、ドキソルビシンと全身療法に応答してアポトーシスによる細胞死の典型的な核の変化を追跡するためのイメージング実験の結果を示しています。核を可視化するには、このセッション中に結像される動物が代わりにc-FMS-EGFPレポーターのACTB-H2B-EGFPレポーターを抱いて、癌細胞の核は緑色のラベルが貼られていますので。このMMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ACTB-H2B-EGFPの動物は、admだったinisteredドキソルビシン（8 1 mg / kgのX PBS）の前ムービーの開始、およびPI（インビトロジェン、1 mg / mlの溶液を1:15希釈）を含む1×PBSの毎時注射を受けにIP（24時間）。癌細胞の核内構造変化が壊死（核形態に最小限の変更を表示するPI陽性細胞）を受けた細胞の隣にアポトーシス細胞で観察することができます。アポトーシス細胞の核は結局PI染色の取り込み（図示せず）に起因する赤になります。壊死とアポトーシス事象の数は、PI-陽性と核形態に基づいて、各時点のために手動で定量化される。

化学療法誘発性癌細胞死腫瘍2,4,5への免疫細胞の反応募集に頻繁に結果図4は、ドキソルビシンと急性期治療には、この間質反応の例を示しています。 MMTV-PyMT; ACTB-ECFPと、c-FMS-EGFPの動物がここに結像されるドキソルビシン（8 1×PBS中のmg / kg）を腹腔内投与した。約20時間前に撮影開始、と毎時のPI注射ip を受けています。細胞死を可視化する実験の期間中。時間はドキソルビシン治療後の時間数を表す示し、スケールバーは100μmを表しています。白矢印で示すように、この実験では、骨髄細胞は、細胞死の領域に潜入する。定量的な出力がEGFP陽性である総腫瘍面積あたりのパーセントの領域であるドキソルビシン投与後の腫瘍への骨髄細胞の浸潤、解析と同じ種類の薬物の分布を決定するために使用され、化学療法に対する腫瘍の反応が使用されているが、定量化する。

化学療法への全体的な質の応答を可視化することに加えて、専門的な間質応答も5可視化することができる。ムービー4は、隣接する細胞による壊死性細胞材料の食作用を示しています。赤核物質はラーグと細胞によって摂取されて見ることができますマクロファージの典型である電子無傷緑核、。 MMTV-PyMT; ACTB-ECFP、このセッション中に結像されるACTB-H2B-EGFPの動物は、ドキソルビシン（1×PBS中8 mg / kg）を腹腔投与した。ムービーの開始に先立って24時間。動物は、1×PBSを含む、PI（インビトロジェン、1 mg / mlの溶液を1:15希釈）の毎時の注射を受けた。核（ACTB-EGFP標識）が緑色で表示されますが、細胞が壊死すると赤に変わります。

figure-protocol-1
図1。トランスジェニックと注射ラベルを使用して、異なる腫瘍コンポーネントのサンプルラベリングこれはトリプルトランスジェニックMMTV-PyMTです;。ACTB-ECFPと、c-FMS-EGFPの動物癌細胞はECFPと骨髄細胞の発現を介して青のラベルが貼られていたが、ラベルが貼られています骨髄特異的プロモーターからEGFPの発現を介して緑色。動物中（PI、赤、1X PBSで〜0.07 mg / ml）をヨウ化プロピジウムを注射した細胞死を可視化するイメージングセッション。 PIのラベルは、DNAだけ死んだか瀕死の細胞膜を横切る。スケールバー=100μmである。

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図2。腫瘍における薬剤溢出および配布この二重トランスジェニックMMTV-PyMT;がん細胞がECFPの発現を通して青のラベルが貼られていたACTB-ECFP動物がどのように可視化するイメージング·セッション中に、FITC結合2 MDデキストラン（緑）を注射した薬は静脈注射（青）の後に腫瘍に到達。イメージングが開始された後の時刻が表示されます。スケールバー=100μmである。

figure-protocol-3
図3。全身療法に対する癌細胞応答。 MMTV-PyMT; ACTB-ECFPと、c-FMS-EGFPの動物は、化学療法で治療薬は前にイメージングにドキソルビシン、および細胞死にラベルを付けるために、PI（赤色、1X PBSで〜0.07 mg / ml）と注入された。この画像シリーズはドキソルビシン治療後の細胞死の誘導を表す、時間をかけてPI染色の蓄積を（白矢印で示すように）を示しています。示された時間は、ドキソルビシン治療後の時間です。画像はz軸の3つの画像を含むzスタックの最大強度予測されています。スケールバー=100μmである。

figure-protocol-4
図4。 MMTV-PyMTで化学療法への骨髄細胞の応答; ACTB-ECFP;ますc-FMS-EGFP三重トランスジェニックマウスに投与する前にイメージングドキソルビシン20時間動物は毎時ipを受け取った。 PIの注射（赤、〜1X PBSで0.07 mg / ml）の死んだ細胞を標識する。この画像シリーズはdoxorubi以下の時間をかけてEGFP陽性骨髄細胞（白矢印）の蓄積を示していますCINの治療。この反応性免疫応答は4,5化学療法のいくつかのクラスに対する治療応答を阻害することが示されている。示された時間は、ドキソルビシン治療後の時間です。画像はz軸の3つの画像を含むzスタックの最大強度予測されています。スケールバー=100μmである。

ムービー1。 。がん細胞がECFPの発現を通して青のラベルが貼られていたACTB-ECFP動物、 腫瘍への薬物送達これは、二重トランスジェニックMMTV-PyMTです。動物薬は静脈注射後に腫瘍に到達する方法を可視化するイメージングセッション中に2 MD FITC結合デキストラン（緑）を注射した。スケールバー=100μmである。 ムービーを見るにはここをクリック 。

ムービー2。腫瘍組織への薬物浸透三重トランスジェニックC3（1）タグ; ACTB-ECFPと、c-FMS-EGFPの動物癌細胞がラされているECFPとEGFPの発現を介して緑色で標識された骨髄細胞の発現を介して、青色でbeledのAlexa Fluor 647-共役10 kDのデキストラン（赤）で静脈内注射した。視野は直ちにデキストランの注射の後に表示されています。デキストランは当初、血管系は、急速に腫瘍組織にextravasates、最後にマクロファージに取り込まれ、ラベルが付けられます。スケールバー=100μmである。 ムービーを見るにはここをクリック 。

ムービー3。 。ACTB-ECFP;、化学療法誘発性細胞死の後に核の変更このトリプルトランスジェニックMMTV-PyMT のイメージング H2B-EGFPの動物は、イメージングの前にドキソルビシンを注射した。としてH2B-EGFP融合タンパク質の発現によって追跡核の形態（緑）は、右上隅にある細胞に見られるように、アポトーシスの典型的な化学療法によって誘発される核の構造変化の直接可視化することができます。動物RECE半時間ごとにipを ived。死者や死細胞を標識するためのイメージングセッションの持続時間のためのPI（赤色）の注射。示された時間は、ドキソルビシン治療24時間後の時間です。画像は、高倍率の対物レンズ（40倍、NAは1.1、水レンズ）を使用して取得した。スケールバー=15μmで。 ムービーを見るにはここをクリック 。

ムービー4。核の変化や化学療法誘発性細胞死の後に死んだ細胞物質の取り込みのイメージングこのトリプルトランスジェニックMMTV-PyMT; ACTB-ECFP、H2B-EGFPの動物は、イメージングの前にドキソルビシンを注射した。としてH2B-EGFP融合タンパク質の発現によって追跡核の形態（緑）は、化学療法誘発核構造変化の直接可視化することができます。動物は半時間ごとにIPアドレスを取得しました。死者や死細胞を標識するためのイメージングセッションの持続時間のためのPI（赤色）の注射。画像を取得した高倍率の対物レンズ（40×、NAが1.1、水レンズ）を使用。前PIとGFPシグナルの核形態と損失の変化による標識に大きな構造変化の欠如が壊死様細胞死の指標である。死んだ材料は、マクロファージの典型である大核と細胞​​に取り込まれて見られている。示された時間は、ドキソルビシン治療24時間後の時間です。スケールバー=10μmである。 ムービーを見るにはここをクリック 。

ディスカッション

in vivoでの全身療法に対する腫瘍の応答は、微小環境は急性期反応と再発5の両方に影響を与えるように、in vitroで癌細胞のものと大幅に異なる可能性があります。 生体内での化学療法抵抗性経路における explicatingへの最大の障害の一つは、がん細胞とその微小環境との相互作用の複雑さである。具体的には、固形腫瘍は、がんや抗がん治療中に起こる細胞死の間質細胞、一つの成分の摂動、バランスを開発しているので、組織の組織に劇的な効果をもたらすことができます。

ここで提供される生体内イメージング技術は、抗がん剤による治療中に生きている、麻酔したマウスの腫瘍内の癌細胞間質の相互作用の直接可視化することができます。我々は（17を参照相対限られた侵入深さを持って回転するディスク共焦点顕微鏡を使用（商標）が、我々の手術や標識技術は、顕微鏡、他のタイプでも使用できます。これらの実験から取得されたムービーは、蛍光強度の変化（ 例えば、細胞死の標識された人口や誘導の浸透のために）、細胞運動、注射剤の分布（血管漏出を追跡する場合など ）、共同を含むプロセスを追跡するために使用することができます蛍光シグナル5,12,17,20の局在。

我々6時間以上にわたって日常的にイメージしたマウスと、18時間以上のイメージングを行った。これは、これらを長時間連続して麻酔下でマウスを維持する必要があります。適切な麻酔で、我々の動物の90％以上が6時間を生き残るため、そして約80％が18時間かけて生き残る。長期的な麻酔を行う方法の詳細については、以前に19が発表されている。我々の経験では、5つの要因が重要である：uは、生理的血中酸素飽和度レベルを維持し、脱水を避け、低体温症を避けるイソフルラン用加湿キャリアガスを歌い、彼らは痛みの兆しを見せないものに麻酔の最下位レベルに動物を保ちます。体温を維持するために、我々は（38℃）加熱された毛布の下にマウスを保つ。脱水症状を避けるために、我々は全体のイメージング手順を通して生理食塩水の ipの少量を注入する。生理的血中酸素飽和度レベルを維持するために、我々はキャリアガス中の酸素21％（というより一般的に使用される100％）で始まります。時間を実験に - - これは、私たちはマウスの場合、吸入酸素濃度を増加させることができる血中酸素飽和度の低下を示しています。我々の経験では、そのような時間（30-40％へなど）で吸入酸素濃度を増加させることはほぼ必ず追加のイメージングの時間を可能にする動物を安定します。麻酔の最適レベルは1から1.5パーセントイソフルランと400-450/minの60-65/minとパルスレートの呼吸率の結果で達成ほとんどのマウス用です。私たちのイメージング実験では、主にトランスジェニックマウスモデルを使用し腫瘍が単一の撮像セッション中に複数のx、yの位置に並列に腫瘍の進行の異なる段階で複数の病変のイメージングを可能にする、多発性であるでs（MMTV-PyMTとC3 [1]-タグ）。これは、ステージ依存治療応答を特定することを目的とした実験に関してマウス·ツー·マウス変動に関する懸念を減少させ、イメージングに必要な動物の数を減らすことができます。

MMTV-PyMTモデル（および他の自発的ながんモデル）に比べて生体内イメージング中に行うことができる腫瘍病変の病理学的病期分類が異なっているが、生体内イメージング中に認識され、あまり詳細なことができるプログレッシブ病理組織段階を経る組織切片5,17。がん細胞は、通常、進行した腫瘍から分離されるとは対照的に、移植モデルは、最高の後期段階の腫瘍を反映する傾向がある。このようなモデルは、このように、腫瘍間質を勉強するより適している様々な段階の間に、これらの相互作用の違いよりも後期の腫瘍の相互作用。

我々はどのように治療することにより誘導される細胞死した後に発生するイメージの核構造変化の例を示す。抗がん治療の非存在下では、この標識戦略が代わりに解明、その場で画像の細胞分裂に使用されるかもしれません、例えば、どのように細胞増殖および休眠性は微小環境に影響されます。将来的には、ミトコンドリアの成分の蛍光標識は、アポトーシス細胞死中に発生する画像ミトコンドリアの変化にそれが可能になるかもしれません。

このプロトコルでは、我々はまた、示されているどのようにイメージ療法後の癌細胞の免疫細胞の相互作用をしますが、他の微小環境の成分の例はまた、可視化して画像化することができる。ストローマコンポーネントの既存のトランスジェニックレポーターライン（ 例えば 。、FSP1-EGFP 17αSMA-RFP 21、COL1A1-EGの線維芽細胞のものが含まれFP 21）または血管系の細胞（ 例えば、Tie2シグナル-GFP 22; VEGF-GFP 23）。

生体内イメージングは生体内化学療法後の投与で発生する相互作用およびプロセスをリアルタイムに可視化することができます。現在利用可能な技術では、我々は治療反応にどのように影響するかを骨髄細胞理解する上で主要な進歩を遂げている、腫瘍微小環境は非常に複雑であるため、しかし、主要な進歩はまだ環境媒介薬剤耐性の基礎をなす過程に機構的に掘り下げて調査を開始するために必要とされる。それでも必要な最も重要な進歩の一つは、特定の細胞集団のためのより良いマーカーの同定である。良いマーカーの重要性はよく乳房腫瘍の微小環境、線維芽細胞や免疫細胞の最も顕著な間質細胞成分の2で示されている。 α-平滑筋アクチン（αSMA）が頻繁に識別するために使用され線維芽細胞が、タンパク質はまた、血管平滑筋細胞と筋上皮細胞24で表される。 αSMA-GFPレポーターマウスが存在するものの、このように、特定の細胞型を決定することは、生体内イメージング実験の間に、次であることは困難である。同様に、c-fmsのプロモーター下で発現など、EGFPのような単一の蛍光マーカーは、多くの場合、免疫細胞の複数の亜集団12,17を識別します。一つは理想的に特定の細胞型を同定するために単一のマーカーを使用したいと思いますが、このように、基礎生物学の複雑さは、このアプローチを使用する場合の主要な課題となっています。

この問題に対する一つの部分的な解決策は、さらに同じ蛍光レポーターを発現する細胞の亜集団を区別するために、注射ラベルを使用することです。例えば、蛍光デキストランは、マクロファージによって取り込まれるとc-FMS-EGFPおよびFSP1-EGFPトランスジェニックレポーターマウスでラベル付けされ、マクロファージの集団を標識することができる 17。蛍光プローブに結合した抗体はまた、特定の集団を（C-FMS-EGFPレポーター17で標識した骨髄細胞のGR1陽性人口など ）を識別するために使用されている。

理由やその方法、腫瘍は、動物の大規模コホートを必要とする様々な時点で採取した組織から派生投与された治療、または組織学的シリーズへの対応について少しメカニズムに関する情報を提供するキャリパーを測定することにより生成された腫瘍の応答曲線とは異なり、私たちの技術は、直接的、定量化可能な情報を提供します細胞死のダイナミクスにと小さなコホートにおける癌細胞と間質細胞の相互作用について。したがって、ここで報告された手順を使用することの利点は、それがリアルタイムで無傷腫瘍微小環境のコンテキスト内で薬剤応答に動的な情報を提供することである。このような情報は、治療応答5を駆動基礎プロセス重要な洞察につながることができます</>（商標）。

開示事項

著者らは、開示する利害の対立がありません。全ての動物実験は、動物実験委員会の承認されたプロトコールに従って行った。

謝辞

我々は、技術的なサポートのために、J.とJ. Cappellani秋に感謝します。この作品は、米国国立がん研究所（U01 CA141451）、スターがんコンソーシアム、治療のためのスーザンG. Komen、乳がん、MEに乳癌に対するマンハセット女性連合と戦うためにロングアイランド2日で歩くと、からの資金によってサポートされていました議会監督乳がん研究プログラム、米国からESNESNに対する事前博士フェローシップはまた、生物科学のワトソン·スクール·オブ·レスリーC.クイック、ウィリアム·ランドルフ·ハースト財団フェローシップの受賞者です。 HAAは、ノルウェーの研究評議会（160698/V40及び151882）、および南東部地域保健機関（2007060）からの資金によって支えられている。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬
MMTV-PyMTマウスジャクソン研究所 2374
C3（1） - タグマウスジャクソン研究所 13591
ACTB-ECFPマウスジャクソン研究所 3773
ACTB-H2B-EGFPマウスジャクソン研究所 5418
1×PBS 自社製
2 MDデキストラン、フルオレセイン結合インビトロジェン D-7137 1×PBS中に希釈し1 mg / mlの;のdH 2 O（4 mg / mlで、-20℃で保存）で再構成
10 kDのデキストラン、のAlexa Fluor 647共役インビトロジェン D-22914 1×PBS中に希釈し1 mg / mlの;のdH 2 O（4 mg / mlで、-20℃で保存）で再構成
ドキソルビシン塩酸塩シグマアルドリッチ 44583 4℃のdH 2 O、ストア内の再構成℃、1×PBS中に希釈
Isothesia（イソフルラン） バトラーアニマルヘルスサプライ 029450 250ミリリットル
ヨウ化プロピジウムインビトロジェン P3566 1 mg / mlで、希釈1時15分1×PBS中
窒素
酸素
機器
18G×1½ "レギュラーベベル針 BD 305196
μManager ヴァーレ·ラボは、UCSF www.micro-manager.org オープンソースソフトウェア
アルコール消毒綿 BD 326895 70％イソプロピルアルコールスワブ
麻酔システム分子イメージング製品、（株）
カバーガラスコー​​ニング 2940-245 第1½、24x50ミリメートル、70％イソプロパノールで消毒ワイプ
Curityガーゼのスポンジ（無菌） ケンドール 6939
ガラス顕微鏡スライドコー​​ニング 2948-75x25 予備洗浄、予備洗浄されていない場合、70％イソプロパノールで消毒ワイプ
硬化細かいハサミファイン科学ツール 14090から11 2ペア、ステンレス鋼、鋭い鋭い先端、ストレートチップ、26ミリメートルのカッティングエッジは、11 cmの長さ
熱せられた毛布 Gaymarインダストリーズ
ホットビーズ滅菌器ファイン科学ツール 18000から45 使用前に30分程度の電源をオンにして> 200でツールを殺菌℃で30秒間
Imaris ビットプレン www.bitplane.com
クレイジーグルーエルマーの製品 KG484
研究所テープ（½ "）
実験室でのテープ（1 "）
蓋に発泡スチロール出荷クーラーこれは、外科的なプ​​ラットフォームとして使用されます
ミクロ解剖鉗子 Roboz RS-5153 1x2の歯は、わずかなカーブ、0.8ミリメートルチップ幅、4 "長さ
ミクロ解剖鉗子 Roboz RS-5135 鋸歯、わずかなカーブ、0.8ミリメートルチップ幅、4 "長
顕微鏡スピニングディスク共焦点は、XYZピエゾステージ、epifluourescence capablility 17,25
顕微鏡ステージインサート適用された科学計測カスタムには、2つの円形のイメージングポートと、作製した
MouseOxオキシメータ、ソフトウェア、およびセンサー STARRライフサイエンス www.starrlifesciences.com
ナルゲンスーパーVersi-ドライラボsoakers サーモサイエンティフィック 74218から00 外科プラットフォームを裏打ちするために四分のにカット
噴霧器ソルターラボ 8901 ガスを加湿するために使用される;肺組織の炎症を防ぐ
スリップオンチップ使い捨てツベルクリンシリンジ（1ミリリットル） BD 309659
Surflo翼の輸液セットテルモ SV-23BLK 23G X¾ "超細い針、12"のチューブ
ベタジンスプレーパデューファーマ BASP3H

参考文献

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