ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

サマリー

ナノ粒子トラッキング解析（NTA）とポリマー遺伝子送達ナノ粒子を評価するためのハイスループットフローサイトメトリーのためのプロトコルが記載されている。国税庁は、ナノ粒子の粒度分布およびプラスミド当たり粒子分布を特徴付けるために利用される。ハイスループットフローサイトメトリーは、遺伝子送達バイオマテリアルのライブラリの定量的なトランスフェクション効率の評価を可能にします。

要約

高分子ナノ粒子を用いた非ウイルス遺伝子送達は、遺伝性疾患^1、再生医療²技術としての治療に遺伝子治療のための魅力的なアプローチとして浮上している。重大な安全上の問題を抱えているウイルスとは異なり、高分子ナノ粒子を化学的、多目的な大きな核酸貨物を運ぶことができるし、生分解性および/または環境対応、合成するために、非毒性、非免疫原性、非変異原性、より簡単になるように設計することができます。カチオン性ポリマーは、一般に高分子ナノ粒子と呼ばれる100nmのオーダーで複合体を形成するために、静電相互作用を介して、負に荷電したDNAを用いて自己組織化する。ナノスケールポリカチオン性遺伝子送達ナノ粒子を形成するために用いられる生体材料の例としては、ポリリジン、polyphosphoesters、ポリ（アミドアミン）sと一般的に核酸送達^1,3に使用される非分解既製のカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン（PEI）を含む。ポリ（β-アミノエステル）（PBAEs）は^、5,6加水分解性であり、そのような人間の網膜血管内皮細胞^（HRECs）7などのハードへのトランスフェクション細胞型への遺伝子送達に有効であることが示されているカチオン性ポリマー⁴の新しいクラスであるマウス乳腺上皮細胞^8、人間の脳のがん細胞⁹および¹⁰の大血管障害（ヒト臍帯静脈、HUVECを）内皮細胞。

ナノ粒子トラッキング解析（NTA）を利用した高分子ナノ粒子を特徴付けるための新しいプロトコルが記載されている。このアプローチでは、粒度分布と粒子あたりのプラスミドの数の分布の両方が^11を得られる。さらに、ポリマーナノ粒子のトランスフェクション効率の迅速なスクリーニングのためのハイスループットの96ウェルプレートのトランスフェクションアッセイが提示される。このプロトコルでは、ポリ（β-アミノエステル）（PBAEs）をモデルポリマーおよびヒト網膜内皮細胞（HRECs）として使用されているMOとして使用されているデルヒト細胞。このプロトコルは、簡単に任意の高分子ナノ粒子およびマルチウェルプレートフォーマットの関心の任意の細胞型を評価するために適合させることができます。

概要

ナノ粒子あたりの複合体化プラスミドの数の決定は、特に同じ細胞標的に多数のプラスミドの共同配信のための効果的なナノ粒子ベースの遺伝子送達戦略を設計することが重要である、などがしばしば研究^{12を再プログラム}幹細胞が必要である。単一ナノ粒子に関連付けられたプラスミドの数を計算するためのいくつかのアプローチについて説明し、それぞれのアプローチは、推定^13から16に用いられる技術の欠点を持っているされています。 TEMと組み合わせ量子ドット（QD）標識は、キトサンをベースとしたナノ粒子の粒子あたりのプラスミドを推定するために使用されています。カプセル化された非標識のDNAを直接検出されていない可能性;、この量子ドット技術を用いた推定が原因で、その自己アセンブリのプロパティを変更することができるDNAを標識する必要に複雑になる可能性のある粒子の2次元TEM像でプラスミドおよび量子ドットの重複、および他の単純な仮定^13。ある代替的アプローチpplicable命じたマイクロドメインは、粒子内に存在する場合は低温透過型電子顕微鏡（クライオTEM）、X線散乱、動的光散乱^{（DLS）14,15}を介して、リポ-DNA複合体を研究するために使用されています。残念ながら、そのようなここで検討高分子ナノ粒子などの材料は、このメソッドを使用して適用されません。別の研究では、Collins らが勉強するために、フロー式粒子像分析技術（Lys）の₁₆含有ペプチド/ DNA複合体を用いているが、それらの方法は、大きく、ミクロンサイズの粒子^16を評価^すること^ができます。したがって、我々は最近、ナノ粒子あたり¹¹プラスミドの数を定量化するための斬新かつ柔軟なアッセイを開発した。

プロトコル

1。細胞播種

1. 細胞はoverconfluencyに成長することはできません。初代細胞をトランスフェクション時の早期継代細胞を使用しています。
2. トランスフェクションの前に二十四時間後に、細胞をトリプシン処理、血球計算盤を用いて細胞をカウントし、所望の細胞密度（細胞/ボリューム）を達成するためにメディアを細胞懸濁液を希釈します。貯水池とマルチチャンネルピペットを使用してクリア組織培養処理平底96ウェルプレートに種子細胞。選ばれた密度はトランスフェクション当日に密集度70-80％を与える必要があります。 表1に表示されているように、たとえば、細胞がここに示されているトランスフェクション·データ用25から50細胞/μlに希釈した。

2。細胞トランスフェクション

1. ポリマーとDNA株式の希釈。室温（RT）でポリマーとDNA原液を解凍します。 12チャンネルピペットを使用してクリア、96ウェルプレートで個別に、高分子原料溶液とDNA原液を希釈し、DNAの重量比（重量/重量）に所望のポリマーの重量を得るために必要な濃度に適切な溶媒で​​。この場合、選択された溶媒は、25mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH = 5.2）である。
   1. DNAの希釈。典型的には、1 mg / mlとなるように格納されたDNAは、非組織培養処理された透明な96ウェルプレート（単一製剤用井戸1）で0.03から0.06 mg / mlの濃度になるように酢酸ナトリウム緩衝液中で希釈されています。 表2に示すようにステップ1からの細胞を播種し、96ウェルプレートで4反復ウェルをトランスフェクトするために使用される単一の製剤のための典型的なDNA希釈プロトコル。
   2. ポリマー希釈。 100 mg / mlのポリマー/ DMSO溶液を、DNA重量/重量比を所望のポリマーを得るために必要な濃度に応じて酢酸ナトリウム緩衝液で希釈する。典型的に、ポリ（β-アミノエステル）（PBAEs）を用いた遺伝子送達のために使用重量/重量比の範囲は20から100です。 PBAEポリマーは、最初の希釈のp、続いて10 mg / mlに希釈されるrotocolは、 表3に示す。ポリマー希釈液をDNA希釈プレートの試料方位と一致する明確な非組織培養処理された96ウェルプレート中で行うことができる。
2. ナノ粒子形成。 12チャンネルピペットを用いてプラスミドDNA溶液を等量にPBAE溶液を加えて激しく混ぜる。自己組織化できるように、室温で10分間インキュベートして混合してみましょう。
3. ナノ粒子のトランスフェクション。自己組織化の後、20μlのナノ粒子は、12チャンネルピペットを用いて培地に滴下して、ウェルあたり追加されます。複製ウェルは未処理のまま放置されるか、またはコントロールとして市販の試薬を用いてトランスフェクトされる。トランスフェクトした細胞を37℃でインキュベートする2〜4時間後、井戸のCは新鮮な培地（100μl/ウェル）に置き換えられます。インキュベーション時間の選択は、細胞株、培養条件、トランスフェクションシステムに依存します。トランスフェクションの違い潜伏期間を変化させた結果として、効率と細胞毒性は、ステップ3で説明した分析プロトコルによって定量化されます。

3。トランスフェクション効率と細胞毒性の解析

トランスフェクション効率を蛍光顕微鏡を用いて視覚的に分析して、四十八時間トランスフェクション後、フローサイトメーターを用いて定量する。細胞毒性は、蛍光顕微鏡を用いて視覚的に分析し、CellTiter 96水1つのアッセイ二十四時間後、トランスフェクションを用いて定量する。

1. 蛍光顕微鏡。視覚的に適切な蛍光チャネルを使用してトランスフェクトされたレポーター遺伝子（例えば、EGFPまたはDsRed）を発現させるために井戸を分析します。適切に特定の製剤（ 図1）トランスフェクション効率を表すビューのフィールドを選択し、各ウェルのために画像を取得する。目視で観察し、任意の細胞毒性をメモしておきます。
2. フローサイトメトリー。
   1. フローサイトメトリー用の96ウェルプレートを準備するためにマルチチャンネルピペットを使用しています。エッジの周囲を含めて、各ウェルにピペッティングし、170μlのFACS緩衝液（PBS +2％FBS）を中和し、トリプシン/ EDTAの井戸/ 30μlをトリプシン処理し、PBSで洗浄し、全体の200μlのボリュームを転送丸底またはV底96ウェルプレート内の対応するウェルに各ウェル。
   2. 4℃で5分間、130×gでプレートを遠心
   3. 泡を避けながら、細胞を再懸濁するために各ウェルにピペットから170μlのメディアを取り出します。各ウェルに;生存率はヨウ化プロピジウム（PI）のように染色に使用するために、FACS緩衝液+ PI（PIのストック濃度1 mg / mlのPIの希釈は50:1 FACS緩衝液）の10μlを添加する。すぐに氷上に置き、光からカバーしています。
   4. C6 Accuriフローサイトメーター、96ウェルアタッチメントHyperCyt、とHyperViewソフトウェアを起動します。適切なpを選択するHyperViewはデザインとプロトコルタブを使用して、晩期型、プレートレイアウト、及びそのようなブレ/ SIP /振る/すすぎ時間などの他の設定。上記のプロトコルの場合は、以下のパラメータが1分、2400 rpmで30秒間プレプレートブレプレプライムプレートを使用した。一口時間は15 rpmで15秒に設定された、プローブは2秒ごとによくすすぎ、およびインターウェル2400 rpmで12秒ごとに12個のウェルを横に振る。間によく振って、細胞がウェルのグループ間のタイムアウトブレーク（この場合は12秒）を含めることにより、データを処理する能力の向上のためだけでなく、メディアに分散させておくことが重要です。
   5. 適切なだけでなく（ 図2）にデータと独立を処理するためにHyperViewはまあ[識別情報]タブを使用します。個々のウェルを識別するためには、高度な設定の下でさえフィルターベースを含むだけでなく、ソフトウェアのノイズフィルタを使用するように助けることができます。
   6. 別のポップアップを分離するために適切なゲーティングによって積極的にトランスフェクトされた生細胞の割合を定量化警告事項（ 図3）。最初の破片（ 図3A）から細胞を分離するために、FSC対SSCの散布図のフローデータを表示します。もしプロピジウムアイオダイド（PI）は、死んだ細胞やゲート生細胞から生細胞を分離するために、FSC対FL3のプロット上のデータは、そのゲート個々の細胞集団およびビューを使用した。適切なチャネルでライブ細胞集団を表示するには、トランスフェクトされた細胞の数を定量するために、例えば、GFPは、FL1で見ることができます。ゲートはバックグラウンド信号（ 図3B）を識別するために、未処理人口は、未処理の細胞を使用して。積極的にトランスフェクトされた細胞は、その後、散布図と等高線プロット（ 図3Cおよび3D）の両方を使用してトランスフェクトされた集団を表示することによって、このゲートを用いて単離することができる。異なる細胞が蛍光の異なる程度にトランスフェクトされるように、積極的にトランスフェクトされた細胞の連続があるかもしれません。
3. CellTiter 96水1つのアッセイ
   1. 細胞毒性測定用とまったく同じ方法で、別のプレートをトランスフェクトする。
   2. 10ミリリットル新鮮なメディアとのCellTiter 96水相アッセイ溶液のプレミックス1ミリリットル。細胞から培地を取り除き、予混合溶液を110μL+ウェルごとにメディアを追加するには、マルチチャンネルピペットを使用しています。
   3. 未治療の状態でよくから吸光度がアッセイの直線範囲になるまで、1〜4時間毎に1時間間隔490 nmで吸光度を測定します。唯一の解決策+バックグラウンドの吸光度の読み取りのためにメディアを持つ4つのコントロールウェルを含む。
   4. 条件ごとに4つの複製ウェルの平均吸光度値を、それぞれの平均から平均バックグラウンドの吸光度を差し引きます。 ％の細胞生存率を決定するために、未処理の状態の補正後平均的に各処理条件の補正平均値を正規化します。

NTAとプラスミドパーティクル単位の計算とサイジング_title "> 4。ナノ

1. 約5分の1、最大速度と最大速度の約10分の1で後方サンプルポンプで前方希釈剤ポンプを実行することにより、NanosightのNS500の総理流体システム。流体工学システムは希釈液でフラッシュされるまで継続する。
2. 分析するためにナノ粒子を準備します。 PBAEsの場合、別々のエッペンドルフチュー​​ブ中の酢酸ナトリウム緩衝液（25mM、pHは5）に株式プラスミドDNA（1 mg / ml）と株式PBAE（100 mg / ml）を希釈してください。
3. 0.06 mg / mlにプラスミドDNA濃度を希釈します。ポリマー濃度は、DNA（例えば、60重量/重量粒子に対しては、ポリマーは3.6 mg / mlに希釈される）へのポリマーの所要重量対重量比に応じて変えることができる。
4. プラスミドDNA溶液を等量にポリマー溶液を加えて激しく混ぜる。自己組織化を可能にするために10分間、室温で混合物をインキュベートする。
5. ディリュートナノ粒子濃度のために、100倍にPBSにナノ粒子溶液は、国税庁の適切な範囲にあることが、少なくとも500μlの最終容量を取得する。
6. サンプルエッペンドルフチューブ（ 図4A）にロードチューブを配置することによってNanosightにサンプルをロードします。気泡を導入しないことを確認してください。
7. 粒子が見られるまで、キャプチャモードでは、カメラのレベルを上げる。粒子（ 図4Aおよび4B）滑らかに見えるようにピントを合わせてください。
8. 標準モードでは、すべての粒子が画面上に示されている点を過ぎて、カメラのレベルを調整します。その後、粒子はすべてまだ観察することができるような最低レベルにカメラのレベルを減少させる。中間のカメラのレベルが必要な場合は、高度なモードにし、適切なレベルにカメラのシャッターとゲインを変更します。
9. 視覚的に20の間にあるかどうかを確認してください - S上の100個の粒子をcreen。ナノ粒子の追跡のための理想的な数は、約50個の粒子である。多すぎたり少なすぎたりがある場合は、NS500をフラ​​ッシュPBSに希釈を調整したり、サンプルを再ロードします。
10. 標準モードの表に従ってキャプチャ時間を調整します。一般的に30から60秒は、適切なキャプチャ長（ 図4B）です。
11. 次のサンプルをロードするには、再ロード新しいサンプルその後、システムをフラッシュします。
12. かつてビデオがキャプチャされ、ビデオファイルを開くことによって、処理の段階に進みます。
13. 最高の（ 図4C）ビデオを処理するために調整することができるパラメータの数があります。目標は最高のようにそれぞれの粒子（ 図5）上の画面に赤い十字マークで示され、画面上の各粒子を捕捉するパラメータを選択することです。
14. より良い粒子を表示するには、画面のゲインを上げます。標準または高度モードでは、オートにClickInすることにより、パラメータを調整する]を選択グラム適切なボックス。自動設定が適切に、unclickボックスを粒子を選択し、手動でパラメータを指定します（ 図4C）を設定しない場合であって、
15. 一度、すべての粒子が画面上に拾われ、ビデオファイルを処理するためのソフトウェア（ 図4C）のプロセス]ボタンをクリックします。これは、粒度分布、大きさの平均値だけでなく、粒子濃度を提供しています。
16. 粒子濃度が正確であることを確実にするためには、2倍に希釈を増やすことにより、PBS希釈などを変更し、上記の手順を繰り返します。同じサンプルの複数の希釈液の測定は、試料の濃度測定が正確であることを確認することをお勧めします。測定のための適切な範囲は10 ^{7〜10 9}個/ mlである。
17. すべてのプラスミドは、ナノ粒子のゲル電気泳動を実行し、任意の遊離DNAが存在するかどうかを評価することにより、ナノ粒子に組み込まれていることを確認します。すべてではないプラスミドがカプセル化されている場合は、合計カプセル化プラスミドを定量化するために、DNAの吸光度を測定するための標準的な技術を使用しています。
18. 粒子当たりのプラスミドの平均数を計算するには、国税庁測定粒子濃度によってカプセル化された合計プラスミド濃度を分割します。プラスミドパーティクル単位のサンプルの分布を推定するためには、まず粒子の各1 nmのビンの体積分率を計算するために国税庁の粒度のヒストグラムを使用しています。各ビンにプラスミドの数を取得するために全プラスミド量によって、この体積分率分布を掛けます。各粒度のためのプラスミド当たりの粒子（ 図6）の数を取得するには、各ビン内の粒子の数でこれらの番号を割ります。

結果

図1は 、EGFPプラスミドとHRECsの成功したトランスフェクションの例の蛍光顕微鏡像を示す。明視野像は、細胞が通常の形態を維持することを保証するために役立ちます。さらに、このようなMTSまたは類似のアッセイとして細胞生存率アッセイは、ナノ粒子の毒性^7を評価するために使用することができます。フローサイトメトリーは、説明したように、トランスフェクション効率を定量化するために使用することができます。 HyperCytマルチウェルプレートアタッチメントを使用する場合、データは正しく井戸を識別するために、適切に処理する必要があります。 （ウェルあたりの細胞数千）の細胞数が正常である場合には、 図2の右側のパネルで見ることができ、流体が正しく動作しているように、個々の井戸は手動でもソフトウェアで選び出すのは容易である。細胞数が低すぎる、または流体に問題がある場合は、それは個々をを識別するためにはるかに困難になるUALのウェル（ 図2の左側のパネル）、および実験はおそらく繰り返される必要があります。 Hypercytのチュ...

ディスカッション

プロトコルは、上記のナノ粒子製剤のトランスフェクション効率だけでなく、ナノ粒子の粒径およびDNAロードを特徴付けるための方法を評価する方法について説明します。粒子あたりのプラスミド数は、粒子の有効性を予測するのを助けることができる重要なパラメータであり、また、線量測定のために使用することができます。ナノ粒子トラッキング解析は、塩濃度の異なるものなど、さまざまな水溶液の範囲で行うことができます。多くの場合、この特性は、生理食塩水を模倣するために、PBS中で実行されます。 PBSにサイジングするメディアまたは生理食塩水でのナノ粒子の大きさの良好な推定値を与えることができますが、血清の存在量は、ナノ粒子¹⁷の大きさと安定性に影響を与えることができる。したがって、血清中の種々の濃度の粒子特性評価だけでなく、特定のアプリケーションのために重要になることがあります。血清、additioで粒子を特徴づけるためにNALステップは血清蛋白質の高いバックグラウンド散乱に起因することをお勧めします。この場合、粒子は蛍光蛍光フィルタの使用により、粒子が特に血清タンパク質からはっきりと追跡できるように、タグを付ける必要があります。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
			試薬
リン酸塩は、1x（PBS）を緩衝生理食塩水	インビトロジェン	10010
EGM-2MV BulletKit	ロンザ	CC-3202
トリプシン	インビトロジェン	25300
酢酸ナトリウム緩衝液	シグマアルドリッチ	S7899	脱イオン水中で25mmまで薄める
ジメチルスルホキシド	シグマアルドリッチ	276855
pEGFPをDNA	エリムバイオ医薬品	NA
DsRedのDNA	Addgene	21718
PEIは、分岐した	シグマアルドリッチ	408727
CellTiter 96水性一	プロメガ	G3580
			材料
明確な平底96ウェルプレート、滅菌	ザルスタット	82.1581.001
明確な丸底96ウェルプレート、滅菌	ザルスタット	82.1582.001
12チャンネルのフィンピペット	サーモサイエンティフィック	NA	5から50と50から300μlを
蛍光顕微鏡	ツァイス	NA	モデル番号：AX10
C6 Accuriフローサイトメーター	BD Biosciences社	NA
HyperCytアタッチメント	Intellicyt	NA
NS500	Nanosight	NA