方法論記事

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

DOI：

10.3791/50193

⸱

2013年3月7日

 , 
1Division of Hematology-oncology, Department of Medicine, Medical University of South Carolina

この記事について

サマリー

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ドナー細胞の生着を​​決定することは、明確に定義された表現型マーカーを欠くマウス骨髄移植モデルにおける課題を提示する。私たちは、女性の移植レシピエントマウスに男性ドナー細胞の生着を​​定量化するための方法論を説明した。このメソッドは、HSCの機能の研究のためにすべてのマウス系統で使用することができます。

要約

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マウス骨髄移植モデルは、造血幹細胞（HSC）の機能および決定遺伝子/ HSCを調節する分子を測定する際の重要なツールを提供します。これらの移植モデルシステムでは、造血幹細胞の機能が生着し、再構成する致死量の放射線を照射したレシピエントマウスにこれらの細胞の能力によって決定されます。一般的には、ドナー細胞の寄与/生着は、フローサイトメトリーを用いたドナー特異的な細胞表面タンパク質に対する抗体によって測定されます。しかし、この方法は、大きく特異性とすべてのマウス系統では使用できない場合があり、受信者から発信された細胞からドナー由来細胞を区別するために、細胞表面マーカーの能力に依存します。市場では遺伝的に改変されたマウス系統の様々な背景を考えると、この細胞表面/フローサイトメトリーベースの方法は、特にジェニック受け手CEから独立したドナー細胞に明確に定義された表面マーカーを欠いているマウス系統に重大な制限がありますLLS。ここでは、移植レシピエントマウスにおけるドナー細胞の生着/寄与を決定するために、PCRベースの手法を報告した。私たちは、致死量の放射線を照射ジェニック雌マウスに男性ドナー骨髄の造血幹細胞を移植した。末梢血試料を異なる時点の移植後に採取した。骨髄サンプルは、実験の終了時に得られた。ゲノムDNAを単離し、Y染色体特異的遺伝子、Zfy1は、定量的リアルタイムPCRを用いて増幅した。女性レシピエントマウスにおける男性ドナー由来細胞の生着は、男性対女性のDNAの既知の割合で標準曲線に対して算出した。 BCL2は、総DNA量を正規化するために参照遺伝子として用いた。我々のデータは、このアプローチは確実にドナー細胞の生着を​​決定し、マウス骨髄移植モデルにおける造血細胞再構成を測定するのに有用な、まだ簡単な方法を提供することが示唆された。本手法は、日常的にほとんどの研究室で行うことができるため、ノーこのようなフローサイトメトリーなどの高価な機器が必要です。

概要

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マウス骨髄（BM）移植モデルは、1960年代に最初1で開発されました。このモデルは広範囲にホストレシピエントマウスにおけるドナーの造血幹細胞（HSC）の生物学の研究に用いられてきた。マウス骨髄移植モデルは、HSCの機能とその調節に関する貴重な知識を提供してくれましたし、HSCの研究に不可欠である。 C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1様C57BL/6J H2B-のBalb / C H2Dまたはジェニック移植モデルのような同種骨髄移植モデルでは、効果の、HSCの活性が2日に遺伝子機能を研究するために多くの研究室で使用されているそのような移植片対宿主病（GVHD）4などのHSC機能3または移植関連疾患に対する薬物治療。

そのようなMHCハプロタイプまたはCD45.1として細胞表面マーカーは、一般的に受信者から発信された細胞から区別するドナー由来細胞に使用されます。 C57BL/6J H2B、CD45.2 対 CD45.2またはH2B対を測定するフローサイトメトリーにより評価することができるので、p>は、BALB / C H2DとB6.SJL CD45.1は、骨髄移植で最も一般的に使用されるマウス株であるH2D。しかし、このようなFVB / NJ 5とC3Hのような他の多くの菌株もしばしば遺伝子組み換えトランスジェニックやノックアウトマウスを生成するために使用されます。これらのマウスは近交系に戻し交配および混合MHC /遺伝的背景で維持することができる。ドナー特異的細胞表面マーカーが使用できない場合があり、これらの例では、ドナー細胞の生着とHSC機能を決定することは難しいかもしれません。

性別不適合骨髄移植におけるサザンブロットによってドナー雄性細胞を検出するために、Y染色体特異的DNAプローブを用いて、前記第三輪博士のグループ6によって開発されました。その後、性決定領域YのためのリアルタイムPCRはmaを定量するため、正確かつ特異性の高い方法であることが判明した母体血システム7のLe胎児細胞。この概念は、ドナー細胞の生着8を決定するために、マウス骨髄移植モデルにおけるリアルタイムPCR法の開発のための博士シュワルツェンバーガーのグループが適応されました。我々はさらにFVB / NJマウス骨髄移植モデルのドナー細胞の生着を​​測定するためのこの方法を変更しました。このメソッドは、現在広くHSCの生物学におけるPIM1キナーゼの役割を研究するために我々のグループで利用されている。

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プロトコル

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1。骨髄細胞の単離

  1. 男性ドナーFVB / NJマウスや頸椎脱臼続いたCO 2の方法を使用して女性のFVB / NJマウスを安楽死させる。女性FVB / NJ骨髄細胞は、競争力のある細胞として使用されます。
  2. マウスからの大腿骨およびtibiaesをばらばらにすると5％の熱不活性化FBSを6 mlの氷冷した1640を含む60mmの組織培養皿に置き、小さなはさみや鉗子を使用しています。筋肉や他の組織を除去するためにキムワイプティッシュを使用しています。皿の中でそれぞれの骨軸の両端を切り落とした。
  3. 3 ccシリンジに23G針を用いて骨の端を接続し、皿に5％熱不活化FBSを含むRPMI1640で骨髄を洗い流す。同じ針を使用して繰り返し願望によって骨髄組織を分解。 15 ml遠心チューブに細胞懸濁液を移す。
  4. 400 xgで5分間細胞をスピンダウンし、上清を除去し、（155 mMの電話室温赤血球溶解バッファー1mlに細胞を再懸濁otassium重炭酸塩、10mMの塩化アンモニウム、EDTA = 7.4 PHの0.1 mM）および室温で5分間インキュベートし、次に5％熱不活性化FBSを含むRPMI 1640の5-10 mlを加える。
  5. セルストレーナーを通してセルを渡す。新しいチューブに通る流れを収集します。 400 x gで5分間スピンダウンします。上清を除去し、細胞ペレットは、任意の赤色を含むべきではありません。赤い色の不在は、赤血球を完全に除去することを示します。 5％熱不活化FBSを含むRPMI1640 10mlに細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液は完全に均一であることを確認するために静かに渦。アリコートを取り、血球計算盤で細胞数をカウント。骨髄移植と5:2の割合で女性のライバル細胞と分量に十分な細胞やミックス男性ドナー細胞に必要な細胞のどのくらいの体積を計算します。 2×10 6個で5におけるドナー細胞の最終濃度が1×10 6個 / mlと競合他社の細胞と400 XG、PBSで洗浄し、PBSに再懸濁し、5分間スピンダウン / mlである。

2。競争力のある骨髄移植

  1. 骨髄移植前に11Gy 4から6時間の単回投与における137Csのガンマ線放射体でメスのレシピエントマウス（生後8〜12週齢）を照射します。
  2. マウスの制止で照射雌マウスを置きます。それぞれのマウスは5×10 5ドナー細胞と2×10 5ライバル骨髄細胞を受信できるように総量0.1mlに尾静脈を介して混合ドナーと競合他社の細胞を注入します。

3。試料捕集

カップル·週間骨髄移植後に、麻酔条件下で眼窩出血によって女性レシピエントマウスから末梢血サンプル（〜50μl）を収集しています。サンプルは、EDTA被覆管に集められます。 BMのサンプルも記載前回と同じ手順（ステップ1）で、通常は少なくとも4ヶ月移植後、実験終了時に収集することができ、通常の20から40パーセント1脛骨骨髄細胞はDNAの十分な量を作るのに十分です。血液または骨髄サンプル年齢からマッチさせた正常雌と雄マウスも標準曲線を準備するために収集されます。

4。ゲノムDNAの単離

  1. 各血液サンプルを室温赤血球溶解バッファー（〜200μL）の4×ボリュームを追加します。よく混ぜ、室温で5分間静置します。 1mlのPBSを追加し、溶解したRBCの大部分を除去するスピンダウンします。
  2. 血液のDNA抽出キット（QIAmp DNAの血液抽出キット）を使用してDNAを単離する。 37℃でプレ暖かい溶出バッファー（AE）℃溶出したDNAの収量を向上させます。標準曲線のために男性と女性のDNAを同様に分離されています。
  3. （オプション）ゲノムDNAをさらに精製または3 M酢酸ナトリウム（pH = 5.5）の存在下でエタノール沈殿法を用いて濃縮することができる。 DNAペレットを直ちに分析のために40から50μlの蒸留水に再懸濁し、または将来の使用のために-20℃で保存されています。
  4. DNAのconcentrを測定ナノドロップND-1000スペクトル光度計とation。 OD 260/280 1.8から2.0の間の検体は、さらなる分析のために使用されています。
  5. 全量50μlで4ng/μlするDNAアーゼフリーH 2 Oを用いてDNAを希釈します。

5。標準曲線の準備

4 ng /μlにの濃度に男性DNAと女性のDNAを希釈し、Table1を記載のDNA混合物を作る

女性のバックグラウンドでの男性のDNAの％ 4ng/μl男性DNAの容量（μL） 4ng/μl女性のDNAの容量（μL） 総容量（μL）
0.2 1 499 500
0.5 1 199 200
2.5 5 195 200
12.5 25 175 200
50 100 100 200
87.5 175 25 200
100 200 0 200

標準曲線については、 表1。サンプル調製。 8 12wks歳の時に通常のオスとメスFVB / NJマウスを屠殺した。血液や骨髄細胞を採取した。オスとメスの細胞の細胞からDNAを単離し、そして4ng/μlの濃度で再懸濁した。雄と雌のDNAがDNA標準試料混合物を生成するために種々の割合で混合した。

6。リアルタイムPCR

  1. プライマー及びゲノムDNAをSYBR Green Supermixを試薬を混合することにより、PCR反応プレートを設定します。反応液量（20μL）は、各プライマーの400 nMおよび各反応における血液細胞のゲノムDNA（4ng/μlx5のμL= 20 ng）を5μlを含んでいます。 DNA SAMPレや基準は三重に設置された。プライマーの配列を表2に示す。
遺伝子名 フォワード 逆転
BCL2 5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG
Zfy1 5 TGGAGAGCCACAAGCTAACCA 5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC

ネズミBCL2とZfy1については、 表2のRT-PCRプライマー配列。

  1. 95℃で3分間、融解曲線が続く10秒間、95℃、58℃25秒、72℃15秒→42増幅サイクル：以下の条件をバイオラッドiQ5 PCR装置を用いてPCR反応を行うステップ。
  2. Bio-RadのiQ5 2.1 Standard Editionの光学系によってサイクル閾値（Ct）値を取得します。計算ΔCT（CT Zfy1 </ sup>の-CT BCL2）値、Zfy1発現レベルは2-δCtの値として計算されます。
  3. 既知のオス/メスの標準混合物から2-ΔCT読書を使用して、それぞれの反応シリーズの標準曲線を確立します。標準曲線は、線形回帰フィッティングとの混合物で知ら％男性DNAに三重の2ΔCT値の平均値をプロットすることによって生成されます。

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結果

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図1及び図2は、標準曲線の例は男性DNAの割合に対して2-ΔCTの平均値でプロットを示した。 図1Aは 、それぞれ78.5℃、88.5℃でローカライズBCL2とZfy1リコンのための特異的な融解温度を示した。 BCL2は、各PCR反応にロードされたDNAの総量を正規化するために参照遺伝子として使用されます。各標準サンプルのためBCL2増幅曲線は、（ログビュー）ロードされたDNA（ 図1B）の等しい量を示す、男性DNA濃度とは無関係お互いにマージします。しかし、Zfy1増幅曲線は、試料中の男性DNAの量が増加する（ 図1C）を左に移行しました。我々の手法を検証するために、我々は、異なる時点の移植後にWT 対ピムトリプルノックアウト（TKO）マウスから骨髄細胞移植を受けたマウスで男性ドナー細胞の生着をテストした。末梢血（6wks）とBMサンプル（16wks）wの両方 EREは分析した。ピム·TKOのマウスからのHSCは、致死量の放射線を照射したマウス（、...

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ディスカッション

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我々の現在の研究の目的は、観客に競争力のあるマウス骨髄移植モデルのドナー細胞の生着を​​定量化するためのPCRベースの技術を提供することにある。いくつかの研究は移植モデル9-10にドナー細胞を検出するためにRT-PCRを用いて報告されている。博士シュワルツェンバーガーのグループは、最初のY染色体に特異的な8を増幅するリアルタイムPCRを用いてマウス骨髄移植モデルを開発しました。この方法は、GLI-1のHSC活性が11の機能を研究するために使用された。我々は、さらにプロトコルを変更し、視覚化した形式で詳細なステップバイステップの実験プロトコルを提供しました。我々のプロトコルの可視化、プレゼンテーションは、観客が、簡単に我々のプロトコルに従うことができます。また、末梢血から骨髄サンプル対のDNAからゲノムDNAを用いて、我々のPCRの結果を比較した。 BMと血液サンプルからドナーの生着データは基本的に一貫している、しかし、通常、あまり変動は、BMのサンプルで発見された。これはおそらく血液サンプル中のゲノムDNAの純度/品質を損なう可能性があり、末梢血中のRBC溶解後の残留ヘモ...

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開示事項

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我々は、開示することなく競合する金融利害関係はありません。

謝辞

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我々は彼のリアルタイムPCR装置の使用のために博士チャールズグリーンバーグに感謝します。この作品は、MUSCホリングズがんセンタースタートアップファンド、ホリングズがんセンターACS IRG、ASCOのがん財団のキャリア開発賞を征服し、NIH 1K08HL 103780-01A1、およびNIH 3P30CA138313-01S3でサポートされています。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所（NIH）やその他の資金調達エージェントの公式見解を示すものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名称 会社 カタログ番号 コメント（オプション）
RPMI 1640 Hyclone社 SH30255.01
FBS インビトロジェン 16140-017 不活性化された熱
塩化アンモニウム MP Biomedicaals 194806
炭酸水素カリウムフィッシャー P184-500
QIAamp調製DNAは血液minikit キアゲン 51106
セルストレーナーバイオサイエンスのBD
IQ SYBR Green Supermixをバイオラッド 170-8882
iQ5リアルタイムPCR装置バイオラッド
スペクトル光度計ナノドロップND-1000 ND-1000

参考文献

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