長指伸筋の筋機能の評価エクスビボと前脛骨筋その場マウスの

サマリー

手足の筋肉の収縮とパッシブの機械的性質の変化は筋肉の疾患のための重要なバイオマーカーである。本稿では、ネズミ伸digitorum長指と前脛骨筋、これらの特性を測定するための生理的なアッセイを記載。

要約

身体の動きは、主に骨格筋の機械的機能によって提供されています。骨格筋は、筋肉内結合組織で覆われて筋繊維の多数の束で構成されています。それぞれの筋線維は、筋線維の長さに沿って長手方向に実行する多くの筋原繊維を含んでいます。筋原線維は、筋肉の収縮装置であり、それらはサルコメアとして知ら繰り返し収縮単位で構成されています。サルコメア単位は、Zディスクやタイチン蛋白質の間隔があけられるアクチンとミオシンフィラメントが含まれています。骨格筋の機械的機能は、筋肉の収縮と受動特性によって定義されます。収縮特性は、筋収縮、筋弛緩の力発生と時間の時に生成される力の量を特徴付けるために使用されています。筋収縮（例えば、アクチンとミオシンフィラメントの間の相互作用として、カルシウム、ATP / ADP比などの恒常性）に影響を与えるすべての要因は、収縮propeに影響を与えるrties。受動的な特性は収縮の非存在下での筋肉の弾性と粘性特性（剛性と粘度）を参照してください。これらのプロパティは、細胞外および細胞内の構造部品（例えばタイチンなど）と結合組織（主にコラーゲン^）1-2によって決定されます。収縮とパッシブ特性は筋機能の2切り離せない側面である。例えば、肘屈曲は上腕の後部コンパートメントの筋肉の上腕と受動的な伸張の前方コンパートメントの筋肉の収縮によって達成されます。本当に筋肉の機能を理解するために、両方の収縮とパッシブ特性を検討すべきである。

筋肉の収縮および/または受動機械的性質は、多くの場合、筋疾患で侵害されています。良い例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）、ジストロフィン欠損³によって引き起こされる疾患を無駄にして重度の筋肉です。ジストロフィンは細胞骨格proteですという点で、筋収縮中に⁴筋細胞膜（鞘）を安定させます。ジストロフィンが存在しない場合には、筋鞘は力伝達の間に生成せん断力によって損傷されています。引き裂くこの膜は、筋肉の細胞死と収縮機械の損失につながる連鎖反応を開始します。その結果、筋肉の力が低減されると死んで筋線維は線維組織⁵に置き換えられます。この後の変化は筋肉のこわばり^6が増加^します 。これらの変化の正確な測定は、疾患の進行を評価し、新規遺伝子/細胞/薬理学的介入の治療効果を決定するために重要な指針を提供しています。ここでは、長趾伸筋（EDL）と前脛骨筋（TA）の筋肉の収縮特性の収縮とパッシブの両方の機械的特性を評価するための2つの方法を提示します。

プロトコル

1。 EDLの筋肉を ex vivoでの収縮と受動特性の評価

EDLの筋肉の収縮とパッシブ特性は 、in vitro の筋肉テストシステムでオーロラ科学を用いてex vivoで測定されます。材料および装置については、 表1を参照してください。

1.1機器の準備

1. 水ジャケット組織浴にoxytubeを確保することにより、組織器官浴を組み立てます。筋肉実装装置に組み付け風呂を取り付けます。 oxytubeにガスラインを接続します。水ジャケット組織浴に水循環ラインを締めて、浴室の排水にニードルバルブを配置します。
2. 循環水槽の電源をオンにして、30℃で⁷に温度を調整します。 95％の5 PSI（ポンド毎平方インチ）O ₂ -5％CO _2は oxytube通って流れるようになります。リンゲルバッファーと一緒にお風呂を埋める。少なくともためのバッファを平衡oxytubeバルブを調整することで安定したガス流量で10分間。
3. （刺激、デュアルモードレバーシステム、及び信号インタフェース）機器の電源をオンにします。製造業者の指示に従って動的筋肉制御（DMC）のソフトウェアをロードします。

1.2 EDL筋肉解剖

すべての動物実験は、インスティテューショナルアニマルケアと使用委員会によって承認されなければならない。

1. 麻酔カクテル（材料のセクションを参照してください）​​2.5μlの/ g体重の腹腔内注射でマウスを麻酔。手術の手順では、鎮静の深さは、つま先のピンチを実行することによって確認した。麻酔下で動物を維持するために必要なときに初期の麻酔投与量の10％のサプリメントを投与されています。後肢を剃る。加熱パッドの上にマウスを置くことによって、解剖手順°Cの前に37℃で体内深部の温度を維持します。体温が常に直腸temperatを測定することにより監視されているサーマルプローブを使用していい、ラベル。
2. 解剖ボード（ 図1）の上にマウス仰臥位を置きます。後肢の筋肉を露出させるために脚の皮膚をはがします。 2洋裁ピン、薄筋の足で1と他のを使用してSYLGARDブロックに足を固定します。 37℃中核体温を維持するために、マウス本体上記ヒートランプを置き℃に常にリンゲルバッファーですべての筋肉を露出した表面かん流する。真空ラインを介して過剰なバッファをドレイン。
3. 遠位のTA腱と足に向かって皮膚を切開することによって実体顕微鏡下伸筋靭帯を公開します。優しく、TA筋肉を覆っている筋膜を除去します。遠位のTA腱を解放するために伸展靭帯を切った。
4. 遠TAの腱を切って、TAの筋肉を剥離し、それを使用しています。慎重にその近アタッチメントで、TA筋を取り除く。 TAの筋肉の血管系の破裂による出血を吸収するEDL筋肉の隣リンゲルバッファーに浸した綿の薄い部分を置き。過剰なバッファや血液を除去するために真空ラインを使用しています。
5. 遠EDL筋の筋腱接合（MTJ）（ 図2）でパン絹縫合糸を使用して、ループの結び目に続く二重の角結び目を結びます。近EDL筋肉を露出させるために大腿二頭筋の遠位部の切開を加えます。近EDL腱のMTJにおけるノット（ 図2）の同じセットを繰り返します。同じ縫合線を使用して二重の角結び目の近位または遠位ノットのどちらかにレバーアームフックを取り付けます。残りの縫合線を切り落とした。
6. 近縫合糸の結び目に優れた近EDLの腱を切った。フックでEDL筋肉を持ち上げ、筋肉の下に血管系を切った。後肢からEDL筋肉を削除する遠位縫合糸の結び目に劣る遠EDLの腱を切った。リンゲルバッファーに浸した綿の切れ端で露出した後肢をカバーしています。
7. レバーアームにフックを取り付けます。縦に筋の位置を合わせます二つの電極間。固定ポストから遠位縫合線を固定します。水没リンゲルバッファ内の筋肉に組織浴を持ち上げます。デュアル·ファイン/粗移動ステージを用いた1.0グラムの静止張力を調整し、筋肉は少なくとも10分間平衡化させます。

EDLの筋肉の収縮とパッシブ特性の測定1.3

以下の測定ごとにDMCのソフトウェアのパラメータを設定するには、 表2を使用します。動的筋分析（DMA）ソフトウェアを使用してデータを分析します。

EDLの筋肉の収縮特性の測定1.3.1

1. ⁸筋肉^を安定させるために離れて60秒で150 HzでのEDL筋肉を三回を刺激する。
2. 最適な長さ（LO）を決定するために異なる休憩緊張でEDL筋肉を刺激する。最適な長さは、筋肉が最大単収縮張力を開発した時の長さです。に筋肉を許可2分間リラックスしてください。
3. LOに静止張力を調整します。単一単収縮刺激で筋力を測定します。絶対収縮力（PT）、Ptのピークテンション（TPT）とハーフ緩和時間（半RT）までの時間を決定します。筋肉は2分間リラックスすることができます。
4. LOに静止張力を調整します。異なる刺激周波数（50、80、100、120、150、200 Hz）で生成された強縮性筋力を測定します。筋力が最大に達すると、絶対最大テタヌス筋力（Po）を決定します。 TPTとPo ⁹の½RTを測定します。
5. 筋肉が5分間リラックスすることができます。 LOに静止張力を調整します。サイクル間に2分間の残りとエキセントリック収縮の10サイクルを適用します。伸張性収縮の各サイクルの後にPoの相対的な力の損失を計算します。
6. 装置からEDL筋肉を切り離し、縫合部位での腱を切った。筋湿重量を決定し、筋肉の断面積（​​CSA）を計算する6,10。

EDL筋肉の受動的特性の測定1.3.2

1. 対側のEDL筋肉を解剖し、1.2節で説明したように装置に取り付けて、2から7を繰り返します。
2. 筋肉を10％Loの増分で160％Loに歪んでいる6つのステップストレッチングプロトコルに従うことを条件として、EDL筋肉を。応力-ひずみプロファイル^6を分析^します 。
3. 10パーセントローでストレッチや筋肉を保持した後、次の時間枠での応力緩和率（SRR）を測定することによって、EDL筋肉の粘性特性を評価：ピークから0.1秒後にピーク（pp）は、0.1から0.2秒に0.2〜0.5秒にPP、0.5〜1秒のPPにPP、1〜1.5秒頁へ
4. マウスを麻酔下にまだある間、研究終了時に、頚椎脱臼および/または断頭によりマウスを安楽死させる。装置からEDL筋肉を切り離し、縫合部位での腱を切った。筋湿重量を決定し、筋肉のクロス自体を計算ctional域^{（CSA）6,10。}

2。 その場のTA筋収縮特性の評価

TAの筋肉の収縮特性は 、in situ筋力テスト·システムでオーロラ科学を用いて測定される。材料および装置については、 表1を参照してください。

2.1装置の準備

1. 37に熱制御動物ステージを温める℃の循環水浴を使用しています。
2. （刺激、デュアルモードレバーシステム、及び信号インタフェース）機器の電源をオンにします。製造業者の指示に従って、DMCソフトウェアをロードします。

現場力の測定でのTA筋肉の2.2準備

1. マウスを麻酔し、後肢を剃ると1.2節で3のステップ1で説明したように、TAの筋肉を公開します。
2. 膝蓋骨靱帯USIの周りに二重平方結び目を作るngのパン絹縫合。遠位のTA筋肉のMTJ（ 図2）のループノット続く二重の角結び目を作る、同じ縫合線を使用して、遠位のTA腱結び目から〜10mmのループを残して別の二重平方結び目を作る。ループ側の第二平方結び目を置きます。
3. 後肢からピンを外して、動物が腹臥位。大腿二頭筋を公開します。坐骨神経を明らかにするために正中線で切開を行います。坐骨神経の近位端の周りに二重の角結び目を作る。縫合線の片側をトリミングして、結び目に優れた神経を切断。穏やかに、縫合線を用いた膝に向かって坐骨神経を引くとフリーに周囲の結合組織〜その長さの5ミリメートルをオフにします。この手順の中で神経を伸ばし、常にリンガバッファを持つ神経を表面かん流するしないでください。
4. 手順1〜3に記載のように反対側のTAの筋肉を準備します。 Riの一片で露光後肢の1をカバーngerのバッファは綿を浸した。常にあらかじめ温めておいた（37℃）リンゲルバッファーで両後肢を表面かん流する。真空ラインを介して過剰なバッファを削除します。
5. 動物のプラットフォーム上で発生しやすい動物を置きます。動物プラットフォームに膝クランプホルダーを取り付け、膝蓋骨靱帯縫合線を使用して二重の角ノットの金属端子に両膝を固定します。洋裁ピンを使用してSYLGARDブロックに両足をピン。熱制御されたステージの上に動物のプラットフォームを固定します。 37℃で動物中核体温を維持するためにヒートランプを置き
6. 動物プラットフォームに電極ホルダーを固定し、縫合線を使用して電極上に坐骨神経を築く。離れて後肢の筋肉から電極を保管してください。 MTJ素子縫合部位におけるむき出しの後肢の先端のTA腱を切った。レバーアームフックに遠位のTA腱縫合糸ループを取り付けます。暖かいリンゲルバッファーに浸した綿で露光後肢の筋肉をカバーしています。

2.3

1. DMCのソフトウェア内のパラメータを設定するには、 表2を使用します。 TAの筋肉の収縮特性を決定するために、第1.3.1項で説明したのと同じプロトコルに従ってください。 DMAソフトを使ってデータを分析します。
2. 収縮特性測定後、レベラーアームのフックから遠位のTA腱縫合糸ループを切り離す。 TAの筋肉を取り外します。筋湿重量を決定し、CSAの^10を計算^します 。
3. 上記の手順1〜3に従って、対TAの筋肉の収縮特性を測定します。試験終了時の制度上のガイドラインに従って、マウスを安楽死させる。

結果

次の結果は我々の以前の報告書^6,9から表現したものです。データは平均値の平均値±標準誤差として提示されている。 表3は、通常の BL10と年齢の4〜6ヵ月の時点でジストロフィン欠損（MDX）マウスでEDL筋の形態学的特性を示し、 図4は、代表的な収縮とパッシブプロパティを示していBL10とmdxマウスからEDL筋肉。 EDLの筋肉の収縮特性は、特定の（絶対CSAで割った力）収縮力（ 図4A）、特定の最大強縮力（ 図4B）、TPTと½絶対最大強縮力のRT含めて以下の用語で記述されます（ 図4CおよびD）。 TPTと½RTはまた絶対収縮力から計算することができます。応力-ひずみプロファイル（ 図4E）およびSRR（ 図4F）EDL筋肉の受動的性質を記述するために使用される再。

ジストロフィンの欠如は、EDL筋^6,9の収縮およびパッシブ特性に大きな影響を与えます。特定のけいれんとテタヌス力が著しくMDX EDL筋肉に削減されます。 ½RTはMDXのEDL筋肉で大幅に遅くなりながら、TPTはかなり速くなります。応力-ひずみプロファイルは、その剛性が大幅にMDX EDL筋肉に増加することを示唆している。ポストピーク応力がはるかに速く減少しながらMDX EDL筋はまた、ピーク応力に到達する前に大幅にはるかに高い抵抗力（受動的ストレス）が得られる。さらに、SRRはBL10のEDL筋肉に比べMDX EDL筋で有意に高かった。

統計分析

両群間で統計的有意性は、 スチューデントのt検定によって分析される。 sの複数のグループ間でtatistical意義は、ボンフェローニ続い一方向または双方向ANOVA分析事後解析は、SASソフトウェア（SASインスティチュート社、ケアリー、ノースカロライナ州）を使用してお勧めします。差はp <0.05で有意であるとみなしたときにされています。

表1の材料および機器。

実験	静止張力（グラム）	パルス周波数（Hz）	パルス幅（ms）	刺激の持続時間（ミリ秒）	ストレッチの長さ	ストレッチ持続時間（ミリ秒）	伸び率	注釈
1。 EDLの筋肉を ex vivoでの収縮および受動特性の評価
EDLの筋肉の収縮特性の測定1.3.1
1。暖める	1.0	150	0.2	300				各刺激の間に60秒間筋肉を休ませる。これらの予備テタヌス収縮はその後の測定のために筋肉を安定させます。
2。最適な筋長（LO）	0.5、1.0、1.5および2.0	1	0.2	300				筋肉は、それぞれの刺激の間に30秒間リラックスすることができます。デジタルノギスを用いて筋肉の最適な長さを測定します。
3。シングルTWItchの力（Pt）を	Loに静止張力を調整します	1	0.2	300
4。テタヌス筋力	Loに静止張力を調整します	50、80、100、120、150、200	0.2	300				筋肉は、それぞれの刺激の間に1分間リラックスすることができます。最大絶対テタヌス力（Po）を生成する頻度を決定します。
5。伸張性収縮	Loに静止張力を調整します	最大強縮力（Po）を生成する周波数を使用する	0.2	700	10％のロー	刺激の持続時間の最後の200ミリ	0.5ロー/秒	サイクル間に2分間の残りと10サイクルの伸張性収縮を繰り返します。
6。 EDL筋肉のCSA							CSA =（筋肉の質量（g）/ [1.06グラム/ cm 3で X（ローX 0.44）]。1.06グラム/ cm 3で、筋肉の密度であり、0.44は比率をLoにEDL筋線維の長さです。
EDL筋肉の受動的特性の測定1.3.2
1。プロトコルをストレッチ6つのステップ	Loに静止張力を調整します				10％のロー		2センチメートル/秒	160％ローに到達するまでLoは10％の増加とストレッチングプロトコルを繰り返します。ストレッチサイクル間ALOW 1.5秒。
2。 SRR	Loに静止張力を調整します				10％のロー		2センチメートル/秒	SSRはトンと応力の差で除して計算されIMEは、時間枠内の2つの時点の間の経過。
2.3 TAの筋肉の収縮特性を測定する
1。暖める	4.0	150	0.2	300				各刺激の間に60秒間筋肉を休ませる。
2。最適な筋長（LO）	3.0、4.0、5.0、6.0および7.0	1	0.2	300				筋肉は、それぞれの刺激の間に30秒間リラックスすることができます。デジタルノギスを用いて筋肉の最適な長さを測定します。
3。 TAの筋肉のCSA								CSA =（筋肉の質量（g）/ [1.06グラム/ cm 3で X（ローX 0.6）]。0.6 LoのRAへのTAの筋線維の長さです酸化チタン。

表2のEDLとTA筋肉の機械的特性の評価のためのパラメータ。

力む	年齢（月）	体重（g）	EDLの重量（mg）	EDL羅（㎜）	EDLは、CSA（mm 2）と
BL10	6	32.03±0.57	13.90±0.77	14.09±0.04	2.12±0.12
MDX	6	35.44±0.42 *	16.73±0.42 *	13.93±0.05 *	2.57±0.07 *

表3。 EDL筋の形態学的特性。*、 メリーランド州の値xのマウスは、年齢をマッチさせBL10マウスのそれとは大きく異なっている。

図1。カスタムメイドのマウス解剖用ボードの回路図を示します。解剖ボードは、½インチ厚いプレキシガラスからなされると制度ショップで製作された。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図2。 MTJ素子のループノット続く二重の角結び目を結ぶの手順を示すデジタル画像のシリーズ。アスタリスクEDLの筋肉、アロー、EDL筋の遠位腱。

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図3。 現場のTA筋機能アッセイでのカスタムメイドプラットフォームの模式図。プレキシガラス動物プラットフォームとステンレス膝ホルダーは現場マウス装置で 809Bにマウントするように設計された。*、ステンレス鋼棒（カタログ番号MPR-2.0 、Siskiyou、グランツパス、オレゴン）、＃、ユニバーサル電極ホルダー（カタログ番号MXB、Siskiyou、グランツパス、オレゴン）、§、電極取付ロッド（カタログ番号MPR-3.0、Siskiyou、グランツパス、オレゴン）; **シルガードブロック。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図4。 EDLの筋肉の収縮と受動特性のための代表的な結果。EDL筋の収縮特性 特定の単収縮力（）は、特定のテタヌス力（B）は、ピークテンション（C）は、半分緩和時間（D）への時間によって特徴付けられる。 EDL筋肉の受動的特性は、応力歪みプロファイル（E）とSSRによって評価されています。 *、mdxマウスは、年齢をマッチさせたBL10マウス著しく異なっている。

ディスカッション

このプロトコルでは、収縮および受動的性質のEDLの筋肉とTA筋の収縮特性を測定するための生理的なアッセイを説明しました。筋肉生理学研究における主要な関心事は、ターゲットの筋肉の酸素です。大きな筋肉（例えばTAの筋肉など）の場合は、 その場でのアプローチでリンゲルバッファからの酸素拡散がin vitroアッセイの筋肉の中心に到達しない可能性があるため好ましい。 現場のアプローチでは 、通常の血液供給と低酸素関連の邪魔にならない人工的な影響は避けられる。 EDLの筋肉は生理学の研究の中で最も一般的に使用される筋肉の一つです。筋肉全体の十分な酸素が ​​あるため、筋肉の小さなサイズのin vitro系で達成することができる。さらに、in vitro系でのイオンの濃度を操作するための密閉環境（のCa ^{2 +、Na +}とK ^+）を提供し、化学最適な筋肉の力発生のために必要されているCAL（ATPとグルコース）。これは力の生産上のこれらの変数の影響を検討する絶好の機会を提供しています。

手足の筋肉の収縮とパッシブ特性の正確な測定は、骨格筋の機能を研究することが重要です。これらのプロパティの特徴的な変化は、多くの場合、様々な筋疾患の特徴であるとみなされます。これらのパラメータの変化は、実験的治療が有効であるか否かを判断することも重要な指標です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
材料	メーカー		仕様とコメント
組織器官浴	Radnoti LLCは、カリフォルニア州、米国		水ジャケット組織浴（カタログ番号158351-LL）、酸素分散器チューブ（カタログ番号160192）、ルアーバルブ（カタログ番号120722）
循環水浴	フィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国
ガスミックス	Airgasの国立、シャーロット、NC、アメリカ合衆国		95％O 2および5％CO 2
in vitroでの筋機能アッセイ装置内	オーロラ·サイエンティフィック、オーロラ、ON、カナダ		システムは、刺激（モデル＃701A）、デュアルモードレバーシステム（モデル＃300Cまたは305C）、信号インターフェース（モデル＃604B）とテストAPで構成されていますparatus（モデル＃800A）が垂直に組織器官浴をマウントする
in vitroでの筋機能アッセイソフトウェアで			ダイナミック筋肉制御（DMC）のソフトウェアおよび動的筋力制御データ分析（DMA）ソフトウェア
0.9％のNaClで混合マウス麻酔カクテル	制度上のガイドラインを参照してください。		ケタミン（25 mg / ml）を、キシラジン（2.5 mg / ml）とアセプロマジン（0.5 mg / ml）を。手術の手順では、初回投与量の10％のサプリメントは、麻酔下で動物を維持するために必要であるかもしれません。
シルガード	ワールド·精密機器	猫＃SYLG184
カスタムメイドのプレキシガラスの解剖ボード	設計された家の中で		図1を参照してください
加熱灯	テンソルライティング社、米国マサチューセッツ州ボストン		解剖時にマウスを暖かく保つために15ワットのランプ
リンゲルバッファー	三井化学は、Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国から購入している		mMで組成：1.2のNaH 2 PO 4（カタログ番号S369）、1し、MgSO 4（カタログ番号M63）、4.83のKCl（カタログ番号P217）、137のNaCl（カタログ番号217）、24のNaHCO 3（カタログ番号S233）、2のCaCl 2（カタログ＃C79）、10グルコース（カタログ番号D16）。個々の化学物質を溶解し、上記の順に混ぜる。 4℃で保存する
ステレオ解剖顕微鏡	ニコン、メルヴィル、ニューヨーク州、米国
解剖ツール	ファイン科学ツール、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国		粗い鉗子、はさみ粗い、細かいピンセット（ストレートと45°の角度）
＃4から0まで編んだシルク縫合	SofSilk USSC蘇トゥーレス、ノーウォーク、コネチカット州、アメリカ合衆国	猫＃SP116
特注のステンレス製フック	小さなパーツ株式会社		2''力変換器305Cまたは2.5用の長いS / S 304V（0.18''直径）''トランスデューサ300Cのための長いS / S 304V（0.012''直径）（カタログ番号ASTM A313）
その場で筋機能アッセイ系	オーロラ·サイエンティフィック、オーロラ、ON、カナダ		システム（809B、 現場マウス装置では ）刺激（モデル＃701B）、デュアルモードレバーシステム（モデル＃305C）、信号インターフェース（モデル＃604A）と熱制御踏み板装置（モデル＃809Aで構成されてい）
in vitroでの筋機能アッセイソフトウェアで	オーロラ·サイエンティフィック、オーロラ、ON、カナダ		ダイナミック筋肉制御（DMC）のソフトウェアおよび動的筋力制御データ分析（DMA）ソフトウェア
カスタムメイドのTAアッセイ動物プラットフォーム	設計された家の中で		図2を参照してください
特注のステンレス製フック	小さなパーツ株式会社	猫＃ASTM A313	0.5インチロング、S / S 304V（0.18''直径）
カスタムメイド25G白金電極	Chalgren企業、ギルロイ、カリフォルニア州		2 24G電線に半田2 0.016''太い白金線