ニワトリ胚における軸索軌道とシナプスターゲットを追跡する後脳のエレクトロ

サマリー

発達神経生物学の根本的な問題はどのように神経細胞のネットワークが胚の脳の中で確立されています。ここでは、そのようなのCre / LOX-プラスミドおよび背側介在ニューロンにラベルを付け、様々な発達段階でそれらの軸索投射やシナプスの標的を追跡する鳥類の後脳におけるpiggyBacを媒介DNA転位システムなどの小説の遺伝的なツール、とエレクトロポレーション技術を組み合わせた。

要約

ニワトリ胚の神経管のエレクトロポレーションは、例えば、神経細胞への外来遺伝子の発現のための迅速かつ効率的なものとして多くの利点を有する。本稿で我々は、特に神経前駆細胞のサブセットにラベルを付けるために、E2.75で鳥類の後脳にDNAをエレクトロする方法を一意に示し方法、どのように開発のより高度な段階で、その軸索投射やシナプスの目標に従うことを提供しますまでE14.5まで。ベースのプラスミドおよび後脳細胞（ニューロン、DA1の背最もサブグループ）のサブタイプでGFPの発現を駆動するpiggyBacを媒介DNA転位システム - 私たちは、特定のエンハンサーエレメント、Creを/ロックス含む小説遺伝のツールを利用してきた。 DA1軸索の軸索軌道と目標は、さまざまな脳幹領域に初期および後期胚の段階で続いている。この戦略は、胚後脳における目的の細胞を標的とするためとTRAのための高度な技術に貢献開発の複数の段階での回路形成をcing。

概要

後脳は、神経回路網を昇順と降順を介して、中枢および末梢神経系の間で通信することにより、神経系の主要な中継ハブを表しています。それは呼吸、意識、聴覚、およびモータ協調^1-3を含む基本的な機能を調節する。初期胚発生時には、脊椎動物の後脳を一過異なる神経細胞型が形成され、複数の脳幹核センター^4が生成されている反復的な菱へとその前後（AP）軸に沿って分割されます。後脳はまた、個別の神経前駆細胞は、指定されたとなり、明確なDVの場所^3,5,6で分化れる基底とエイラープレートにその背腹（DV）軸に沿って分割されています。どのように早期のAPとDV固有ニューロンのパターンが機能脳幹回路網の確立を支配していることはあまり知られていない。

この基本的な知識を得るために質問、ツールは早い後脳の神経細胞の特定のサブセットにラベルを付けると、より高度な段階でそれらの軸索の軌道と接続性をトレースするために必要です。我々は以前、特定のエンハンサーエレメント、および早期のニワトリ胚^7-9に背側脊髄介在ニューロンの軸索軌道を追跡するためのCre /のLoxPベースの条件式のシステムを利用してきた。現在の原稿では、後脳を対象とし、修正されたエレクトロポレーション戦略とpiggyBacを使用して、後期胚後脳ニューロン、軸索とそのシナプスの標的を標識するための実験的なパラダイムをアップグレードした - 媒介DNAの転置を。私たちの新しい戦略は、エレクトロポレーション後2までの12日から、後脳の片側に異なる神経細胞サブタイプのタグ付け、様々な胚の段階でそれらの軸索投射やシナプスのサイトのトラッキングを可能にします。この方法に基づき、我々は後脳ニューロン（dA1/Atoh1 ⁺の背ほとんどサブグループのラベルが付いた細胞）および2対昇順軸索投射パターンを明らかにし、それぞれが異なる索内の別のAPの位置と伸長に由来しています。 DA1軸索は、プロジェクトと聴覚核、中脳および小脳¹⁰の複数の層のフォームシナプスに発見された。

ひよこのエレクトロポレーションの組み合わせは、遺伝的にはニューロンと開発の多くの先進的な段階で投影サイトの分析のトレース、脳内の神経ネットワークの形成を研究するために、回路形成を支配する分子メカニズムを解明するユニークなプラットフォームを提供します。

プロトコル

1。後脳のエレクトロ

1.1卵の取り扱い

1. 加湿インキュベーター（37から38.5℃）に水平に卵を置きます。胚は、彼らは16-17（HH）ステージ（25〜30体節）に達したときに、インキュベーションの65-70時間後にエレクトロポレーションされています。
2. インキュベーターから卵を外し、彼らは水平位置に残ります。

1.2準備

1. ガラスキャピラリー（直径0.5mm）を引き出します。
2. パルス発生器にアダプタ保持して屈曲L字状の金Genetrodes電極（直径3mm）を接続する。エレクトロポレーション·パラメータは、25ボルト、5パルス数、45ミリ秒のパルス長、300ミリ秒パルス間隔が含まれています。
3. 口のピペット、10ミリリットルの注射針、パラフィルムストリップ、柔らかいブラシ、鋭い解剖はさみ、25 mlの滅菌PBS溶液を準備します。この量は、通常、卵トレイ（18卵）を処理するのに十分である。
4. DNAプラスミドの適切な混合物（5μgの/μlのそれぞれ）を準備し、DNA注入を可視化するために約0.025％ファストグリーン染料を追加します。通常4μLの容積は、トレイの注射のために十分である。

1.3ウィンドウイング、注射とエレクトロ

1. 70％エタノールで卵の殻をきれいにします。
2. 空気に胚の露光時間を最小限にするために一つずつ卵を扱う。
3. はさみ両端卵ポールに穴を作り、シリンジでアルブミン3-4ミリリットル取り除く。それは可能性を減少させるのでアルブミン多量のを削除しないでください。
4. 解剖ハサミを使って卵の殻の上部中央にある小さな楕円形の窓（2.5×2センチサイズ）を開きます。
5. 全体のプロセス中に乾燥を防ぐために、胚の上にPBSを数滴垂らし。
6. ガラス中にDNA混合物の少量を読み込む口のピペットを用いてキャピラリ。
7. あなたに向かって、その後端に胚を置きます。胚がはっきり見えるようにインク噴射がこの段階で必要とされない。インク注入が増大を回避すること胚の生存。 〜45°でキャピラリーを保持することによって尾後脳に浸透。胚の周りからの膜を除去しないでください。気泡を形成することなく、後脳内腔と呼気に慎重にDNA溶液を注入する。 DNA溶液は、前方に広がる。
8. すぐにDNA注入後、ターゲットを目指して正確なAPとDV後脳の位置で平行電極を配置。それは可能性を減らす可能性があるので、心に触れることなく少し腹の電極を押してください。エレクトロをパルス。電極（ 図1A）電気伝導性を示すために、泡で覆われるべきである。
9. 慎重に電極を除去し、胚を冷却するために、泡を除去するためにPBSを数滴垂らし。インキュベーション中に乾燥を防ぐためにパラフィルムストリップで正しく開く卵を密封。柔らかいブラシで、PBS中の電極を洗浄します。
10. 時間の希望の長さのためにインキュベーターに卵を置きます。胚の生存率は約90％の2-3日後ですエレクトロポレーション、およびエレクトロポレーション後に50％の12日まで減少します。

2。胚の分析

2.1フラットマウントの準備と免疫

1. 後脳のフラットマウントの準備が簡単に顕微鏡やステレオ顕微鏡下で軸索を可視化するためにE6.5まで行うことができます。
2. 膜及び血管周囲から分離によって注意深く胚を解剖。 PBSを含むコーティングされたペトリ皿-小さなシリコーンで胚を置きます。背側に面しタングステンピンと皿に胚を取り付けます。後脳鋭いガラスキャピラリーを用いた屋根板に背スリットを実行します。
3. 鋭いピンセットとマイクロはさみを使用すると、頭の上部を保持し、吻側から尾側に非常に慎重に後脳組織を引っ張る。後脳を分離した後、クリーン準備に達するために、残りの腹側組織を削除します。
4. 4と後脳をインキュベート％パラホルムアルデヒド（PFA）室温（RT）で1〜2時間のためのソリューション。 PFAを削除するには、PBT（PBS/0.1％トリトンX-100）と後脳を洗ってください。
5. フラットマウントhindbrainsは4でON 1 ^回目の抗体°PBTとで洗浄（15分×3）でRTインキュベートで2時間PBTとインキュベートでブロッキング溶液を500μl（ヤギ血清の5％を追加します。インキュベートで免疫用室温で2時間で2 ^回目の抗体。PBT（15分×3）で洗うこと。
6. スライドガラス上に背側に面し後脳を置きます。後脳の上に蛍光灯取り付けメディアを追加します。スライド上に後脳を平らにガラスキャピラリーやタングステン針を使用してください。
7. カバースリップによる組織の圧搾を防止するために、各角部にグリースを少量加える。後脳の上にカバースリップを慎重に配置し、気泡を避ける。遵守のためのガラスのエッジをカバーするためにマニキュアを追加します。

2.2クライオセクションと免疫

1. 脳幹CAのクライオセクションnは軸索軌道を可視化する任意の段階で行われる。しかし、E6.5後これはあまりにも厚くなり、フラットマウント胚で軸索を可視化することが困難であるため好ましい方法でなければなりません。また、シナプスのデモは、組織と顕微鏡下で高倍率ビューの切片が必要です。
2. 胚を解剖し、すべての周囲の組織を削除します。 PBSですすいでください。マイクロはさみと鋭いピンセットを使用して延髄の尾部分に胚をカットします。小脳と中脳の間に広い切開を行い、全体の脳幹を削除します。組織が髄質、橋と小脳を含むべきである。
3. PBS（10分×3）ですすぎ、4℃で一晩4％PFA（ON）°Cで脳幹を修正し、ON 4℃で沈没するまで、30％ショ糖でインキュベート。
4. 10月（最適切削温度）化合物と低温型で後脳を埋め込 ​​むと、他の場所で¹¹説明されているように、凍結まで-20°Cでそれを配置します。
5. 希望の断面軸でクライオスタットでのOCTブロックを置きます。セクション幅は12μmである。
6. スライドを乾燥させます。室温で2時間、各スライドに100μlのブロッキング溶液を追加。抗体100μlの（所望の濃度にブロッキング溶液で希釈した）を追加します。 ¹回目と2 ^回目の抗体についての潜伏期間は4でONになっているそれぞれRT℃でまたは2時間、。それぞれのインキュベーション時間は、穏やかに乾燥を防ぐために、スライドの上にパラフィルムストリップを追加します。抗体間のPBS（10分×3）で洗浄します。必要に応じて、RTで20分間PBSで希釈1:1000 DAPI（4'-6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール）を加える。 PBSですすいでください。
7. 蛍光灯取り付けメディアとスライドをマウントします。分析の前に1時間乾燥させます。

結果

このプロトコルは、最近ニワトリ後脳¹⁰におけるニューロンのDA1サブグループの軸索パターンと投影サイトを発見するために使用された。具体的には、これらの軸索を標識するために、予め脊髄ニューロン^8,12,13 DI1に特異として特徴付けられているエンハンサーエレメント（ATOH1）は、後脳DA1セル¹⁰で発現することが確認された。要素は、CreリコンビナーゼとプラスミドのCre依存細胞質GFPレポーター（; 図1BI pCAGG-のLoxP-ストップのLoxP-CGFP）とともにE2.75でCOは、エレクトロの上流にクローニングした。 Hindbrainsは、フラットマウントの準備で48時間以下のエレクトロポレーションを分析し、2対側昇順軸索投射パターン（ 図2A）を明らかにした;、一方の管はもっぱら、後索に細長いこと6-7菱に位置DA1ニューロンから派生したもう一つは、菱2-5由来および横索に延長。

ディスカッション

OVOエレクトロポレーションでひよこ神経系の発達の間に²⁰セルの仕様と軸索ガイダンスを検査するために、実現可能な信頼性の高い、効果的なツールです。このプロトコルでは、特定のニューロンの条件付きラベルを有効にエンハンサーエレメントを使用してE2.75でニワトリ後脳におけるエレクトロポレーションのモードを説明します。この戦略は、胚発生の高度な段階で軸索経路、予測とシナプスのサイトの追跡可能ニワトリゲノムに外来遺伝子を挿入するためにpiggyBacを媒介転置システムと組み合わされています。

ニワトリ後脳におけるラベル軸索/シナプス前の方法は実験^21-23をラベルまたは移植古典逆行や順行性染料が含まれていた。これらの研究は、軸索路を昇順と降順の後脳の重要な発見を提供してくれました。しかし、いくつかの軌道と予測は、これらの細胞のアプローチが見落としていた。 ADDITでイオン、報告funiculusの複数形に投影ニューロンのサブグループの分子身元が明らかにすることができませんでした。当社組み合わせエ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
L字型金ジェネトロード3mm電極	BTX、ハーバード装置	45-0162
パルス発生器、ECM 830	BTX、ハーバード装置	45-0002
OCT(最適切断温度)化合物	組織-TEK桜	4583 OCTコンパウンド
ネイルポリッシュ	商業サプライヤー