管細胞の収集培養初代ラットインナー髄

サマリー

アルギニン·バソプレシン（AVP）は腎校長細胞による水の再吸収を促進を通じて体内の水分の恒常性の微調整を制御します。ここでは、AVP-媒介水再吸収の根底にある分子機構の解明に適した管細胞を集め初代ラット内側の延髄の栽培のためのプロトコルを提示します。

要約

アルギニン·バソプレシン（AVP）はダクト校長細胞とそれによって微調整の体水分ホメオスタシスを集めることにより、水腎再吸収を促進します。 AVPは、細胞の表面上バソプレシンV2受容体（V2R）に結合し、それによって、cAMPの合成を誘導する。これは、水路アクアポリン2（AQP2）のリン酸化の変化をもたらす細胞内シグナル伝達プロセスを刺激する。プロテインキナーゼは、AQP2をphoshorylates、それによって主要な尿からの水の再吸収を促進する形質膜に細胞内の小胞からAQP2の転座をトリガします。主要細胞内の下垂体またはAVP-活性化シグナリングからAVP放出の収差はそれぞれ、中央または腎性尿崩症を引き起こす可能性があり、血中血漿AVPレベルは、慢性心不全および抗利尿ホルモン不適合分泌症候群などの心血管疾患に関連付けられています。

ここでは、cultivati​​ためのプロトコルを提示する急行V2RとAQP2内因ダクト（IMCD）細胞を収集初代ラット内側の延髄の上。細胞は、AQP2の制御の根底にある分子メカニズムを解明するのに適しているので、AVP媒介性の水再吸収の調節不全に関連する疾患の治療のための新規薬剤標的を発見する。 IMCDネズミ腎細胞は、内側髄質から得られ、六から八日播種後の実験のために使用される。 IMCD細胞は規則的な細胞培養ディッシュ、フラスコ、異なる形式のマイクロタイタープレートで培養することができ、手順は数時間を必要とし、標準的な細胞培養実験室に適している。

概要

腎集合管主な細胞では、アルギニン·バソプレシン（AVP）は、原形質膜への水チャネルアクアポリン2（AQP2）の挿入を刺激による水再吸収を制御します。 AVPは、アデニリルシクラーゼことにより、cAMP形成を刺激するGタンパク質共役型バソプレッシン-2受容体（V2R）に結合する。このシグナリングカスケードの開始は、プロテインキナーゼA（PKA）の活性化をもたらす。 PKAは、原形質膜への細胞内小胞からの再分配のための重要なトリガーである、256（S256）セリンでAQP2をリン酸化する。膜挿入は、浸透勾配に沿って水の再吸収と微調整の体内の水分の恒常性を容易にします。

原因AVP分泌またはAVP-活性化シグナリング原因かの収差AVP媒介水再吸収の調節不全は、深刻な病気に関連付けられています。 V2RまたはAQP2の突然変異によって引き起こさ減少水の再吸収はELEVのに対し、腎性尿崩症につながるated血漿AVPレベルは、慢性心不全および不適切な抗利尿ホルモンの分泌（SIADH）の症候群などの心血管疾患の過度の水再吸収に関連付けられています。

AVP媒介水再吸収の重要性だけではなく、病気でその意義に由来する。 AQP2有利子に小胞と形質膜と融合のAVP-誘発転座は、現在十分に理解されていない厳密にcAMP依存性エキソサイトーシス過程を表します。 cAMP依存性エキソサイトーシスのための他の例としては、腎臓とHにおけるレニン分泌⁺胃の中に分泌されています。したがって、腎主要細胞内AQP2-転座を支配する分子メカニズムの解明だけでなく、他の細胞型で同様の分子プロセスを理解するのに役立つだけでなく、AVP-媒介水再吸収の障害に関連する疾患の治療のための新しい治療法に道を開くことが。

EAQP2を制御lucidatingメカニズムは、集合管主な細胞モデルを必要とします。このため、異なる哺乳類の腎臓細胞株の数が用意されています。しかしながら、これらのモデルはいくつかの欠点を有する。多くの細胞系におけるAQP2のタンパク質レベルが低い（ 表1; MDCK ^{M1、HEK293、COS-7、、LLC-PK1）1-10、}異所性に過剰発現する他の人間^{（MCD4、WT10）11,12}またはラット（CD8） ¹³ AQP2。 MCD4およびCOS-7細胞ではV2受容体が発現していない。我々の知る限りそこ腎髄質内層集合管、AQP2式が最も豊富である腎臓のその部分から派生して利用できるモデルなど恒久的な細胞株はありませんが、皮質集合管^1,11,13-16から。このような細胞モデルは、広く使われている例不死mpkCCD（ 例えば ^17）、または最近設立mTERT-CCD ¹⁴細胞株のためのものです。両方の細胞株内因的に発現AQP2とV2Rが、それらは由来しているので皮質集合ダクトは、最も可能性の高いダクト（IMCD）細胞を収集し、内側延髄に比べ異なるプロテオームが含まれています。彼らは、例えば別のNaを表現しなければならない⁺交通システム。

ここでは、V2RとAQP2内因を表現文化プライマリーIMCD細胞にプロトコルを提示します。このモデルは、したがって、最も近い腎集ダクト内の生理学的状況を示す。文化を確立したように、標準実験装置他の研究室は、簡単にこのアプローチを採用することができます必要があります。

プロトコル

1。準備

1. 培養皿の準備
   1. 4で解凍コラーゲンタイプIV O / N°C、0.1％滅菌酢酸に溶かし。使用するボリュームは、細胞が播種されるようにされている料理の種類や数によって異なります。 2μgの個/ cm ^2を使用します。
   2. 室温で1時間、少なくとも料理をインキュベートし、蒸留水（A. tridest）で2回洗浄する。
   3. 料理は適切に乾燥させます。
2. 媒体の補充
   1. 、500mlの培地に1.75グラムのブドウ糖を追加することで、最大4.5グラム/ Lに血糖値を上げます。培地600ミリオスモルへを調整するには、それぞれ、200ミリオスモルと100ミリオスモルによって浸透圧を高めるために、100mMのNaClと100mMの尿素を加える。
   2. 600ミリオスモルDMEM培地に1％非必須アミノ酸、1％ultroser、500μMの非添加、20 U / mlのナイスタチン及び0.25μgの/ mlのゲンタマイシン（50μgの/ mlの濃度とストック溶液の1:200希釈）を追加新たに準備の日に。
3. 酵素溶液
   1. DPBS含有0.25μgの/ mlのゲンタマイシンおよびナイスタチンに1 mg / mlのヒアルロニダーゼおよび2.2 mg / mlのコラゲナーゼを追加します。 2腎臓内部の髄質の消化のため、この酵素溶液1mlを準備します。溶液を濾過滅菌しなければならず、50ミリリットルファルコンチューブに格納されている。

2。ダクト（IMCD）細胞を回収初代ラットインナー髄の栽培

すべての動物の取り扱い手順は、ローカルおよび連邦法に準拠して行わなければならない。

1. CO ₂のラット（CO ₂で飽和ボックスで）またはイソフルラン（; 2から2.5パーセントイソフルランとエアーフロー350〜400ミリリットル/分のU-400麻酔ユニット、Univentor株式会社、マルタ）Anaesthetize。白っぽい内側と外側の暗い髄質の境界の正確な検出を可能出血のために動物の首を刈る。また、出血が孤立し、赤血球の数を最小限に抑えることができます。腎臓を取り出し、氷の上で（上記参照）ゲンタマイシンおよびナイスタチンを補っ滅菌DPBSでそれらを洗ってください。すべてのさらなるステップは、滅菌クリーンベンチの条件下で実施されるべきである。
2. 過剰な液体を除去する滅菌湿布にDPBS溶液から腎臓を転送します。滅菌ピンセットとハサミで脂肪腎臓カプセルを取り外します。
3. 腎臓はまだ圧縮で固定された、外側（皮質）側の縦軸横に少しカット。完全にカットスルーするのが、腎盂に接続し、一枚でそれを残していないことを確認してください。
4. 湾曲したハサミで丁寧にロゼきらめくアウター髄質に囲まれている白っぽい内側の髄質を解剖。氷の上を60mm培養皿にゲンタマイシンおよびナイスタチンを含む、DPBSでそれらを収集します。
5. すべて髄質たら氷の上に分離し、収集され、それらは単にバッファで覆われているレベルにDPBSの量を減らす。 5のキューブに髄質をカットする滅菌カミソリの刃を使用して、ミリメートル^3。
6. 炎に簡単にそれを保持することによって溶融、滅菌パスツールピペットの鋭い端を丸める。ピペットは、続行する前に冷却されていることを確認します。
7. 丸みを帯びたパスツールピペットを用いて、ヒアルロニダーゼおよびコラゲナーゼ（1.3.1を参照）を用いて新たに調製滅菌酵素溶液を含有する50ミリリットルファルコンチューブに組織懸濁液を移す。しっかりと蓋を閉め、37℃で1.5のための定期的な卓上水浴中で連続攪拌（220回転）の下でインキュベート - 2時間。
8. サスペンションを均一混濁になるまで、懸濁液の粉砕のために、ラウンドパスツールピペット（上記参照）と、上下に数回混合物をピペット。
9. 300 xgで5分間16℃の懸濁液を遠心上清を捨て、再びゲンタマイシンおよびナイスタチンと遠心分離機を含む、DPBSで徹底的にペレットを再懸濁します。一度この洗浄工程を繰り返します。
10. 完全培地と種子、それらをCで細胞を再懸濁しulture料理および/またはマイクロタイターウェルプレート。 2髄質（1動物）の調製は、1を60mm培養皿に十分な細胞が得られます。
11. 24時間後、600ミリオスモルDMEMで細胞を2回洗浄し、新鮮な培地を追加します。来週中に、細胞を2〜3回（ 図1）を洗浄する必要があります。 6-8日播種後、IMCD細胞を実験に使用することができる。実験を開始する前に、24時間非添加およびナイスタチンを含まない培地でそれらをインキュベートすることを忘れないでください。そうでなければAQP2は形質膜に排他的に配置される。

結果

初代ラットIMCD細胞の正常な栽培は6-8日播種後コンフルエントな単層（ 図2）になります。 60ミリメートル培養皿あたり約6×10 ^6個の細胞があります。これらはIV型コラーゲン、基底膜成分を¹⁸でコーティングしたような細胞がしっかりと、培養皿に付着する。したがって、IMCD細胞はいくつかの徹底した洗浄手順の中でも切り離すことはありません。最大培養細胞の80％は、内因V2RとAQP2を表明。 AQP2を欠いた細胞がインターカレート細胞、ヘンレ、直細血管または内側髄質間質細胞のループの細い手足由来非IMCD細胞と考えられているのに対し、これらは、主要な細胞である。我々は先に示したように、600ミリオスモルの培地浸透圧はAQP2 ¹⁹のダウンレギュレーションを防ぎます。また、AQP2発現は膜透過性のcAMPアナログ非添加で媒体を補充することによって維持される。 AQP2プラズマMEMBを低減するために、RANE表現したがって、その細胞内局在IMCD細胞を支持するためには、実験前に非添加約24時間せずに維持する必要があります。 AQP2のほと...

ディスカッション

私たちは、初代ラットIMCD細胞の調製と培養するための詳細なプロトコルを提示します。アプローチでは、1匹のラット²⁰から細胞21 cm ^2とまで得られます。実験は、標準的な細胞培養装置を必要とし、約6時間以内に一人で行うことができる。したがって、このアプローチは、標準的な実験方法として好適である。

初代ラットIMCD細胞を96ウェルプレートから60ミリメートルの料理に至るまで、サイズの異なる培養皿に播種することができます。しかし、384ウェルフォーマットでの成長のための手順は、最適化が必要。私たちは、成長が減速を60 mm以上の皿を使用しないでください。細胞は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、DNA / RNA分離、免疫蛍光顕微鏡、のCa ^{2 +}イメージングと電気生理学^10,22,23などの様々な実験に適しています。

播種後約6〜8日には、主IMCD細胞がconflに栽培されているuent単分子層（ 図2）。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コラーゲンIV型マウス	バイオサイエンス	356233
ヒアルロニダーゼ	SIGMA	H6254
コラゲナーゼCLS-II型	Biochrom AG	C2-22
DMEM + GlutMAX	Invitrogen GIBCO	21885108
Nystatin	SIGMA	N4014
Ultroser G	Cytogen	15950-017
非必須アミノ酸(NEA)	Biochrom AG	K0293
Gentamicin	Invitrogen GIBCO	15710
DBcAMP	BIOLOG	D009

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