遺伝子送達研究のための同所膀胱癌モデル

サマリー

起源の臓器への癌細胞の移植は、新規治療法を評価するための有用な前臨床モデルとして役立つことができる。 MB49膀胱癌細胞は、膀胱内注入後の膀胱内に成長させることができる。このプロトコルは、腫瘍移植およびアデノウイルス引渡しのために、マウスの膀胱のカテーテル法を示しています。

要約

膀胱癌は尿生殖路、再発および進行が必要な削減することができ、新たな治療アプローチの第二の最も一般的な癌である。腫瘍微小環境が著しく腫瘍の発生および治療応答に影響を与えることができる。それは、それらが由来する器官に腫瘍細胞を増殖させることが望ましい場合が多い。このプロトコルは、MB49マウス膀胱癌細胞はカテーテル法を介して膀胱に点滴注入された膀胱癌の同所性モデルを記載している。このモデルで成功した腫瘍細胞移植は、物理的または化学的手段によって達成することができるグリコサミノグリカン、保護層の破壊を必要とする。我々のプロトコルでは、膀胱前細胞点滴をトリプシンで処理する。膀胱カテーテル法はまた、腫瘍が確立されれば治療薬を送達するために使用することができる。このプロトコルは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するアデノウイルス構築の送達を記載する。 O間ウルプロトコルは短期試験用に最適化遺伝子送達に焦点を当ててきた、マウスの膀胱カテーテル法の方法論は、幅広い用途を有する。

概要

膀胱癌は2012年¹で予想はほぼ75,000の新しい症例と15000人が死亡した尿生殖路の第二の最も一般的な癌である。再発率の高さは、膀胱癌治療する最も高価な癌の1になり、生涯のフォローアップを必要とする。筋層に侵入している膀胱がんは、リンパ系を経由して肝臓、肺や骨に転移することがあります。 5年後にのみ20から40まで%生存における進行した腫瘍の結果マルチモーダル療法。そのため、表在性膀胱癌の再発や進行を減らすだけでなく、高度な疾患を持つ患者の治療結果の向上を目的とした効果的な治療戦略が緊急に必要とされている。

新規治療薬の開発は初期のインビトロ評価以下の効果を評価する前臨床モデルを必要とします。腫瘍微小環境が大幅にpreclinicの必要性を強調しており、癌の発生と応答性に影響を与えることができる腫瘍が生じたからモデルは、起源の器官において確立することができる。一つのアプローチは、腫瘍が自然発生または器官特異的に誘導することが可能なトランスジェニックモデルの開発である。トランスジェニック膀胱癌モデルの優れたプロトコルは、最近²公表されている。トランスジェニックモデルの欠点は、腫瘍はゆっくりと所望未満の均一性で開発する傾向があることである。また、繁殖コロニーを維持するためのコストを考慮しなければならない。トランスジェニックモデルに代わるものは、市販のマウスにおける腫瘍の確立のための短い時間枠の利益を有する腫瘍細胞....

プロトコル

動物に関わるすべての手順は、検討されている、サウスカロライナ医科大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。プロトコルは、痛みのための米国農務省のカテゴリーDの下で承認されました。

1。細胞移植

1. 二日手順を実行する前に、T-25フラスコに1×10 ⁶個の細胞をプレートMB49。 （所望の場合、および抗生物質）を10％FBSを補充した高グルコースDMEMを使用する。 Oneフラスコを麻酔し、平行に移植されるまでの5匹のマウスの各群のために十分である。
2. 処置の日に、滅菌DMEM基礎培地（1:2希釈）で0.125％滅菌0.25％組織培養グレードのトリプシンを希釈することにより点滴トリプシンを調製する。 1.2mlを10匹のマウスには十分である。平衡に37℃の水浴中に置きます。
3. 加熱パッドを予熱し及びiを送達するために使用される麻酔システムのノーズコーンの下に配置するsoflurane。加熱パッドの上にきれいに吸収パッドを配置します。
4. 麻酔システムの誘導チャンバ内にマウスを置き、3％のイソフルランで麻酔を誘導する。マウスはつま先ピンチ反射の消失によって検証され、意識を失っているときに、ノーズコーンに転送。各動物は仰臥位であり、適切に体温を維持するために加温パッド上に配置されていることを確認してください。
5. 麻酔を維持するために、2％イソフルラン濃度を低下させる。

結果

血尿200,000 MB49細胞の移植後8日以内にほぼ全てのマウスにおいて観察される。 図1に示すように、34.7±3.3ミリグラムから倍以上、膀胱重量以上の（31-37 mgの範囲、n = 4）の非腫瘍87.5±19.2 mgの担持マウス（77から120 mgの範囲であり、n = 10）マウスのそれMB49細胞を移植されてきた。遺伝子送達の面では、マウスに24時間を撮像するウイルスの点滴注入は、48時間（ 図2）後よりも強いシグナルを生じることを見出した後。アデノウイルスの送達は、統計目的（ 図2および3）のためにグループサイズを計画する際に考慮されるべき動物の間で高度に可変である。小動物イメージングシステムが利用できない場合、ルシフェラーゼ導入遺伝子の発現を測定するための別のアプローチは、 インビトロ分析のために膀胱を除去し、均質化することである。 IVIS200小動物の体系を用いたin vivo解析との比較ステディ-グロキットを用いて、mおよびインビトロ.......

ディスカッション

このプロトコルで説明する主な方法は、細胞の点滴や膀胱上皮への局所送達のために意図されたいずれの薬剤のための広範なアプリケーションを持っていたマウスの膀胱のカテーテル法、である。上記で概説した具体的なプロトコルは、短期試験（〜10日）のために最適化されている。より高い細胞数が大きい腫瘍量、より急速な腫瘍増殖およびおそらく動物の損失をもたらすので、細胞の正確な数を注入して、重要である。点眼20万MB49細胞を使用することで、過度の腫瘍量に14日までに、動物の25％までの安楽死が必要な場合があります。我々の経験では、マウスに悪影響を12日以内に、腫瘍負荷の影響を受けません。このような無気力、貧しいグルーミング、および/または、このモデルでは食欲過剰な腫瘍量の減少などの標準的な基準に加えて排尿することができないことによって証明されている。

このプロトコルのための重要な考慮事項は、物流です。まず、MB49細胞はrapidlを育てる2日間、移植の前にYとメッキ百万の細胞を点滴注入の日に対数期において最適な文化を生み出す。実験に必要な動物の数は1日に移植することができる動物の数を超えると、MB4.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬名	会社	名 カタログ番号	コメント
6-8週齢の雌マウス	ジャクソン研究所	株名:C57BL/6J 品番:000664
トリプシン*	MediaTech	MT25-053-CI	Fisher
DMEM*	MediaTech	MT10-017-CV	Fisher
FBS	Hyclone	SH30071.03	Heat-inactivated
T25フラスコ*	Corning Costar	Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63 <	p>Fisher
MB49 cells	N/A	> <	p>Dr. Boehle から入手(参考文献11)
Puralube Vet Ointment*	Pharmaderm	ヘンリー・シャイン社 No.:036090-6050059 フィッシャー:NC9676869	フィッシャー から取得
脱毛クリーム:Veet	地元の薬局
潤滑剤: K-Y ゼリー	地元の薬局
カテーテル*	エクセルインターナショナル	エクセルインターナショナル No.:26751; Fisher: 14-841-21 <	p>Fisher
Isoflurane		Terrell NDC 66794-011-25	Obtained through Hospital pharmacy
1 ml slip tip TB syringes	Becton Dickinson	BD309659 Fisher:14-823-434
D-ルシフェリン	ゴールドバイオテクノロジー	L-123-1
Ad-CMV-Luc	VectorBiolabs	1000;in vivo 使用のための大規模増幅およびCsCl精製をリクエストします	BSL2封じ込めが必要な 感染性病原体
Steady-Glo ルシフェラーゼアッセイシステム	Promega	E2510 (10 ml)、E2520 (100 ml)、または E2550 (10 x 100 ml) <	p>
*複数のベンダーから入手可能
EQUIPMENT
麻酔システム	E-Z Systems, 安楽死菌株式会社	麻酔システム:EZ7000 5ポートマウス再呼吸装置:EZ109	Fisher
Xenogen IVIS 200	Caliper Life Sciences	http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm
FLUOstar Optima	BMGラボテック	http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2