マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

サマリー

パイエル板の細胞の特定の亜集団（PPS）、腸管関連リンパ組織の主要な誘導部位の免疫学的機能を理解する上で関心が高まっている。ここでは、フローサイトメトリー解析と免疫染色のためのPPの凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルの概要を説明します。

要約

パイエル板（PPS）は腸管関連リンパ組織（GALT）の不可欠な構成要素であり、腸の免疫監視と恒常性に中心的な役割を果たします。腸管腔における粒子状抗原や微生物を連続濾胞関連上皮にPP M細胞によってサンプリング（FAE）と樹状細胞（DC）、マクロファージ、リンパ球の基盤となるネットワークに輸送される。この記事では、我々は、マウスのPPは、（i）単一細胞懸濁物に解離され、フローサイトメトリーにかけ、（ii）の凍結セクショニングと免疫染色のために準備されているプロトコルについて説明します。フローサイトメトリーのために、PPは機械的に解離され、次に上皮細胞と大きな破片の自由な単一の細胞懸濁液を生成するために70μmの膜を通して濾過した。 20から25 PPS（4匹から）以降では、この度は迅速かつ再現性のある方法は、> 90％の細胞生存率> 2.5×10 ⁶細胞集団が得られます。凍結セクショニングのため、新鮮なLY孤立PPはcryomicrotomeを使用して、最適切断温度（OCT）培地、液体窒素で瞬間凍結し、切片に浸漬される。組織切片（5-12μm）は、アセトンやメタノールで固定し、空気乾燥され、その後免疫標識を行った。

概要

パイエル板（PPS）は、ヒトおよびマウスの小腸（ 図1）を全体に存在する組織化されたリンパ濾胞の巨視的凝集体であると粘膜免疫応答は食物抗原、共生細菌、病原微生物、及び経口ワクチンに対して開始されるときの主要な部位を構成^1-4。このような腸間膜リンパ節など他の末梢リンパ組織とは異なり、PPは、輸入リンパ管を欠いている。このように、PPSに適応免疫応答は、腸管腔に由来する抗原に応答して駆動されています。管腔の抗原のサンプリングは、腸およびM細胞として知られている抗原のサンプリングセルの両方で構成されている濾胞関連上皮（FAE）によって達成される。 FAEの下に、サブ上皮ドーム（SED）の領域では、マクロファージ、B細胞、CD4 ⁺ T細胞は^5月9日と混ざり樹状細胞（DC）のネットワークがあります。各PPリンパfolliclの中核にeは、濾胞樹状細胞（FDCS）とT細胞が豊富な濾胞ゾーンが隣接のB細胞が豊富な中央の胚中心である。のIgA + B細胞plasmablastsとCD4 ⁺エフェクターとメモリセルの開発にPPSの結果による抗原サンプリングその種子周囲の粘膜固有層および粘膜侵略に広い範囲への耐性を提供します。

PPSの抗原サンプリング、処理、プレゼンテーションに関連する複雑な免疫学的事象を解剖すると、PP細胞が腸管粘膜における総リンパ球様細胞のごく一部....

プロトコル

動物は、従来、特定の病原体を含まない条件下で飼育し、ワズワースセンターの機関動物実験委員会（動物実験委員会）のガイドラインに完全に準拠して処理した。

1。経口胃管栄養法

1. 22 G 1.5倍インを使用して、目的の抗原や微生物との選択（任意）強制経口マウス系統。平滑末端給餌針（Popperの科学、ニューハイドパーク、ニューヨーク州）。配達ボリュームはマウス当たり400μlを超えないようにしてください。

2。フローサイトメトリー用のPP細胞の単離

1. 制度的動物のケアと使用委員会（IACUC）のガイドラインによると、CO ₂窒息によりマウスを安楽死させる。
2. 70％エタノールまたは手術前ベタジンで腹部を清める。胸郭の底から1.5cm約正中線に沿って始まり外科グレードのはさみを使用して、単一の（1cm）に切開を伴う標準的な開腹手術を行います。当たりを公開itoneal空洞と盲腸を識別します。回腸、盲腸の接合部に端子小腸を切り取ると優しくその全体が腸を削除します。それは腹膜腔から除去されるように腸組織を過度に伸ばすないように注意してください。
3. 湿ったペーパータオルやキムワイプのベッドの上で小腸を築く。組織の脱水を防ぐために、生理食塩水で軽く小腸を濡らす。視覚的に腸の抗腸間膜側（ 図1）の、其....

結果

合計PP細胞の単分散懸濁液を用いたフローサイトメトリー解析は良いと貧しい細胞調製の間に明確な区別を明らかにする。 80％以上の生存率との良好な細胞調製では、細胞の大半は高い前方散乱（FSC）、高細胞容積の指標、および低側方散乱（SSC）が、低い細胞粒度（ 図2A）のインジケータを示しています。この実験では、我々はまた、意図的に（代わりPHEMのPBSプラス1％FCSを含む細胞をインキュベートする、最後のステップで、室温（代わりに氷の上での）での分離工程中にPP細胞をインキュベートするとによって "貧しい細胞調製"を作成バッファ）。これらの貧しい細胞調製では、細胞の大部分は低FSCと高いSSCを発揮し、指示されたゲートR1（ 図2B）の外にあります。これらの細胞は、おそらくアポトーシスおよび/または壊死を受けています。

図3は、4ジまでのカクテルの使用方法を示していPPの単一細胞懸濁液に種々の細胞型の間で区別するfferentフルオロフォア標識モノクローナル抗体。 B細胞が構成して.......

ディスカッション

この記事では、我々は免疫染色、フローサイトメトリーおよび機能解析および凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルを提供してきました。どちらの方法でも、フローサイトメーターとクライオスタットが利用可能である限り、再現性の高い、容易にアクセス可能です。初めての調査官のためには、脾臓と比較すると、PPSからの全細胞収量が比較的貧弱であることが指摘されるべきである。それにもかかわらず、プロトコルは、我々は一般的に単一のマウス0.8から1.2×10 ⁶合計PP細胞間の利回りを概説しています。我々は一般的に20から25プールPPSよりもうやりませんが、スケールアップが可能であり、なぜなら、私たちの経験では、凝集が大幅に（と生存率）の低下を発生し、細胞収量。臨界質量が正常に全体の単離操作を介して細胞を運ぶために必要であるように一方、我々は、このプロトコルのために15名未満のPPを使用することは推奨できません。最大の細胞生存率は下流に機能の優先事項である場合アッセイは、我々は、単離された細胞の小さな試料がより正確なゲー合計PPの細胞集団からの細胞の生存可能なプールを可能にするためにヨウ化プロピジウム染色.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アイテム	会社	猫。 ＃	コメント（オプション）
OCTコンパウンド	組織 - Tek社	4583
7x7x5 mmベース金型	Fisherbrand	22-363-552
ImmEdgeペン	ベクトルラボ	H-4000
Superfrostプラススラ​​イド	サーモサイエンティフィック	4951
エッジ儀式ブレイド	サーモサイエンティフィック	4280L
抗マウスのCD11c-PE	eBioscience社	17-0114-82
抗マウスCD45R/B220-APC	BD Pharmigen	553092
抗マウスCD3-FITC	BD Pharmigen	561798
抗マウスCD4-PE	BD Pharmigen	553652
抗マウスCD8-PE	BD Pharmigen	553032
抗マウスCD19-PercP	BioLegend	115531
フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩溶液（HBSS）	フィッシャー·サイエンティフィック	14175-079
70μmのセルストレーナー	BDファルコン	352350
脾臓解離ミディアム	電池技術を食い止める	7915
ヤギ血清	インビトロジェン	16210-072
FCブロック	ATCC 2.4.G2	HB-197	細胞株から得られた2.4.G2 Supes
湾曲したシザー	FST	14061から09
低温保持装置	ライカ	3050S
FACSソウルキャリバー	BD
伯爵セルカウンター	インビトロジェン
ヘマトキシリン	リチャード·アラン	7211
エオシン	リチャード·アラン	71304
ホルマリン	Starplex科学	3661
			表1本研究で使用した試薬および装置。