方法論記事

脳から隔離された白血球の単離と解析マラリアベルゲイ ANKA感染マウス

DOI：

10.3791/50112

⸱

2013年1月2日

 ,  , 
1The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

の脳血管から付着炎症性白血球を単離するための方法マラリアベルゲイ ANKA感染マウスが記載されている。この方法は、フローサイトメトリーによって蛍光抗体とその後の分析で染色した後に定量化ならびに単離された白血球の表現型の特徴を可能にします。

要約

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我々はPの脳血管から付着炎症細胞の単離および特性評価のための方法を説明ベルゲイ ANKA感染マウス。実験的脳マラリア、人間1,2における熱帯熱マラリア原虫媒介重症マラリアの再現する一定の重要な側面、その神経学的症候群の誘導にこの寄生虫のひずみの結果と感受性マウス系統の感染。血液段階のマラリアの成熟型は、それらが血管内皮細胞に結合することができます感染赤血球の表面に寄生するタンパク質を発現している。このプロセスでは、低酸素症および出血3、その結果、血流に障害を誘発し、また寄生虫隔離のサイトに炎症性白血球の動員を刺激する。

他の感染症とは異なり、すなわちneutrotopicウイルス4-6、両方マラリア寄生赤血球（PRBC）ならびに関連inflammatory白血球は血管内ではなく、脳実質に浸潤するより隔離のままである。したがって、非炎症性の循環細胞、臓器の抽出と組織の処理の前に感染したマウスの大規模な心臓内灌流による隔離白血球の汚染を避けるために、血液区画を削除する場合は、この手順が必要になります。灌流後、脳を採取し、小片に解剖した。組織構造は、さらにその結果脳ホモジネートは、その後ミエリンおよび他の組織片から脳隔離された白血球の分離（BSL）が可能パーコール勾配に遠心分離されるコラゲナーゼDとDNase Iで酵素処理によって破壊されています。単離された細胞は、その後、フローサイトメトリーによってその後の分析のための蛍光抗体と血球計数器とステンドを使用してカウントし、洗浄する。

この手順では、炎症性白血球の包括的な表現型の特徴は、再の脳への移行を可能にするストロークだけでなく、ウイルスや寄生虫感染症を含む様々な刺激に応答特性。この方法はまた、前臨床動物モデルにおける新規抗炎症治療の評価のための便利なツールを提供します。

プロトコル

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1。 P.によるマウスの感染ベルゲイ -ANKA

  1. 霜凍結保存Pのアリコートベルゲイ ANKA PRBC。
  2. 両手拘束技術を用いて、脳マラリア耐性のBALB / cドナーマウス（8-12週齢）を抑制する。 1mlのインスリン注射器（28G針）を使用して、PRBCの100から200μlでマウスを注入します。日常的に、1-2ドナーマウスが注入される。
  3. 感染後4-5日で（pi）をケージからドナーマウスを削除して、ワークステーションまたは使い捨て作業パッドの上に置きます。
  4. ゆっくり尾の端でマウスを抑制し、小さなハサミを使用する（約1mm）尾の先端をカットします。代わりに、25 Gの針を使って小さな尾穿刺を行うことができた。
  5. 曇らされたエンド顕微鏡スライドの終わり近くにマウスの尾静脈から血液を一滴。
  6. 45°の角度で第2のスライド（スプレッダー）を配置し、一滴の血にそれをバックアップしてください。血液はエッジに沿って広がりたら、スプレッダー-スライド前夜をプッシュ血液塗抹標本を作るために顕微鏡スライドを越えnly。スミアが空気乾燥させてください。
  7. 30秒間100％メタノールに血液塗抹標本を修正してから10分間、新たに調製した染色でスライドを染色する。
  8. 1分間流水で血液塗抹標本をすすぎ、空気乾燥することができますし、顕微鏡（100倍、油浸）の下のスライドを調べる。千赤血球内PRBCを列挙し、パーセント寄生虫を計算します。彼らは実験動物の感染症のために血を流したことができる前にドナーマウスは百分の2.5から5の間に寄生虫のレベルに到達する必要があります。
  9. ヘパリン処理マイクロヘマトクリット毛細管を用いて眼窩出血によってドナーマウスから血液を採取します。全ての実験は、ウォルター·エリザホール研究所動物倫理委員会の要件に準拠して行われます。地元の動物倫理委員会の要件に応じて、他の出血の手順は、使用されるかもしれません。 1X10 6 pRBC/0.2 mlの最終濃度でRPMI培地中で血液の必要量を溶かす。それを考えてみましょう正常なマウスのヘマトクリット値は、〜6×10 9赤血球/ 1ミリリットルです。
  10. 腹腔内（ip）に1×10 6 pRBC/0.2ミリリットルを注入することにより、実験のC57BL / 6マウス（8-12週齢）に感染。
  11. 感染マウスの寄生虫レベルを監視するために、ステップ1.3から1.8に従ってください。寄生虫は、2日目または3πから始まる2〜3日ごとに決定されるべきである
  12. C57BL / 6マウスにおける重症マラリアの発症は猫背外観、エリマキ毛皮や低活性として現れることがあります。一部のマウスには、この段階で回復するかもしれませんが、自己立ち直り反射の消失への進行が不可逆的な疾患や動物を安楽死させなければならないことを示します。

2。マウスと脳抽出の心臓内灌流

  1. 60 cmのカラムスタンドの上部に取り付けられたカラムホルダーに500mlの貯水池を確保することにより、手動重力灌流システムを組み立てる。貯水池の底端部にプラスチックのチューブを接続し、バッファの流れを制御するためのチューブクランプを固定します。 23Gの針にチューブを取り付けます。 FILPBSでリザーバー（22℃に保た℃）までのlは、クランプとバッファはすべての気泡を除去するためにチューブを介して実行できるように開きます。
  2. 安楽死P. CO 2吸入によってベルゲイ ANKA感染マウス。ペダル、軌道や呼吸器の応答の有無によって死亡を確認します。
  3. 背プラスチックトレイに格納されている発泡スチロールの解剖ボード上の後ろ足と前足で安楽死させたマウスをピン。地元の動物倫理委員会の要求に応じて麻酔が心臓内pefusionの事前の開始を投与することができる。
  4. 70％エタノールで腹側を拭きます。
  5. 胸腔を露出するように正中線に沿って皮膚を開くために、大きなハサミとピンセットを使用しています。両側に折り、ピン肌。
  6. 細かい鉗子で胸骨を押しながら、横隔膜をカットし、胸骨の両側に沿ってリブを切断する。任意の大血管を傷つけないように注意してください。
  7. 頭の横に緩く胸骨によって胸郭をピン。
  8. 心室のウィットを保持hは細かい鉗子と細かいはさみで慎重に切開右心房。
  9. PBSが実行されている間上行大動脈に向かって左心室に重力灌流システムに接続されている23Gの針を挿入します。針先端のわずか0.5センチメートルを挿入します。
  10. 5分間または排水が透明になるまでマウスを灌流する。
  11. 固定を解除し、マウスとその腹部の上に横たわっていた。 70％エタノールで頭を拭いてください。
  12. 大きなハサミを使って、ちょうど頸髄領域の上のカットを行う。
  13. 頭蓋骨を露出するために離れて正中仙骨-吻側頭蓋底から始まるカット、剥離皮膚を作るために微細なハサミを使用します。
  14. 頭を抱え、それぞれの軌道の空洞に小さなハサミの刃を配置し、軌道の間のカットを行います。
  15. 矢状縫合に沿って長手方向の切り込みを入れ、慎重に外側にそれぞれの脳半球上の頭蓋骨をはがします。
  16. へらを使って、そっと脳を持ち上げ、RPMI培地を含む10mlの遠心管に入れてください。

3。脳隔離白血球の単離（BSL）

  1. 安全キャビネットでの作業、場所がたてたRPMI組織培養培地の3-5 mlを入れたペトリ皿の中でのステンレス鋼のセルストレーナー（40-60メッシュサイズ）の上に脳を収穫した。
  2. 小片に脳組織を切り取ります。
  3. クリスタルプランジャーを使用してセルストレイナーで脳組織の小片を押してください。
  4. 4℃で10分、250×gで10 mlのチューブと遠心分離機に脳ホモジネートを転送
  5. 0.05パーセントコラゲナーゼDと2U/ml DNアーゼIを含むRPMI培地3ml中でペレットを溶解
  6. 室温で30分間混合物を回転させます。 70μmナイロンセルストレイナーでおよび/または5分間氷上でインキュベートすることにより、混合物を押すことにより、細胞の破片を取り除きます。
  7. 室温で20分間、400×gで（ノーブレーキ）で7ミリリットル30％パーコールクッションと遠心分離機に脳ホモジネートを置きます。
  8. 5分〜氷上で赤血球溶解バッファーとインキュベート1ml中のペレットを再懸濁し心臓内灌流により脳から削除できませんでした付着PRBCを、溶解する。
  9. RPMI培地を9mlを加え、4℃で10分間、250×gで遠心分離し、細胞を洗う
  10. RPMI培地とエッペンドルフチュー​​ブに移す細胞の50〜100μLに再懸濁し、BSL-含有ペレット。
  11. 生細胞の同定のためにトリパンブルーで細胞サンプルを1:2の5〜10μlのアリコートを希釈します。
  12. 血球計数器を用いて顕微鏡下で生細胞をカウントします。 6日目以降はπ、Pからベルゲイ ANKA感染マウスは20,000-100,000 BSLsを回収することができる、神経症状が表示されます。

4。マルチカラーフローサイトメトリーによるBSLの免疫表現

  1. 4℃で10分間、250×gで遠心し、染色緩衝液50μl（PBS、1％ウシ胎児血清（FCS）、2mMのEDTA）に懸濁し、上清とペレットを吸引除去する。
  2. anti-CD16/32抗体（Fcblock）を精製し、1μlを添加する。
  3. 1細胞をインキュベート氷の上で0分。
  4. 染色緩衝液1mlで細胞を洗浄します。 4℃で10分間、250×gで遠心し、上清を吸引除去する。
  5. 必要な蛍光抗体、 すなわち抗CD4、抗CD8、抗TCRと抗NK1.1の所定の最適な希釈を含む染色緩衝液50μlの再懸濁します。
  6. 氷上で1時間インキュベートする。
  7. 染色緩衝液1mlで細胞を洗浄します。 4℃で10分間、250×gで遠心し、上清を吸引除去する。
  8. 100μlのPBSに細胞を再懸濁する。
  9. フローサイトメトリー用プラスチックチューブに細胞を移します。
  10. フローサイトメーターを使用して、少なくとも5,000〜10,000のイベントを取得する。必要に応じて適切な染色細胞のコントロールおよび蛍光補正のサンプルが含まれるべきである。
  11. 適切なフローサイトメトリー·ソフトウェアを使用して結果を分析します。

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結果

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図の結果。 2に示す比率と灌流したりunperfusedマラリアに感染し、ナイーブ対照マウスの脳から回収された別のBSLの人口の絶対数。議定書のテキストに示されているように隔離されたBSLは、PE-抗NK1.1およびAPC-抗TCR-β抗体で染色した。 7月9日以前の知見と一致して、αβTCR+ T細胞は、灌流しマラリア感染マウス（6日目PI）の脳におけるBSLプールの高い割合を占めている。この集団は著しく（図2A-B）の非灌流した動物の脳内に過小評価であるように見えた。これらの動物では（図2A-B）の非灌流した脳内T細胞の頻度の明らかな減少がかなり高い割合とダブルネガティブ細胞の総数- （ - NK1.1αβTCR）と関連していた。 unperfused脳内ダブルネガティブ細胞で高い割合と数字のみがマラリアに感染したマウスではなく、NA＆IUにも検出されなかったミリリットル、VEのコントロール、これらの細胞は、心臓内の血流が行われていない場合は炎症細胞と一緒に回収される脳血管中に存在する非炎症性白血球であることを示唆している。

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ディスカッション

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BSLの単離と解析、特性評価および実験マウスモデルにおける組織損傷または感染に反応して脳への移行の炎症性細胞の定量化を可能にする方法です。臓器の抽出とそれに続く細胞単離の前に血液区画の除去のための心臓内灌流ステップの導入は、非炎症性の循環白血球と炎症細胞の汚染を防止するのに有用である。これは、炎症細胞が脳実質5を貫通しているようなマウス脳脊髄炎ウイルスなどの神経向性感染に不可欠な要件であるが、感染赤血球及び炎症性白血球が残っている血管に隔離ではなく、脳組織に浸潤している、げっ歯類のマラリアに特に関連していない可能性があり。従って、マラリア感染マウスの心臓内灌流のみBSLの分析のために推奨されるべきではないだけでなく、ために有用かもしれない寄生虫組織隔離10,11の評価。非炎症性の循環白血球と同様に、マラリア原虫の未熟なフォームが血管内皮に付着することができないと灌流手順で削除する必要があります。これとは対照的に、付着したPRBC（成熟シゾント）は、脳の血管内に留まるように見えます。P.ルシフェラーゼを発現ベルゲイ ANKAトランスジェ...

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開示事項

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特別な利害関係は宣言されません。

謝辞

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著者は、技術支援のためにミスリアナMackiewiczに感謝したいと思います。この作品は、ビクトリア州政府業務インフラのサポートとオーストラリア政府は国立保健医療研究評議会IRIISSとプロジェクト無償1031212により可能となった。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名称 会社 カタログ番号 コメント（オプション）
ソリューションおよびバッファ
ギムザアズールエオシンメチレンブルー液メルクミリポア 1.09204.0500 蒸留水で1:10に希釈
RPMI培地マウス張
マウス張PBS 20 mMリン酸ナトリウム、0.149のNaCl、pH7.3の
0.4％トリパンブルーシグマアルドリッチ T-8154 1:2希釈
コラゲナーゼD 生化学ワージントン
Deoxyribonuclease（DNアーゼ）私シグマアルドリッチ D4263-5VL ウシ膵臓由来
パーコール GEヘルスケア 17-0891-01 PBS中30％溶液
純トリスインビトロジェン 15505-020
塩化アンモニウム（NH 4 Cl） AnalaR 10017
赤細胞溶解バッファー 17 mMトリス、14nMのNH 4 Cl、pH7.2の
FCS ギブコ 1009
EDTA二ナトリウム塩メルク 10093.5V 0.1M、pH7.2の
抗体とコンジュゲート
抗マウスCD16/CD32（FCブロック）、クローン2.4G2 BDファーミンジェン 553142 50μLの染色緩衝液で1μL（0.5mg/50ミリリットル）
FITC-抗マウスCD4、クローンH129.19 BDファーミンジェン 553651
PE-抗マウスNK1.1、クローンPK136 BDファーミンジェン 553165
PerCPCy5.5抗マウスCD8、クローン53-6-7 BDファーミンジェン 551162
APC-抗マウスTCR-β、クローンH57-597 BDファーミンジェン 553174
PE-抗マウスCXCR3、クローン220803 R＆Dシステムズ FAB1685P
ビオチン化抗マウスCCR5、クローンC34-3448 BDファーミンジェン 559922
ストレプトアビジン-も、PerCP-Cy5.5 BDファーミンジェン 551419
機器と材料
SuperFrost顕微鏡スライドボシュロムメンツェル-グレイザー
解剖用ピンセット、はさみ REDA Instrumente
500ミリリットルのPBS貯水池ナルゲン
ゴムチューブ
23G針 BD PrecisionGlide 302008
金属ふるいを含む細胞解離キットシグマアルドリッチ CD-1
70μmのナイロン細胞ストレーナー BDファルコン 352350
血球計 GmbHはノイバウアー 717810
フローサイトメトリー管 BDファルコン 352008

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
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  6. Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
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