カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離<sup&gt; 2 +</sup&gt;過渡と膜電流

サマリー

我々は、細胞内Caために使用することができ、ヒト心房筋細胞の単離を記載 ^{2 +測定。}

要約

パッチクランプ法と心臓細胞のCa ^{2 +}の処理異常の探査と心臓イオンチャネルの電気生理学的特性の研究では、孤立した心筋細胞を必要とします。さらに、これらの技術を用いて患者から心筋細胞を調査する可能性は、例えば心房細動（AF）などの心臓疾患の分子基盤を解明する貴重な要件である^。1は、ここでは両方に適しているヒト心房筋細胞の単離のための方法を記載パッチクランプ研究と細胞内Ca ^{2 +}濃度^の同時測定。まず、開胸手術を受けた患者から得られた右心耳は、小さな組織の塊（ "チャンク法"）に切断し^、+を含まない溶液のCa ²で洗浄されています。その後、組織の塊を20μMのCa ^{2 +}とソリューションを含むコラゲナーゼおよびプロテアーゼで消化されています。その後、隔離された筋細胞はハーヴです組織懸濁液の濾過と遠心分離によりSTED。最後に、セル記憶溶液中のCa ^{2 +}濃度を0.2mMの段階的に調整される。我々は簡単に⁺とCa ^{2 +}の分離の過程でバッファリングし、また活動電位と膜電流の代表的な録音を提供し、両方一緒に同時のCa ^{2 +}トランジェント測定、これらの孤立した筋細胞で行わでのCa ²の意味を議論する。

概要

パッチクランプ法と細胞のCa ²探査による心臓イオンチャネルの電気生理学的特性を研究⁺異常が孤立した心筋細胞を必要とする処理。これらは通常、消化酵素に対する心臓組織サンプルのインビトロ曝露（コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ペプチダーゼ等）後に得られる。 1955 ²で実行可能な心筋細胞の単離の最初の報告以降のプロトコルの多量は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモットおよびヒトを含む様々な種から単心房および心室の心筋細胞を収穫するために開発されている。このレビューでは、人間の心房筋細胞の分離に焦点を当てています。我々はワージントン生化学社、USA（が提供する"ワージントン組織解離ガイド"を参照して他の種からの心筋細胞を単離するための手順についてwww.tissuedissociation.com ）。

ヒト心房筋細胞の分離プロトコルは一般ブスタマンテらによって記載されている方法から派生しています^。3ここでは、するために以前に公表されたメソッドから構成されている技術は、のステップバイステップの説明を提供パッチクランプ実験のためだけでなく、同時に細胞内Ca ^{2 +}測定のためだけでなく、適切な心房筋細胞を得る^。4-11

プロトコル

実験プロトコルは、ローカル倫理委員会によって承認される必要があり、すべての患者は書面によるインフォームドコンセントを与える必要があります。我々の研究は、ハイデルベルク大学（＃2011-216N-MA）、医学部マンハイムの倫理委員会によって承認され、人類の福祉のためにすべての、制度的、国内および国際的なガイドラインに準拠して行った。すべての患者は書面によるインフォームドコンセントを与えた。

0。ヒト心房組織の取得

心肺バイパス移植のための心臓切開手術を受ける患者におけるルーチンカニュレーション手順の間、右心耳の先端部は、通常、除去され、心房心筋細胞の単離に使用することができる。筋細胞Cを防止、BDM、収縮抑制剤、切除後の組織サンプルは、2,3 -ブタンジオンモノオキシムを（ 表I含む滅菌のCa ^{2 +}を含まない輸送溶液を50ミリリットルファルコンチューブにすぐに転送されますontracture）。 30と45分の間の輸送時間で、我々は孤立した心房心筋細胞の数と質の両方に対する冷却または酸素化の明確な利点を認識しませんでした。研究室への一般的な輸送にはできるだけ迅速にする必要があります。長い輸送時間が避けられない場合は、酸素溶液中で4℃輸送℃で有利かもしれない。

1。 Prearrangements

1. ジャケット付ビーカー（ 表II）の温度を制御thermocirculator、スイッチオン。ビーカー内の温度が37℃に等しいことを確認してください全体の分離プロセス全体ビーカー内の温度を一定に維持するために、ガラス蓋付きビーカーをカバーしています。
2. 3ガラス製ビーカーにコラゲナーゼIおよびプロテアーゼXXIVを秤量し、室温で保管してください。酵素は、使用直前に希釈することができる。
3. のCa ² 20mlのを保存⁺ 4でペトリ皿に自由溶液℃の
4. のCa ²ストア250ミリリットル37℃の水浴中で⁺自由溶液℃に

2。ティッシュの清掃

1. ペトリ皿（〜直径10cm）に輸送ソリューションと一緒に組織サンプルを転送し、大体ハサミを使用して脂肪組織を削除します。
2. 組織試料を秤量する。 200〜600 mgの細胞単離のために使用される。残りの組織が保存生化学分析のために液体窒素中で凍結することができる。
3. 20ミリリットルのCa ^{2 +} 4で無料のソリューション°Cを含むペトリ皿に組織サンプルを転送し（ステップ1.3を参照）、約1mm ³サイズでの小さなチャンクに組織サンプルをチョップ。
4. 次の手順は、100％O _2、37℃で、連続処刑の下に実行されるべきである。ピペットチップは、強力な泡立ちを避けるために、連続した空気流を生成するために、酸素チューブに配置することができる。
5. 中のCa ^{2 +}を含まない溶液と一緒にティッシュの塊を転送ジャケットビーカーへと磁気攪拌棒で約3分間注意深くかき混ぜる。
6. 攪拌を停止し、組織の塊は数秒のために落ち着くことができます。ナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を通して上清を慎重にひずみ。メッシュから鉗子を使用してビーカーに拘束され、組織の塊を返します。
7. リフィルのCa ²ビーカー⁺送料液及び洗浄工程を2.4と2.5を2回繰り返す。

3。最初の酵素消化

1. コラゲナーゼやプロテアーゼを含んだ20ミリリットル酵素溶液E1（ 表I）で組織の塊を再停止し、10分間注意深くかき混ぜる。
2. 20μMのCa ^{2 +}の最終濃度を得るために、10のCaCl ₂溶液を40μLを加える。
3. 35分後には、組織の塊のほとんどがビーカーに残るような方法でナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を注意深く上清を負担。残りを返すメッシュからビーカーに組織塊を雨が降った。

4。第二酵素消化

1. 私はわずか20ミリリットル酵素溶液E2含むコラゲナーゼ（ 表I）で再び組織の塊を再懸濁します。 20μMのCa ^{2 +}の最終濃度を得るために、すぐに10のCaCl ₂溶液を40μLを加える。
2. 第二消化中さらに時折組織血栓をチョップするはさみを使用しています。
3. 5分後、細胞の解離をチェックするパスツールピペットを使用してサンプルを取る。棒状、横紋心筋が表示されるまで、この2〜3分ごとに繰り返します。
4. 攪拌を停止し、組織の塊が約20〜30秒間、落ち着くことができます。
5. 50ミリリットルファルコンチューブ（チューブ）にナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を注意深く上清を負担。メッシュからビーカーに拘束され、組織の塊を返します。
6. 20ミリリットルストラでビーカー内の組織チャンクを再懸濁さらにGE溶液（ 表^I）10とディスペンサーと20ミリリットル血清ピペットを用いて穏やかな機械的粉砕により細胞を解離する。気泡が細胞の生存と品質に有害であるので、気泡の形成を避けるようにしてください。
7. 50ミリリットルファルコンチューブ（チューブB）にナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を注意深く上清を負担。

5。決勝のCa ^{2 +}濃度の最終準備と調整

1. 10分間、95×gでファルコンチューブAとB（ステップ4.5および4.7を参照）の両方を遠心します。
2. 吸引により慎重に両方のチューブから上清を取り除きます。ペレットを乱さないようにしてください。上清を捨てる。
3. 1.5 mlのストレージソリューション（ 表I）各（室温）の両方でペレットを再懸濁する。
4. 2回ずつファルコン〜10のCaCl ₂溶液の7.5μLを加え、慎重にかき混ぜる。各ステップの後に10分間インキュベートする。
5. 0.2mMの最終のCa ^{2 +}濃度を得るために10のCaCl ₂溶液15μlのを追加します。

6。蛍光灯のCa ^{2 +}指示薬フルオ-3 AM（ 図1）と筋細胞のロード

1. 2 mlのマイクロ遠心チューブ（エッペンドルフチュー​​ブ）内に細胞懸濁液1.5mlの（チューブおよび/またはチューブB）に移す。
2. 次の手順は、蛍光のCa ^{2 +}インジケーターフルオ-3の光感度を考慮して実行する必要があります。
3. プルロニックF-127（ 表III）原 ​​液（20％無水DMSO中w / v）で取得するための44μlのフルオ-3の膜透過性のアセトキシメチルエステル誘導体（フルオ-3 AM、 表III）50μgのを溶かす1mMのフルオ3、最大で1週間、-20℃で保存することができる原液、AM。
4. 15μlのを追加フルオ-3は1.5の細胞懸濁液（ステップ6.1を参照）を振とうを含むマイクロチューブに原液AM慎重に。
5. 光学的に不透明なボックスで10分間細胞懸濁液をインキュベートする。
6. 簡単に言えば、約6,000 rpmで遠心。
7. 上清を捨て、1.5 mlの浴溶液（ 表IV）でペレットを再懸濁する。
8. 実験を開始する前に脱エステル化のために約30分間、細胞懸濁液にしておきます。

7。同時パッチクランプと落射蛍光Ca ^{2 +}の測定

パッチクランプ測定は、この見直しの主要な話題ではないので、我々はこの技術の深さの説明に多くを提供する他の出版物への興味を持った読者を参照してください^。11-14完全を期すために、我々は測定するためのプロトコルの簡単な要約を提供する活動電位またはL型Ca ^{2 +}電流は、同時のCa ^{2 +}過渡録音と一緒に両方。

実験中筋細胞を風呂solutiと37℃で灌流さ急速灌流システム（Octaflow IITM、ALA科学機器、NY）を用いて、（ 表IV）で。電圧クランプ実験のために、K ⁺電流を浴溶液に4 -アミノピリジン（5ミリモル/ L）及び_塩化バリウム（0.1ミリモル/ L）を添加することによってブロックされる。ホウケイ酸ガラス微小電極が使用され、ピペット溶液（ 表V）で満たされたときMΩ2-5の抵抗を傾けるしている必要があります。フルオ-3に加えて（ステップ6を参照）筋細胞のローディングAM、フルオ3はピペット溶液（ 表V）に含まれている。蛍光は488 nmで励起して放出された光は、（<520 nm）での[Ca ^{2 +]} _iは仮定に変換されます

ここで、k _Dフルオ-3（864のn =解離定数M）、F =フルオ-3蛍光;各実験の終了時に得られたF = _最大のCa ^{2 +} -飽和蛍光¹²の両方の電気信号及び落射蛍光のCa ^{2 +}信号が同時に記録される。活動電位は1.2倍しきい値強度の1ミリ秒電流パルスを使用して、現在のクランプモードで0.5 Hzで刺激される。 L型Ca ^{2 +}電流は、100ミリ秒に続いて、高速のNa ⁺電流を不活性化するために-40 mVまで-80 mVの、100ミリ秒ランプパルスの保持電位を用いた電圧クランプモードで測定されている0.5 Hzで+10 mVのにテストパルス。

結果

図2Aは、単離されたヒト右心房筋細胞から3つの代表的な例を示しています。我々はCellFinder顕微鏡スライド（上の細胞懸濁液（ステップ5.5）10μlのピペットで細胞収率定量化するhttp://www.antenna.nl/microlab/index-uk.htmlを ）。 16.5±3.1 cells/10液（nは= 29）対5.1±2.3 cells/10μL： 図2Bにおいて平均細胞の収量は明らかに慢性AF（CAF）が低いセルの利回りの傾向患者サンプル（チューブがあることを示すそれぞれSRとCAFで（N = 10）、P <0.05;チューブB：17.9±3.9 cells/10液（N = 29）対5.9±SRとCAFで2.0 cells/10液（N = 9）、それぞれに、p = 0.107）。

活動電位の測定および細胞質のCa ^{2 +}過渡電流の同時録画の代表例を図3に示されている。調べた細胞、Tの約90％で彼はアクション電位トリガのCa ^{2 +}放出が明確と通常細胞の収縮を引き起こす。既報の通り、細胞の整合性のために認められた指標である静止膜電位は、-73.9平均約±2.7 mVの（N = 10分の23筋/患者）及び-77.7±1.8 mVの（N = 8分の19筋/患者）SRとCAFであった（P> ^0.05）。15 図4は、電位依存性L型Ca ^{2 +}電流と細胞質のCa ^{2 +}トランジェントの代表、同時録画を示しています。非選択的β-アドレナリン受容体アゴニストイソプレナリン（1μM）の適用は、無傷のβ-アドレナリン作動性シグナル伝達カスケードを示唆し、私_はCa、Lと細胞質のCa両方の振幅^{2 +}トランジェントを向上させます。

Figure 1。筋のFluo-3のフローチャートは、（ステップ6.1から6.5を参照）プロトコルをロードしています。 M / V、質量/体積。

図2。ストレージソリューションの1時間後、単離されたヒト右心房筋細胞。Bは、ストレージソリューションのセル10μlに数え細胞収率の±SEM（ステップ5.5を参照）を意味します。 nは、各グループ内製剤の数を指す。 *はp <0.05。

アクション電位トリガのCa ²洞調律から心房筋細胞における⁺トランジェント（CAT）とCHRの図3。代表レコーディングプロピオン心房細動の患者。トップ：刺激（0.5ヘルツ）に使用注入電流膜（I _M）。下：膜電位（V _M）、およびトリガ猫（下）の同時記録。 （フォークトらの許可を得て再プロット^。2012）15

L型Ca ²上イソプレナリン（1μM）の効果図4代表的録音⁺現在のトリガ型のCa ²洞調律、慢性心房細動の患者からの心房筋細胞における⁺トランジェント（CAT）。トップ：電圧クランププロトコル（0.5 Hz）です。下：現在の総純膜の同時記録（I _M）、主にL型Ca ^{2 +}電流（中央）とトリガ猫（下）を反映している。 （フォークトから許可を得て再プロット、ら2012年^）15

表Iソリューション。

表II。特定の機器。

表III。フルオ-3と筋細胞のローディングのための物質がAM。

表IV。パッチクランプ用浴溶液。

パッチクランプ*表V.ピペット溶液。

ディスカッション

ここでは、心臓切開手術を受けた患者から得られた右心房付属器からのヒト心房筋細胞の単離のための方法が記載されている。細胞質のCa ²の測定のために、これらの心筋細胞を使用するために、我々は⁺貯蔵溶液からEGTAを省略して、以前に記載された方法^4-11に適合。

すでに1970年には筋細胞が⁺消化中のCa ²の存在下で解離しているが、それらのすべては、したがって拘縮および非生存^。16,17にあったことが観察された、細胞単離のCa ^{2 +}を含まない溶液中で行われる。しかし、のCa ²の生理的濃度の再導入は急速⁺ Ca ^{2 +}の流入および細胞死をもたらした。これは、もともとはジマーマンとフルスマンによって灌流心の中で観察されたCa ^{2 +}のパラドックス現象として記載されている。7.0のpHの低下、など、分離培地の¹⁸修正<²²のCa ^{2 +}パラドックスを防止するために提案されているストレージを含む溶液EGTAで> 19タウリン²⁰又はCa ^{2 +}少量の添加（ステップ3.2および4.1を参照のこと^）、21ならびに単離された筋細胞の記憶（商標^）17は、しかし、のCa ^{2 +が} EGTAを介してバッファリングのCa ^{2 +}過渡二相崩壊におけるL型Ca ^{2 +}電流誘起のCa ^{2 +}過渡振幅および結果の振幅を減少させることは周知である^。23そこで、EGTAを省略典型的なプロパティと相性減衰でのCa ^{2 +}トランジェントを得るために全体の分離プロセス全体。のCa ²から細胞を保護するために⁺パラドックス我々は、0.2 mMのまで段階的にストレージソリューションの最終のCa ^{2 +}濃度を増加させた。

コラゲナーゼの選択は、おそらく成功した筋細胞分離のための最も重要なステップです。従来のコルagenasesはクロストリジウムヒストリチカムから得られた粗製の製剤であり、他のプロテイナーゼ、polysaccharidasesとリパーゼの数に加えて、コラゲナーゼを含んでいます。彼らの一般組成のコラゲナーゼに基づいて、異なるタイプに細分化されます²⁴ワージントンコラゲナーゼ·タイプIとIIが正常に我々の現在記述されたプロトコルでは、人間の心房筋細胞を単離する^{。4-10,15,25-30}ために使用されてきた私たちは、コラゲナーゼの使用をお勧めします我々はまた、コラゲナーゼタイプIIを使用して生細胞の許容量を得ることができたものの、Iを入力します。しかしながら、単一のコラゲナーゼタイプ内の酵素活動に関する重要なバッチ間変動がある。これらのバリエーションは、慎重なバッチの選択と分離手順を最適化するための様々なバッチのテストが必要。ワージントン生化学株式会社（からオンラインで利用可能なバッチ·選択ツールhttp://www.worthington-biochem.com / CLS / match.php）は、ヒト心房筋細胞を単離するのに適していることが示された組成物で使用可能なバッチを見つけるために使用することができる。現在、我々は、コラゲナーゼは、250 U / mgのコラゲナーゼ活性を345 U / mgでcaseinase活動、2.16 U / mgのクロストリパイン活性および0.48 U / mgのトリプシン活性（ロット＃49H11338）Iを入力してください。

本稿に記載された手順を用いて得られた細胞をパッチクランプ研究のCa ^{2 +}トランジェント測定およびまた両方図¹⁵の組合せに対して8時間以内に使用することができ、これらの細胞は電場刺激に応答して細胞の収縮の測定を可能パッチクランプピペットを（未発表の観察）を使用して、または電気刺激。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
			輸送溶液
アルブミン	Sigma-Aldrich	A3059	保存溶液: 1%
BDM	Sigma-Aldrich	31550	輸送溶液: 30
DL-β-ヒドロキシ酪酸	Sigma-Aldrich	H6501	保存溶液: 10
グルコース	Sigma-Aldrich	G8270	輸送溶液: 20 Ca2+不含溶液: 20 酵素溶液E1およびE2: 20 保存溶液: 10
L-グルタミン酸	Sigma-Aldrich	G1251	保存溶液: 70
塩化カリウム	Merck	1049360250	輸送溶液: 10 $\text{Ca}^{2+}$不含溶液: 10 酵素溶液E1およびE2: 10 保存溶液: 20
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	輸送溶液: 1.2 Ca2+不含溶液: 1.2 酵素溶液E1およびE2: 1.2 保存溶液: 10
MgSO4	Sigma-Aldrich	M9397	輸送溶液: 5 Ca2+除去溶液: 5 酵素溶液E1およびE2: 5
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254	輸送溶液: 5 Ca2+不含溶液: 5 酵素溶液E1およびE2: 5
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	輸送溶液: 100 Ca2+不含溶液: 100 酵素溶液E1およびE2: 100
タウリン	Sigma-Aldrich	86330	輸送溶液: 50 $\text{Ca}^{2+}$不含溶液: 50 酵素溶液E1およびE2: 50 保存液: 10
コラゲナーゼ I	Worthington	4196	酵素溶液E1およびE2286 U/ml
プロテアーゼXXIV	Sigma-Aldrich	P8038	酵素溶液E1およびE25 U/ml*
pH			輸送溶液: 7.00 Ca2+不含溶液: 7.00 酵素溶液E1およびE2: 7.00 保存溶液: 7.40
で調整した			輸送溶液1 M NaOH $\text{Ca}^{2+}$不含溶液1 M NaOH 酵素溶液E1およびE21 M NaOH 保存液1 M KOH
特に断りのない限り、濃度はmMで表記。BDM：2,3-ブタンジオンモノオキシム。*Protease XXIVはEnzyme solution E1にのみ含まれている。
表I. 溶液。
ナイロンメッシュ (200 μm)	VWR-Germany	510-9527
ジャケット付き反応ビーカー	VWR	KT317000-0050
表II. 特定装置
ジメチルスルホキシド	Sigma-Aldrich	D2650
Fluo-3 AM（特別パッケージ）	Invitrogen	F-1242
プルロニック F-127	Invitrogen	P6867
表III. 心筋細胞へのFluo-3 AMローディングに使用する試薬
4-アミノピリジン	Sigma-Aldrich	A78403	バス溶液: 5
塩化バリウム	Sigma-Aldrich	342920	バス溶液: 0.1
CaCl2 × 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080	バス溶液: 2
グルコース	Sigma-Aldrich	G8270	バス溶液: 10
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	バス溶液: 10
KCl	Merck	1049360250	バス溶液: 4
MgCl₂ × 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250	バス溶液: 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	バス溶液: 140
プロベネシド	Sigma-Aldrich	P8761	バス溶液: 2
pH			バス溶液: 7.35
〜で調整した			バス溶液1 M HCl
表IV. パッチクランプ用バス溶液 *4-アミノピリジンおよびBaClは、ボルテージクランプ実験にのみ使用した。
DL-アスパラギン酸カリウム塩	Sigma-Aldrich	A2025	溶液をピペットで分注する: 92
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	溶液をピペットで分注する: 0.02
GTP-Tris	Sigma-Aldrich	G9002	溶液をピペットで分注する: 0.1
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	溶液をピペットで分注する: 10
塩化カリウム	Merck	1049360250	溶液をピペットで分注する: 48
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	溶液をピペットで分注する: 1
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	溶液をピペッティングする: 4
Fluo-3	Invitrogen	F3715	溶液をピペットで分注する: 0.1
pH			7.20
～で調整した			1 M KOH
表V. パッチクランプ用ピペット溶液*。 *実験当日は、ピペット溶液は使用直前まで氷上で保存する。**実験当日は、1 mMストック溶液からFluo-3を添加する。